針灸干預(yù)癲癇相關(guān)信號通路研究進展

呂明惠，武 鑫，蘇少華，張松江， 王曉輝，孫寧寧，高劍峰

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為癲癇是一種由于大腦神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致的以反復(fù)性發(fā)作為特征的大腦功能失調(diào)綜合征[1]。根據(jù)發(fā)作次數(shù)多少可以分為輕度和重度，ILAE[2]在2016年根據(jù)癲癇發(fā)作的不同情況，將其分為局灶性、全面性、起源不明三大類。隨著癲癇發(fā)作次數(shù)、時間等的增加，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)行為運動、精神感覺、認知等多種功能障礙，對病患造成如睡眠障礙等一系列生活障礙[3]，當(dāng)單純癲癇發(fā)作進展為癲癇持續(xù)狀態(tài)則可能導(dǎo)致生命危險。目前很多研究認為，癲癇發(fā)病會引起腦部炎性損傷，炎癥因子進一步促進癲癇的發(fā)生，形成惡性循環(huán)[4]。因此，研究癲癇的發(fā)病機制，探討其可能的治療手段，是目前亟需各個專業(yè)領(lǐng)域共同努力的方向。

1 中醫(yī)學(xué)對癲癇的認識

中醫(yī)藥在提高癲癇療效和改善腦電圖方面具有優(yōu)勢[5]。《素問·至真要大論》：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝?！贝藶橹嗅t(yī)最早論述的與內(nèi)風(fēng)相干的文字，這與癲癇內(nèi)風(fēng)妄動相合。癲癇屬中醫(yī)“癇證”范疇，發(fā)作時主要表現(xiàn)為“猝然仆倒，昏不知人事，伴尖叫聲，口吐涎沫，兩目上視，肢體抽搐，移時蘇醒”。癲癇乃虛實夾雜病機交錯之頑疾，以風(fēng)、火、痰、瘀、驚為主要病因，又因病程纏綿日久難愈，耗傷正氣，臟腑功能衰退，運化不濟，致使體內(nèi)痰瘀之標(biāo)更實，挾風(fēng)上蒙腦竅，故成反復(fù)發(fā)作之難治之證。其發(fā)病為肝脾腎三臟受損，多因七情失調(diào)、稟賦不足、腦部外傷等導(dǎo)致瘀血、痰濁內(nèi)阻，風(fēng)熱痰濁上攻，蒙蔽清竅是主要病機。中醫(yī)學(xué)對癇證的辨證論治已較為成熟，或治以平肝熄風(fēng)，或治以清心豁痰，或治以活血化瘀，或治以補益肝腎等[6，7]。

針灸治療癲癇，最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，在歷代古籍中也有不少記載。經(jīng)絡(luò)學(xué)說是中醫(yī)學(xué)重要的理論支柱之一，針灸是經(jīng)絡(luò)學(xué)說在實踐上的升華。從四大經(jīng)典到后世醫(yī)家著作，針灸治療癲癇的理論學(xué)說及臨證經(jīng)驗得到不斷充實和驗證。傳統(tǒng)中醫(yī)認為，針灸可以通過調(diào)節(jié)身體氣、血、陰陽的平衡來治療癲癇。近代實驗研究認為，穴位針灸可以將沖動經(jīng)由軀干神經(jīng)傳入，再由迷走神經(jīng)分支傳出，進而作用于機體達到調(diào)節(jié)效果[8]。這表明針刺穴位產(chǎn)生的興奮信息可以被轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的神經(jīng)沖動，為針灸治療癲癇發(fā)作時大腦神經(jīng)元異常放電提供實驗證據(jù)和支持。與此理論相似，李倩倩等[9]認為針灸可以調(diào)節(jié)由交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)活動之間的不平衡引起的不同種類疾病中的不同腦區(qū)平衡，達到治療急性癲癇的目的。同時也有實驗發(fā)現(xiàn)，針灸可以抑制電皮質(zhì)圖中的癲癇活動，并抑制其引起的睡眠障礙[3]；穴位埋線實驗也支持這一論點，結(jié)果表明其可以延緩癲癇發(fā)作潛伏期[10]。另一方面，針灸可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的代謝影響突出可塑性[11]、下調(diào)海馬神經(jīng)細胞內(nèi)NF-κB的表達影響神經(jīng)細胞的代謝活動[12]，進而控制癲癇的發(fā)展。大量實驗及臨床研究都表明，針灸對于癲癇的防治具有一定的優(yōu)勢[13，14]。進入現(xiàn)代社會，電針成為更加便捷、持續(xù)性強的針刺方式。有實驗以手針刺激探索其對健康人大腦電信號的影響以探索不同頻率針刺對腦活動的影響[15]，為針刺與大腦活動相互作用的規(guī)律和作用機制提供了理論支持。但是，對手針和電針的優(yōu)劣爭論仍很多，兩者之間是否具有差異或者共同效果，且如何將其合理運用到動物實驗研究中，仍需進一步規(guī)范[16]。

2 針灸治療癲癇相關(guān)信號通路的研究

針灸如何將信號轉(zhuǎn)入中樞，如何改變?nèi)梭w的生理、病理表現(xiàn)，這是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)注的重心。對癲癇相關(guān)信號通路的研究成為研究的重點之一，也取得較為突出的成果。較為熱門的研究包括如下幾點。

2.1 細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)信號通路研究

ERK1/2(extracellular signal-regulated kinases，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中的重要成分，是一種可以將細胞表面上的受體信號傳遞到細胞核中DNA細胞中的蛋白質(zhì)鏈。其作用的第一步是信號分子與細胞表面受體相結(jié)合，然后傳入細胞核，促使DNA表達蛋白，最后作用于細胞本身，ERK1/2信號通路主要在細胞生長、增殖、分化等過程中表達[17]。相關(guān)研究表明，在大鼠神經(jīng)元出現(xiàn)癲癇樣放電后較短時間內(nèi)，即可檢測到p-ERK1/2，其表達在30min達峰值[18]，這表明在癲癇發(fā)生過程中，短期內(nèi)即可促使信號通路被激活表達p-ERK1/2。LIN等[19]對照耳廓電針及電針足三里、上巨虛兩穴的動物實驗，發(fā)現(xiàn)電針耳部穴位可以對p-ERK1/2信號通路產(chǎn)生作用，且與電針針刺足三里、上巨虛兩穴相比更優(yōu)，可減少癲癇樣放電，這證明，電針可以有效調(diào)節(jié)ERK1/2信號通路，對癲癇發(fā)作產(chǎn)生拮抗作用，而且選擇不同穴位對通路的激活程度也有所不同，其作用機制還需要進一步的研究。

2.2 轉(zhuǎn)錄因子 NF-E2 相關(guān)因子(Nrf2) -抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路研究

轉(zhuǎn)錄因子 NF-E2 相關(guān)因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)存在于細胞質(zhì)中，可參與細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過干預(yù)Nrf2可以治療由氧化應(yīng)激引起的疾病[20]。研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)生過程中，大腦產(chǎn)生大量有害氧化物質(zhì)，已有研究表明，在癲癇小鼠注射Nrf2過表達的腺相關(guān)病毒后，小鼠顯示出顯著減少的廣泛性癲癇發(fā)作[21]。Nrf2作為抗氧化重要通路，在調(diào)控海馬神經(jīng)干細胞增殖、分化方面起重要作用[22]。針刺可以增強海馬神經(jīng)元細胞Nrf2的核內(nèi)表達，上調(diào)Nrf2并可以影響其靶基因的轉(zhuǎn)錄水平[23]。NFE2L2是編碼轉(zhuǎn)錄Nrf2的基因，其基因的變異將影響Nrf 2的正常表達，也影響Nrf 2如何正常與下游通路受體蛋白的結(jié)合。大量臨床調(diào)查顯示，NFE2L2基因變體增加可提高顳葉癲癇的發(fā)生和癲癇耐藥性風(fēng)險[24，25]?？寡趸磻?yīng)元件(antioxidant response element，ARE)是可以與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合的DNA小片段，它可以通過介導(dǎo)解毒酶基因的表達減輕細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)來保護細胞[26]。Nrf 2與ARE進行結(jié)合，促進ARE表達上調(diào)，減輕腦內(nèi)氧化反應(yīng)，從內(nèi)源途徑干預(yù)急性癲癇發(fā)作[27]。研究表明，電針能夠激活Nrf2-ARE信號通路，增加Nrf 2依賴性抗氧化劑的表達，從而保護神經(jīng)[28]。由此可見，無論是Nrf2自身轉(zhuǎn)錄基因異常，或者是Nrf2-ARE通路異常，都會對癲癇的發(fā)生產(chǎn)生影響。

2.3 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)-酪氨酸激酶受體B (TrkB)信號通路研究

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)為廣泛存在于腦內(nèi)的神經(jīng)因子，對神經(jīng)細胞的生長、分化、死亡都具有調(diào)控作用，酪氨酸激酶受體B (tropomyosin-related kinase receptor type B,TrkB)為其通路下游受體。早期研究即證明，BDNF-TrkB信號通路在癲癇發(fā)生中起關(guān)鍵作用[29]，認為在癲癇發(fā)作時，BDNF和TrkB表達上升[30]，不過也有研究發(fā)現(xiàn)，慢性復(fù)發(fā)性癲癇大鼠腦內(nèi)BDNF-TrkB信號通路出現(xiàn)下調(diào)，暗示其可能參與誘導(dǎo)癲癇的反復(fù)自發(fā)性發(fā)作[31]。有實驗通過針刺大鼠“百會”“人中”“合谷”“足三里”穴位，發(fā)現(xiàn)BDNF和TrkB可以在較長時間內(nèi)持續(xù)增高，進一步行側(cè)腦室特異性TrkB抑制劑注射后，發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制針刺對大鼠神經(jīng)損傷的修復(fù)作用，從分子機制驗證針刺可以作用于BDNF-TrkB信號通路[32]。最新研究也發(fā)現(xiàn)，電針可以通過提高大鼠大腦BDNF及其受體TrkB表達，對突觸可塑性產(chǎn)生影響[33]。這說明電針可以通過促進腦內(nèi)BDNF-TrkB通路有效調(diào)節(jié)突觸可塑性，進而起到治療癲癇的作用。

2.4 P13K/Akt信號通路研究

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K) /蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)信號通路是調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞各項活動的重要通路之一，廣泛參與神經(jīng)元細胞的生存、分化、凋亡等過程，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)過程中起重要作用[34]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，在癲癇大鼠側(cè)腦室注射特異性拮抗劑(LY 294002)阻斷P13K/Akt信號通路后，相對于模型組海馬CA3區(qū)錐體細胞數(shù)量的明顯減少，針刺組海馬CA3區(qū)錐體細胞數(shù)量在癲癇發(fā)作后4h和24h均顯著增加，這表明在電針拮抗癲癇腦損傷過程中，PI3K/Akt信號通路具有相關(guān)性[35]，電針大鼠頭皮穴位實驗進一步支持了這一理論，認為電針對PI3K/Akt信號通路的影響可能是其抑制海馬神經(jīng)元凋亡和改善相關(guān)缺陷的機制之一[36]。

2.5 mTOR信號通路研究

海馬區(qū)苔蘚纖維出芽可促進癲癇發(fā)生，連續(xù)6周電針“足三里”“上巨虛”可以改善大鼠海馬區(qū)苔蘚纖維的發(fā)芽[37]，表明電針可以有效拮抗海馬苔蘚纖維出芽。雷帕霉素哺乳動物靶點(Mammalian target of rapamycyin,mTOR)為PI3K /AKT途徑的下游絲氨酸/蘇氨酸激酶，動物實驗研究已表明，mTOR抑制劑可以有效預(yù)防癲癇發(fā)作[38]、顯著減少癲癇發(fā)作頻率、降低癲癇發(fā)作程度[39]。其機制可能為mTOR抑制劑可以通過對硬化海馬顆粒層顆粒細胞苔蘚纖維軸突的抑制發(fā)揮抗癲癇作用[40]。電針可以有效作用于P13K/Akt信號通路，作為通路下游的mTOR，實驗中電針與mTOR信號通路之間是否也具有聯(lián)系，有待進一步實驗證據(jù)支撐。

2.6 C/EBP同源蛋白(CHOP)信號通路研究

C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)是癲癇發(fā)作后DNA損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后，CHOP在海馬存活區(qū)域中上調(diào)，其機制可能為CHOP啟動神經(jīng)保護功能，拮抗神經(jīng)元死亡[41]。有實驗證明，通過針刺大鼠“百會”“大椎”，大鼠海馬組織免疫組化顯示葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78蛋白表達增加，CHOP顯著下調(diào)[42]。研究者進一步通過對針刺大鼠“百會”“大椎”獲得的血清進行細胞實驗，將血清作用于海馬神經(jīng)元細胞，發(fā)現(xiàn)針刺血清可顯著降低神經(jīng)元的凋亡，CHOP在12 h和48 h兩個時間點都顯著降低，與此同時Caspase-12在2 h、12 h和48 h三個時間段均明顯下調(diào)[43]，提示針刺血清對癲癇發(fā)作腦損傷具有保護作用。

3 結(jié)語

最后，本課題組運用鋰-匹羅卡品成功誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，通過電針針刺“百會”“風(fēng)府”，雙側(cè)“腎俞”穴 7d，運用免疫組織化學(xué)方法檢測微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)，結(jié)果表明電針可以有效提高癲癇腦損傷后小鼠MAP-2，從而對癲癇腦損傷后神經(jīng)元與突觸的修復(fù)提供支持。其余相關(guān)指標(biāo)正在統(tǒng)計中，期待分享，希望本研究能為臨床及實驗研究提供一定的實驗支持。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療癲癇的理論上具有強大的優(yōu)勢，歷代醫(yī)家典籍記載的針灸經(jīng)驗使之在實踐及實驗上具有可取性、可研究性。我們應(yīng)該緊密結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論和實驗方法，利用現(xiàn)代研究技術(shù)更好地探索如何結(jié)合中醫(yī)學(xué)理論及實踐，以期為中醫(yī)理論及醫(yī)學(xué)臨床提供一定的證據(jù)支撐。癲癇相關(guān)信號通路之間并非完全無關(guān)聯(lián)，許多通路在上下游相互鏈接，這也從一方面提示研究者不能將每條通路完全隔離于其他通路，在探索一條通路的同時，也可以考慮是否對其他通路也有影響，這提示我們需要進一步研究的東西其實還有很多。