小麥脫水素wzy1-2基因的遺傳轉(zhuǎn)化及干旱脅迫下不同生育期表達(dá)水平

田 野，于正陽，史學(xué)英，齊玉紅，張大鵬，張林生

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

干旱是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要環(huán)境因素，我國干旱、半干旱地區(qū)面積約占全國土地面積的50%，主要分布于西北地區(qū)。小麥?zhǔn)侵饕Z食作物之一，干旱造成10%～20%的作物減產(chǎn)。研究小麥的抗旱機(jī)理對糧食增產(chǎn)具有重要意義[1]。目前人們在小麥抗逆研究領(lǐng)域做了大量工作，但由于小麥基因組非常龐大，對于逆境脅迫響應(yīng)的分子生理機(jī)制仍然不清。揭示小麥耐逆境脅迫的分子機(jī)制和改良小麥抗逆性已經(jīng)成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)研究的主要目標(biāo)之一[2]。

研究表明，胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(LEA)是植物在非生物脅迫過程中防御逆境的重要功能蛋白之一，在減少環(huán)境脅迫對自身傷害中起到重要作用[3]。脫水素是胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白第二家族蛋白，通常以無規(guī)則卷曲形態(tài)存在，這種形態(tài)是高度水合狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞失水時(shí)，其構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，從而行使多種功能[4]。脫水素屬于熱穩(wěn)定的水溶性蛋白，它受寒冷、高溫、干旱以及鹽脅迫等逆境誘導(dǎo)，對保護(hù)生物代謝可能起到分子伴侶的作用，對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起保護(hù)作用，從而減輕干旱對植物造成的傷害。近年來研究逆境脅迫(低溫、干旱和高鹽等)下，部分脫水素的表達(dá)還受到脫落酸(ABA)的誘導(dǎo)作為功能蛋白大量表達(dá)[5]。脫水素一般包含有Y((V/T)D(E/Q)YGNP)、S(5～7個(gè)Ser殘基)和K(EKKGIMDKIKEKLPG)3個(gè)保守的氨基酸片段，而K片段是脫水素所共有的。按照脫水素Y、S、K保守區(qū)片段的組合及排列順序，將其分為5個(gè)亞類：YnSKn、YnKn、SKn、KnS和Kn[6]。

為研究wzy1-2基因的抗旱功能及建立完整的轉(zhuǎn)基因體系，本試驗(yàn)通過基因槍介導(dǎo)法[7]，將wzy1-2干擾載體轉(zhuǎn)入鄭引1號小麥中，獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。通過研究干旱脅迫處理下小麥WZY1-2蛋白的表達(dá)量，分析該基因在小麥不同生育期的表達(dá)規(guī)律，探索脫水素wzy1-2基因在植物抗旱方面的功能，為篩選抗旱小麥品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種鄭引1號和陜合6號由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

大腸桿菌JM109、干擾表達(dá)載體pTCK303由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存；pMD18-T載體和DNA Marker均購自Takara公司；凝膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化技術(shù)(北京)有限公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；序列測定由華大基因(深圳)科技有限公司完成。

1.2 構(gòu)建載體及鑒定

取10 μg使用Trizol試劑提取的葉片總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄[8]，并將擴(kuò)增的cDNA片段克隆到pMD18-T載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli，篩選具有氨芐抗性的克隆，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定重組質(zhì)粒并測序。將pMD18-T-正向片段和pMD18-T-反向片段，分別通過SacⅠ/ SpeⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ限制性內(nèi)切酶連接到RNAi表達(dá)載體pTCK303中，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR鑒定挑選陽性克隆，提質(zhì)粒后分別用SacⅠ/ SpeⅠ和BamHⅠ/ KpnⅠ限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證[9]。

1.3 基因槍轉(zhuǎn)化

1.3.1 供體材料 選用小麥品種為“鄭引1號”，在西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥試驗(yàn)田種植，正常管理。收集生長70～90 d的小麥麥穗，從穗中剝出穎果，用70%乙醇將小麥穎果滅菌。無菌環(huán)境顯微鏡下分離幼胚并且切除胚軸，將10～20個(gè)盾片放置在包含誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，放在22℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)1～2 d[10]。

1.3.2 基因槍轉(zhuǎn)化 參考蘇君藝等[11]的方法對小麥進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的愈傷組織轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d，再于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)28～35 d。將分化出的幼苗轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基中，在幼苗根長2～3 cm時(shí)轉(zhuǎn)入4℃培養(yǎng)箱春化28 d，后移栽入花盆中培養(yǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)基因T0代植株P(guān)CR鑒定及qRT-PCR鑒定

待幼苗長到三葉一心期，利用CTAB法提取小麥基因組DNA。利用潮霉素抗性基因(491bp)設(shè)計(jì)引物并合成[12]。PCR鑒定體系和程序參考2×TaqMaster Mix(Takara)說明書進(jìn)行，退火溫度為57℃，循環(huán)數(shù)為35 cycle，擴(kuò)增產(chǎn)物通過2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。將鑒定為陽性的植株移至13 cm2大小盒中培養(yǎng)。利用wzy1-2 基因序列設(shè)計(jì)特異性定量引物并合成，利用Trizol(Takara)提取小麥總RNA以小麥β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參[13]，使用CFX 96 Touch Real-time PCR Detection System (Bio-Rad)，按照SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒 (Takara) 說明書進(jìn)行qRT-PCR。

1.5 干旱脅迫處理及WZY1-2蛋白的表達(dá)分析

1.5.1 小麥干旱脅迫處理 用直徑30 cm、高20 cm的塑料花盆種植小麥，土壤持水量約為21.98%，每盆裝土8 kg，將陜合6號和鄭引1號小麥品種分別種植30盆，正常生長的盆栽試驗(yàn)小麥的土壤含水量保持在田間持水量的70%～75%。培養(yǎng)地點(diǎn)為西北農(nóng)林科技大學(xué)組織培養(yǎng)室內(nèi)，用稱重法控水。2個(gè)不同品種的小麥生長到苗期、分蘗期、拔節(jié)期和開花期，用稱重法控水進(jìn)行干旱處理[14]。試驗(yàn)設(shè)為3個(gè)處理，正常組土壤含水量為田間持水量(θ田)的75%，中度干旱脅迫含水量為50%θ田，重度干旱脅迫含水量為35%θ田，對各處理小麥葉片進(jìn)行采樣[15]，樣品-80℃保存?zhèn)溆谩７謩e在4個(gè)生長時(shí)期進(jìn)行干旱處理，生長其余過程均進(jìn)行正常灌溉，直至小麥成熟。

1.5.2 葉片可溶性蛋白提取及測定 參照植物蛋白提取試劑盒說明書提取可溶性葉片蛋白[16]，參照Bradford蛋白定量試劑盒的說明書測定小麥可溶性蛋白含量。將提取定量后的蛋白稀釋一定比例后與蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因wzy1-2的獲得

采用Trizol法提取的鄭引1號小麥總RNA純度較高，無明顯降解，可滿足反轉(zhuǎn)錄的要求。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用兩端含有合適酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與克隆載體pMD-18T連接，轉(zhuǎn)化。對陽性克隆進(jìn)行檢測后，得到大小為789bp的條帶，與預(yù)期大小相符。測序結(jié)果表明目的基因克隆正確(圖1)。

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌

當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，進(jìn)行菌落PCR檢測和酶切鑒定，挑取單克隆培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落PCR檢測(圖2)。對于陽性菌液進(jìn)行了酶切檢測，圖3為酶切檢測結(jié)果，證明挑取的單克隆是陽性菌株，質(zhì)粒成功地轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中。

注：M：Marker；1～6泳道：脫水素基因wzy1-2產(chǎn)物。Note: M: Marker; 1～6 lane: Product of dehydrin gene wzy1-2.圖1 脫水素基因wzy1-2序列擴(kuò)增Fig.1 Amplification of dehydration gene wzy1-2 sequence

2.3 基因槍介導(dǎo)幼胚轉(zhuǎn)化過程

圖4展示了轉(zhuǎn)基因小麥幼胚的各個(gè)生長階段。遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率比較低，最終僅得到9株再生植株(表1)。

2.4 抗性植株的PCR檢測結(jié)果

對來源于鄭引1號的再生植株進(jìn)行PCR檢測，以初步確定其中的轉(zhuǎn)基因陽性株系。對這9株植株進(jìn)行了Hpt基因的PCR檢測，圖5是再生植株中標(biāo)記基因Hpt的PCR檢測結(jié)果，目標(biāo)條帶長度504 bp。綜上可以初步確定，共獲得6株陽性植株。

2.5 T0代轉(zhuǎn)基因小麥中wzy1-2基因表達(dá)量的檢測

利用定量PCR對T0代RNAi轉(zhuǎn)基因小麥植株的wzy1-2基因表達(dá)量進(jìn)行分析(圖6)，與野生型鄭引1號相比，檢測的6株T0代轉(zhuǎn)基因小麥植株表達(dá)量均有不同程度下降，其中前2個(gè)株系的表達(dá)量下降達(dá)40%～70%，株系6下降80%左右，而株系7～9下降70%～80%，選擇株系5～9作為后續(xù)試驗(yàn)研究的材料。

注：M：Marker；1～3泳道:正向片段陽性克?。?～6泳道:反向片段陽性克隆。Note: M: Marker; 1～3 lane: Positive fragment positive clones; 4～6 lane: Reverse fragment positive clones.圖2 重組質(zhì)粒的菌落PCR驗(yàn)證Fig.2 Colony PCR validation of recombinant plasmids

注：M: Marker；1,3泳道：正向片段重組載體酶切鑒定檢測結(jié)果；2,4泳道：反向片段重組載體酶切鑒定檢測結(jié)果。Note: M: Marker; 1, 3 lane: Identification of the positive segment recombinant vector by enzyme digestion; 2, 4 lane: Reverse strand recombinant vector identification by enzyme digestion.圖3 重組pTCK303載體酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant pTCK303 vector digested

2.6 干旱脅迫下不同發(fā)育時(shí)期小麥脫水素WZY1-2表達(dá)量分析

通過對陜合6號和鄭引1號小麥4個(gè)不同生長時(shí)期進(jìn)行不同程度的干旱脅迫處理，可溶性蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果如圖7～圖10所示，陜合6號和鄭引1號2種小麥苗期分子量在25kDa～70kDa的蛋白條帶比較多，而且條帶顏色比較深；分蘗期也是25kDa～70kDa的蛋白條帶較多，但是顏色較苗期淡；拔節(jié)期的蛋白條帶在30kDa～70kDa的蛋白條帶較多，條帶數(shù)較苗期和分蘗期少，集中在40kDa～70kDa，顏色較分蘗期淡；開花期和拔節(jié)期2種小麥的蛋白條帶相似，拔節(jié)期蛋白條帶顏色較淡。隨著干旱程度的增加，小麥蛋白條帶數(shù)量減少。陜合6號和鄭引1號小麥可溶性蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果相似。

注：A.誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的幼胚愈傷組織；B.分化篩選培養(yǎng)基上的愈傷組織；C.生根培養(yǎng)的再生苗；D.在營養(yǎng)土上生長的再生苗移栽成株。Note: A. Callus of immature embryos on induction medium; B. Callus on differentiation screening medium; C. Regeneration seedlings grown in rooting; D. Transplantation of regenerated seedlings grown on nutrient soil strain.圖4 轉(zhuǎn)基因小麥的獲得Fig.4 Obtaining of transgenic wheat

表1 基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚統(tǒng)計(jì)

注：M：Marker；1：重組載體；3：空白對照；4：野生型植株；2,5～9：為不同的T0代RNAi轉(zhuǎn)基因植株。Note: M: Marker; 1: Recombinant vector; 3: Blank control; 4: Wild type plants; 2, 5～9: Different T0 generation RNAi transgenic plants.圖5 轉(zhuǎn)基因小麥T0代植株Hpt基因PCR檢測結(jié)果Fig.5 PCR results of Hpt gene in T0 generation transgenic wheat plants

注：2,5～9為不同轉(zhuǎn)基因株系。 WT: 野生型小麥植株。Note: 2,5～9 are different transgenic lines. WT: Wild-type wheat plants.圖6 RT-PCR檢測T0代RNAi轉(zhuǎn)基因植株中wzy1-2 基因表達(dá)量Fig.6 RT-PCR detection of wzy1-2 gene expression in T0 generation RNAi transgenic plants

注：M：蛋白marker；設(shè)置CK為正常組，75%θ田；50%θ田為中度干旱脅迫；35%θ田為重度干旱脅迫。下同。1：鄭引1號，50%θ田；2：陜合6號，50%θ田；3：陜合6號，35%θ田；4：陜合6號,CK；5：鄭引1號，35%θ田；6：鄭引1號,CK。Note: M： Protein marker; CK is normal, 75%θ田；50% θ田 is moderate drought stress； 35% θ田 is severe drought stress. The same below. 1：50% θ田 of Zhengyin 1；2: 50% θ田 of Shaanhe 6; 3： 35% θ田 of Shaanhe 6; 4： CK of Shaanhe 6; 5： 35% θ田 of Zhengyin 1; 6： CK of Zhengyin 1.圖7 2種小麥苗期可溶性蛋白在不同程度干旱處理下SDS-PAGE(A)和WZY1-2蛋白Western blot分析(B)Fig.7 SDS-PAGE (A) of soluble protein in seedling stage of two wheat varieties under different drought-stresses and Western blot analysis (B)

注：M：蛋白marker。1：陜合6號,CK；2：鄭引1號,CK；3：陜合6號，35%θ田；4：鄭引1號，35%θ田；5：陜合6號，50%θ田；6：鄭引1號，50%θ田。Note: M： Protein marker. 1: CK of Shaanhe 6; 2: CK of Zhengyin 1; 3： 35% θ田 of Shaanhe 6; 4： 35% θ田 of Zhengyin 1; 5： 50% θ田 of Shaanhe 6; 6： 50% θ田 of Zhengyin 1.圖8 2種小麥分蘗期可溶性蛋白在不同程度干旱處理下SDS-PAGE(A)和WZY1-2蛋白Western blot分析(B)Fig.8 SDS-PAGE (A) of soluble protein in tillering stage of two wheat varieties under different drought stresses and Western blot analysis (B)

注：M：蛋白marker。1：陜合6號，35%θ田；2：鄭引1號，50%θ田；3：陜合6號，50%θ田；4：陜合6號,CK；5：鄭引1號,CK；6：鄭引1號，35%θ田。Note: M: Protein marker. 1: 35% θ田 of Shaanhe 6; 2: 50% θ田 of Zhengyin 1; 3: 50% θ田 of Shaanhe 6; 4: CK of Shaanhe 6; 5: CK of Zhengyin 1; 6: 35% θ田 of Zhengyin 1.圖9 2種小麥拔節(jié)期可溶性蛋白在不同程度干旱處理下SDS-PAGE(A)和WZY1-2蛋白Western blot分析(B)Fig.9 SDS-PAGE (A) of soluble protein in jointing stage of two wheat varieties under different drought stresses and Western blot analysis (B)

注：M:蛋白marker。1：陜合6號，CK；2：陜合6號，50%θ田；3: 陜合6號，35%θ田；4:鄭引1號，CK；5:鄭引1號，50%θ田；6:鄭引1號，35%θ田。Note: M: Protein marker. 1: CK of Shaanhe 6; 2: 50%θ田 of Shaanhe 6; 3: 35%θ田 of Shaanhe 6; 4: CK of Zhengyin 1; 5: 50%θ田 of Zhengyin 1; 6: 35%θ田 of Zhengyin 1.圖10 2種小麥開花期可溶性蛋白在不同程度干旱處理下SDS-PAGE(A)和WZY1-2蛋白Western blot分析(B)Fig.10 SDS-PAGE (A) of soluble protein in flowering stage of two wheat varieties under different drought stresses and Western blot analysis (B)

為進(jìn)一步研究小麥WZY1-2蛋白在不同生育期的抗旱性，通過Western blot分析，2種小麥4個(gè)不同生長時(shí)期干旱處理均在60kDa有一條特異性蛋白條帶，即小麥WZY1-2蛋白(圖7B,8B,9B,10B)。苗期陜合6號在干旱脅迫下雜交的非特異條帶多，且條帶顏色比較深，鄭引1號的雜交的非特異條帶很少，而小麥WZY1-2蛋白在60 kDa雜交的蛋白條帶深度相當(dāng)。分蘗期的陜合6號和鄭引1號的雜交的非特異條帶相當(dāng)，且隨著干旱脅迫的增加，非特異條帶減少，而陜合6號小麥WZY1-2蛋白在60kDa雜交的蛋白條帶顏色較鄭引1號深。拔節(jié)期陜合6號和鄭引1號的雜交的非特異條帶很少，2種小麥WZY1-2蛋白在60kDa雜交的蛋白條帶顏色相當(dāng)。開花期2種小麥的非特異性條帶相當(dāng)，并且較多，2種小麥WZY1-2蛋白在60kDa雜交的蛋白條帶顏色相當(dāng)。苗期和拔節(jié)期、開花期2種小麥WZY1-2蛋白雜交的特異性條帶深度相當(dāng)，而分蘗期鄭引1號WZY1-2蛋白雜交的特異性條帶較陜合6號淺。小麥WZY1-2蛋白在2種小麥的4個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)結(jié)果趨勢一致，隨著干旱程度的增加，WZY1-2蛋白的條帶明顯比正常生長組的條帶顏色深，條帶粗，特別是重度脅迫時(shí)WZY1-2蛋白的條帶顏色最深。

通過Quantity One V 4.6.2(Bio-Rad)軟件對小麥陜合6號和鄭引1號Western blot分析，如圖11所示，分別將4個(gè)時(shí)期的正常生長組的蛋白表達(dá)量設(shè)為1，苗期中度干旱脅迫和重度脅迫的陜合6號WZY1-2蛋白表達(dá)量分別是正常組生長的1.3倍和2.9倍，鄭引1號WZY1-2蛋白表達(dá)量分別是正常組生長的1.4倍和2.8倍；分蘗期中度干旱脅迫和重度脅迫的陜合WZY1-2蛋白量表達(dá)量分別是正常組生長的1.1倍和1.8倍，鄭引1號WZY1-2蛋白量表達(dá)量分別是正常組生長的1.3倍和1.5倍；拔節(jié)期中度干旱脅迫和重度脅迫的陜合6號WZY1-2蛋白表達(dá)量分別是正常組生長的1.3倍和2倍，鄭引1號WZY1-2蛋白表達(dá)量分別是正常組生長的1.5倍和2.1倍；開花期中度干旱脅迫和重度脅迫的陜合6號WZY1-2蛋白量表達(dá)量分別是正常組生長的1.3倍和1.9倍，鄭引1號WZY1-2蛋白量表達(dá)量分別是正常組生長的2.4倍和2.5倍。小麥WZY1-2蛋白在陜合6號和鄭引1號小麥4個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)趨勢一致，隨著干旱程度的增加，2種小麥WZY1-2蛋白表達(dá)量增加，特別是重度干旱脅迫下小麥WZY1-2蛋白的表達(dá)量達(dá)到了峰值。

注：1.苗期正常組；2.苗期中度干旱脅迫；3.苗期重度干旱脅迫；4.分蘗期正常組；5.分蘗期中度干旱脅迫；6.分蘗期重度干旱脅迫；7.拔節(jié)期正常組；8.拔節(jié)期中度干旱脅迫；9.拔節(jié)期重度干旱脅迫；10.開花期正常組；11.開花期中度干旱脅迫；12.開花期重度干旱脅迫。Note: 1: Normal seedling stage; 2: Moderate drought stress during seedling stage; 3: Severe drought stress during seedling stage; 4: Normal tillering stage; 5. Moderate drought stress during tillering stage; 6: Severe drought stress during tillering stage; 7: Normal jointing stage; 8:Moderate drought stress during jointing stage; 9: Severe drought stress during jointing stage; 10: Normal flowering stage; 11: Moderate drought stress during flowering stage; 12: Severe drought stress during flowering stage.圖11 光密度測定免疫印跡條帶強(qiáng)度Fig.11 Densitometric Western blot band intensity

3 結(jié) 論

通過小麥WZY1-2蛋白的表達(dá)量隨著干旱程度的增加而升高，苗期小麥WZY1-2蛋白的表達(dá)量均高于其它3個(gè)生長時(shí)期，表明小麥脫水素wzy1-2是干旱誘導(dǎo)型基因。

另外，本研究得到了脫水素WZY1-2在小麥苗期、分蘗期、拔節(jié)期和開花期干旱處理的表達(dá)規(guī)律。2個(gè)不同抗旱性小麥品種，陜合6號(干旱耐受型)和鄭引1號(干旱敏感型)在4個(gè)生長時(shí)期隨著干旱程度增加，WZY1-2蛋白的表達(dá)量升高，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 討 論

小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究相比于其他植物而言起步雖晚，但發(fā)展較快。Vasil等[17]利用基因槍介導(dǎo)法將bar基因?qū)胄←溒贩N“Pavon”，獲得了世界上第一例轉(zhuǎn)基因小麥植株，為展開小麥分子育種奠定了基礎(chǔ)[17]。許多研究者利用不同方法將多種基因?qū)肓诵←湥@得了不同性狀的轉(zhuǎn)基因植株。Weeks等[18]利用基因槍介導(dǎo)法分別將β-葡萄糖苷酸標(biāo)記基因(GUS)、bar基因?qū)肓诵←?，初步建立了基因槍法轉(zhuǎn)化小麥的技術(shù)體系[18]。隨后基因槍法在單子葉植物方面的轉(zhuǎn)化技術(shù)越來越成熟，很多學(xué)者通過基因槍法獲得了不同抗性的轉(zhuǎn)基因小麥[19]。雖然農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但小麥并不是農(nóng)桿菌的天然宿主，轉(zhuǎn)化效率低，小麥外植體受到的傷害較大，進(jìn)而對轉(zhuǎn)基因的效率產(chǎn)生影響[20]。

目前常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法分別占到小麥遺傳轉(zhuǎn)化的15.9%和68.8%[21]。本試驗(yàn)通過基因槍法成功獲得wzy1-2基因的遺傳轉(zhuǎn)化植株，但轉(zhuǎn)化效率低的問題仍然存在，這與受體處理方式及時(shí)間、受體培養(yǎng)及篩選、外植體的基因型和轉(zhuǎn)化條件等相關(guān)[22]，過低的轉(zhuǎn)化率一直是限制基因槍法廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一[23]。

脫水素屬于LEA2家族,是目前研究較為深入的一類LEA蛋白。其二級結(jié)構(gòu)含有大量極性氨基酸,其中賴氨酸和甘氨酸含量最高；具有較強(qiáng)的親水性和熱穩(wěn)定性，缺乏非極性疏水氨基酸 (半胱氨酸、色氨酸)[24]。在逆境脅迫下，部分脫水素的表達(dá)還受到脫落酸(ABA)誘導(dǎo)作為功能蛋白大量表達(dá)[5]。本試驗(yàn)成功構(gòu)建含反向重復(fù)序列的RNA干擾表達(dá)載體，通過基因槍轉(zhuǎn)化獲得再生植株26株，再生率為1.03%。利用表達(dá)載體上Hpt基因的特異引物，檢測到6株Hpt基因陽性植株，Hpt基因陽性轉(zhuǎn)化率為0.24%。收獲6株轉(zhuǎn)基因植株種子。此次研究得到的轉(zhuǎn)基因植株較少，無法準(zhǔn)確地進(jìn)行表型鑒定。需要對后代進(jìn)一步調(diào)查統(tǒng)計(jì)，研究脫水素在小麥中的作用，為進(jìn)一步探索脫水素wzy1-2基因功能奠定基礎(chǔ)。