血清生存素水平在預(yù)測腫瘤壞死因子-α抑制劑治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床療效中的作用

韓俊，張英

（江漢大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，武漢 430015）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 （rheumatoid arthritis，RA） 是一類慢性自身免疫性疾病，以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，如不給予積極治療，病情將逐漸加重，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失，甚至導(dǎo)致不同程度的殘疾［1］。但隨著腫瘤壞死因子抑制劑 （tumor necrosis factor inhibitors，TNFi） 的發(fā)展和使用，RA的預(yù)后有了很大改善［2-3］。但仍然有約20%～30%的RA患者TNFi療效不佳或難以承受其高昂的費(fèi)用［4-5］，因此，探索可預(yù)測TNFi療效的生物標(biāo)志物，對RA患者個(gè)體化治療具有重要意義。生存素是最近新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，其表達(dá)水平與RA密切相關(guān)。研究［6］顯示，生存素陽性 （＞ 0.45 ng/mL） 的RA患者單獨(dú)使用甲氨蝶呤（methotrexate，MTX） 治療效果較差，生存素水平降低與較好的臨床療效相關(guān)。腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 抑制劑是臨床最常用的TNFi，目前血清生存素在預(yù)測其治療RA患者臨床療效中的作用尚不清楚。因此，本研究擬評估血清生存素水平在預(yù)測RA患者TNF-α抑制劑臨床療效中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2015年4月至2017年3月期間在江漢大學(xué)附屬醫(yī)院接受TNF-α抑制劑治療的中高疾病活動(dòng)度RA患者63例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1） 符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)；（ 2） 年齡≥18周歲；（ 3）28關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度（ disease activity score 28，DAS28） ≥3.2分；（ 4） 根據(jù)病情需要自愿接受TNF-α抑制劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)變形或接受過關(guān)節(jié)手術(shù)；合并中重度肝功能或腎功能不全；6個(gè)月內(nèi)使用過TNF-α抑制劑或其他生物制劑治療；有惡性腫瘤史、嚴(yán)重感染史；懷孕或哺乳期。本研究獲得了江漢大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 治療及評估：本研究所有患者均根據(jù)病情需要和自我意愿選擇TNF-α抑制劑治療。常規(guī)推薦TNF-α抑制劑治療方案如下，TNF-α抑制劑皮下注射2次/周，25 mg/次，持續(xù)24周。根據(jù)患者實(shí)際病情需要，聯(lián)合1種抗風(fēng)濕病情藥物 （disease-modifying antirheumatic drugs，DMARD） 藥 物 進(jìn) 行 治 療。記錄患者的基線期信息，包括年齡、性別、病程、血沉 （erythrocyte sedimentation rate，ESR） 、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP） 、DAS28評分、健康狀況問卷 （health assessment questionnaire，HAQ） 評分、類風(fēng)濕因子 （rheumatoid factor，RF） 狀態(tài)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體 （anti-cyclic citrullinated peptide antibody，A-CCP）狀態(tài)以及合并用藥信息。TNF-α抑制劑治療24周時(shí)評估患者的DAS28評分，參考?xì)W洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)，臨床應(yīng)答定義為DAS28評分相對于基線期下降≥1.2分；臨床緩解定義為DAS28評分＜2.6分。

1.2.2 樣本采集：基線期收集RA患者血清。清晨抽取空腹靜脈血5 mL，室溫放置2 h，或4 ℃過夜后于3 000 r/min （離心半徑10 cm） 離心5 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：嚴(yán)格按照ELISA試劑盒 （美國Abcam公司） 操作說明進(jìn)行ELISA測定，測量基線期生存素表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件和GraphPad prism V5.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。連續(xù)變量采用Kolmogorov-Smirnov進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的連續(xù)變量采用s的形式描述，非正態(tài)分布的連續(xù)變量采用中位數(shù) （四分位間距） 形式描述。分類變量采用頻數(shù) （百分比） 的形式表示。生存素水平 （非正態(tài)分布的連續(xù)變量） 在應(yīng)答患者和無應(yīng)答患者以及緩解患者和未緩解患者的組間差異比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用受試者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線對生存素預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA患者臨床應(yīng)答進(jìn)行評估。采用單因素logistic回歸模型分析影響TNF-α抑制劑治療RA患者臨床療效的因素，將單因素回歸分析中P≤0.1的因素進(jìn)一步納入多因素logistic回歸模型，分析影響預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA臨床療效的獨(dú)立預(yù)測因素。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的基線信息

63例RA患者的平均年齡為 （48±11） 歲，其中，男19例，女44例，疾病病程中位值為59 （51～86） 個(gè)月。ESR、CRP中位值分別為36.3 （27.8～50.1） mm/h和29.1 （22.4～38.8） mg/L。DAS28評分和HAQ評分分別為5.7±1.5和1.9±0.8。RF陽性48例 （76.2%） ，RF陰性15例 （23.8%）；A-CCP陽性42例 （66.7%） ，陰性21例 （33.3） 。合并治療MTX、來氟米特 （leflunomide，LEF） 和柳氮磺吡啶 （sulfasalazine，SSZ） 的患者數(shù)分別為30例 （47.6%） 、26例 （41.3%） 和7例 （11.1%） 。

2.2 TNF-α抑制劑治療臨床應(yīng)答和無應(yīng)答RA患者基線期血清生存素表達(dá)水平

如圖1所示，經(jīng)24周TNF-α抑制劑治療后，參考?xì)W洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)對63例患者進(jìn)行評估，41例符合臨床應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn) （設(shè)為應(yīng)答組） ，22例未達(dá)到臨床應(yīng)答 （設(shè)為無應(yīng)答組） 。應(yīng)答組基線期生存素表達(dá)水平低于無應(yīng)答組 （P = 0.004） 。

圖1 TNF-α抑制劑治療應(yīng)答組與無應(yīng)答組患者基線期生存素表達(dá)水平Fig.1 The expression level of survivin in TNF-α inhibitor treatment responser group and non-responser group

2.3 生存素水平預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA患者臨床無應(yīng)答的ROC曲線分析

如圖2所示，生存素表達(dá)水平對預(yù)測TNF-α抑制劑治療有無應(yīng)答具有較高價(jià)值，生存素表達(dá)水平越高，則預(yù)示治療應(yīng)答可能性越大，其曲線下面積 （area under the curve，AUC） 為0.717，95%CI：0.583～0.852，當(dāng)取最佳分割點(diǎn)生存素水平為780.7 pg·mL-1時(shí) （特異度與靈敏度之和最大的點(diǎn)） ，特異度為63.6%，靈敏度為80.5%。

2.4 基線期預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA臨床應(yīng)答的因素分析

為了明確基線期生存素水平在TNF-α抑制劑治療RA臨床應(yīng)答中的預(yù)測作用，進(jìn)一步采用單因素、多因素logistic回歸模型分析了基線期特征對于臨床應(yīng)答的預(yù)測作用，其中連續(xù)變量按照中位值或均值劃分高低。單因素回歸結(jié)果表明，生存素高表達(dá)可預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA患者無臨床應(yīng)答 （P = 0.008） ，CRP水平高可以預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA患者臨床應(yīng)答 （P = 0.003） ，見表1。

圖2 生存素預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA患者臨床無應(yīng)答的ROC曲線Fig.2 ROC curve of survivin predicts the efficacy of TNF-α inhibitor treatment for RA patients without a clinical response

將單因素logistic回歸模型中P ≤ 0.1的因素進(jìn)一步納入多因素logistic回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，生存素高表達(dá)可以獨(dú)立預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA患者無臨床應(yīng)答 （P = 0.032） ，而CRP水平高也可以獨(dú)立預(yù)測RA患者對TNF-α抑制劑治療有臨床應(yīng)答 （P =0.011） ，見表2。因此，生存素高表達(dá)可以獨(dú)立于CRP預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA患者無臨床應(yīng)答。

2.5 TNF-α抑制劑治療緩解組與未緩解組基線期生存素表達(dá)水平

經(jīng)TNF-α抑制劑治療24周后，DAS28評分結(jié)果顯示16例RA患者達(dá)到臨床緩解 （設(shè)為緩解組） ，47例未達(dá)到臨床緩解 （設(shè)為未緩解組） ，緩解組基線期生存素水平與未緩解組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P =0.265） 。見圖3。

2.6 基線期預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA臨床緩解的因素分析

單因素logistic回歸結(jié)果顯示，生存素高表達(dá)以及患者基線信息、生化指標(biāo)水平、聯(lián)合用藥等均不是影響RA患者達(dá)到TNF-α抑制劑治療臨床緩解的因素 （均P ＞ 0.1） 。因?yàn)樗幸蛩豍值均＞0.1，所以沒有進(jìn)行多因素回歸分析，見表3。

表1 影響TNF-α抑制劑治療RA患者臨床應(yīng)答因素的單因素logistic回歸分析Tab.1 Univariate logistic regression analysis of clinical response factors in RA patients treated with TNF-α inhibitor

表2 影響TNF-α抑制劑治療RA患者臨床應(yīng)答因素的多因素logistic回歸分析Tab.2 Multivariate logistic regression analysis of clinical response factors in RA patients treated with TNF-α inhibitor

圖3 TNF-α抑制劑治療緩解組與未緩解組基線期生存素表達(dá)水平的差異Fig.3 Differences in baseline survivin level in the remission and non-remission groups after treatment with TNF-α inhibitor

3 討論

生存素是凋亡抑制蛋白家族中的一員，是由142個(gè)氨基酸組成的多功能蛋白。它可以直接或間接抑制凋亡相關(guān)蛋白caspase3/7/9的激活從而抑制細(xì)胞凋亡，此外它還參與細(xì)胞周期，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能，是聯(lián)系細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的重要因子［7-8］。在免疫細(xì)胞中，生存素是功能T細(xì)胞受體形成和記憶T細(xì)胞分化的重要組成部分［8］，還是功能性抗原遞呈所必須的，可以調(diào)節(jié)組織相容性復(fù)合體Ⅱ分子的表達(dá)和抗原遞呈樹突狀細(xì)胞的成熟，在RA發(fā)病中起著關(guān)鍵作用［9］。

表3 影響TNF-α抑制劑治療RA患者臨床緩解的單因素logistic回歸分析Fig.3 Logistic regression analysis of clinical remission in RA patients treated with TNF-α inhibitor

研究表明，RA的發(fā)生與滑膜細(xì)胞周期失調(diào)及凋亡異常導(dǎo)致的關(guān)節(jié)滑膜組織過度增生、肥厚有關(guān)。已有資料證實(shí)滑膜組織、關(guān)節(jié)液及血漿中存在生存素高表達(dá)，并且與早期關(guān)節(jié)損傷和不良治療反應(yīng)相關(guān)［8-10］。一項(xiàng)關(guān)于馬來西亞RA流行病學(xué)的研究［11］顯示，在1 233例RA患者中，有50.7%的患者血液檢測出高表達(dá)的生存素，而1 566例對照組中僅有5.4%生存素水平升高。另一項(xiàng)研究以87例年齡為24～89歲，病程18～526個(gè)月的RA患者為研究對象，通過ELISA方法檢測RA患者血液中生存素的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)37%的RA患者生存素水平呈陽性 （生存素＞0.9 ng/mL） 。而與生存素陰性的患者相比，血液生存素陽性的患者對單用infliximab治療不容易產(chǎn)生臨床應(yīng)答和達(dá)到臨床緩解［12］。提示生存素可能可以預(yù)測RA患者對生物制劑治療的敏感性。但是生存素預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA患者臨床療效的研究尚少，其預(yù)測作用尚不完全清楚。本研究通過ELISA檢測并分析基線期生存素水平在預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA患者臨床療效中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生存素在臨床應(yīng)答組患者中顯著下調(diào)。進(jìn)一步多因素logistic回歸模型分析顯示，基線期生存素水平高可以獨(dú)立預(yù)測RA患者對TNF-α抑制劑治療不容易達(dá)到臨床應(yīng)答。分析其原因可能是生存素可以抑制細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡進(jìn)一步促進(jìn)類風(fēng)濕成纖維樣滑膜細(xì)胞和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)慢性炎癥細(xì)胞的增多［8-9，11］。因此，高水平的生存素可能預(yù)示著患者預(yù)后差，疾病進(jìn)展快。此外，生存素可能對生物制劑具有抵抗作用，使RA患者產(chǎn)生耐藥［11-13］，故生存素可以獨(dú)立預(yù)測RA患者對TNF-α抑制劑治療的臨床應(yīng)答。但是本研究發(fā)現(xiàn)，基線期生存素水平并不能預(yù)測患者對TNF-α抑制劑治療是否達(dá)到臨床緩解?？赡苁怯捎诒狙芯吭u估時(shí)間較短，達(dá)到臨床緩解的患者較少，導(dǎo)致結(jié)果可能出現(xiàn)偏差。

本研究存在一些局限性：（1） 樣本量相對較小，僅63例患者，缺乏統(tǒng)計(jì)效能，未能找到影響療效緩解的因素，因此，未來的研究應(yīng)納入更多樣本，以進(jìn)一步驗(yàn)證生存素對TNF-α抑制劑臨床療效的預(yù)測價(jià)值； （2） 隨訪時(shí)間較短，僅為24周，因此生存素對TNF-α抑制劑治療RA患者的長期療效及預(yù)測作用未能評估； （3） 由于患者有聯(lián)合其他DMARDs進(jìn)行治療，可能會(huì)影響生存素的表達(dá)水平，從而干擾生存素預(yù)測TNF-α抑制劑治療RA臨床應(yīng)答的結(jié)果，但是本研究進(jìn)行了單因素和多因素logistic回歸分析，減少了其他藥物對結(jié)果預(yù)測的干擾。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，基線期血清生存素表達(dá)水平可以作為預(yù)測TNF-α抑制劑治療中高疾病活動(dòng)度RA患者臨床應(yīng)答的可靠生物標(biāo)志物。