HPV分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

靳大川 梁彥玲 左雨點(diǎn) 路德榮 周 濤 郭寶強(qiáng)

人乳頭狀瘤病毒(human papillomaviruses， HPV)屬乳多空病毒科的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組有大約8000個(gè)堿基對(duì)[1]。按照DNA序列差異分為5個(gè)屬，即α、β、γ、Mu、Nu，每個(gè)屬包括若干亞型。目前發(fā)現(xiàn)了200多種亞型，其中α屬65種[2]。對(duì)人類致病的HPV主要就是α屬。作為世界上最常見的性傳播病毒之一，HPV不僅是女性宮頸癌的元兇，也與肛管癌、陰莖癌、口咽部癌癥等有關(guān)[3,4]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將α屬HPV亞型按致癌潛力分為高危亞型(high-risk HPV，HR-HPV)和低危亞型(low-risk HPV，LR-HPV)[5]。確認(rèn)的HR-HPV有12種，即 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59亞型；另有13種可能致癌亞型，即26、30、34、53、66、67、68、69、70、73、82、85、97亞型[5]。市場(chǎng)上檢測(cè)HPV的試劑盒，絕大部分是針對(duì)α屬的HPV亞型[2]。其中，美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)了5種用于原發(fā)性宮頸癌篩查的HPV檢測(cè)技術(shù)，即第2代雜交捕獲法(hybrid capture 2，HC2)、cervista HPV HR、cervista HPV 16/18、Cobas HPV檢測(cè)、APTIMA HPV檢測(cè)[1]。本文對(duì)常用的HPV分子生物學(xué)檢測(cè)方法綜述如下。

一、經(jīng)典核酸雜交檢測(cè)方法

這類技術(shù)都屬于固相雜交技術(shù)，包括經(jīng)典的Southern印跡、原位雜交、斑點(diǎn)印記雜交等，主要是采用放射性標(biāo)記的同源性核酸探針，來檢測(cè)標(biāo)本中的HPV感染。

1.Southern印跡雜交：方法特異性強(qiáng)，可以結(jié)合限制性片段多態(tài)性檢測(cè)(restricted fragment length polymorphisms，RFLP)對(duì)HPV進(jìn)行分型，但是敏感度差，操作步驟過于繁瑣，不適用于大規(guī)模標(biāo)本檢測(cè)的情況。對(duì)所用DNA的產(chǎn)量(至少10μg)和質(zhì)量要求都比較高，必須是新鮮或冷凍的臨床標(biāo)本。因此對(duì)于石蠟固定的標(biāo)本不太適用，因?yàn)檫@類標(biāo)本的DNA分子往往已經(jīng)發(fā)生了降解。

2.斑點(diǎn)印記雜交：操作比Southern印跡簡(jiǎn)單，而且可以同時(shí)處理多個(gè)標(biāo)本。其敏感度與Southern印跡結(jié)合RFLP相似，對(duì)標(biāo)本的質(zhì)量要求與Southern印跡相似，需要用新鮮或冷凍的標(biāo)本，特異性也比較強(qiáng)。敏感度強(qiáng)于Southern印跡，需要DNA的量較少(0.5μg)，但是操作過程中有一定的放射性，因此也不太適合臨床廣泛開展。

3.原位雜交：其優(yōu)點(diǎn)在于可以用于固定處理后的臨床標(biāo)本，并且可以進(jìn)行細(xì)胞定位。這種方法的特異性和Southern印跡相似。缺點(diǎn)是檢測(cè)的敏感度差，其敏感度低于斑點(diǎn)印記和Southern印跡法。另外，這種檢測(cè)手段對(duì)操作者的經(jīng)驗(yàn)要求較高，操作繁瑣，而且操作過程中容易出現(xiàn)探針的交聯(lián)，如果用于HPV的分型檢測(cè)，比較容易出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。

總之，以上檢測(cè)由于操作較繁瑣，不太適用于處理大批量的臨床標(biāo)本，且敏感度欠佳，目前主要用于實(shí)驗(yàn)室研究，而在臨床上已經(jīng)逐漸被其他方法所淘汰。

二、信號(hào)放大技術(shù)

1.第2代雜交捕獲法(HC2)：2003年獲得FDA批準(zhǔn)，是第一種得到FDA批準(zhǔn)的臨床HPV檢測(cè)方法。可用于新鮮宮頸細(xì)胞標(biāo)本，也可用于甲醛溶液固定、石蠟包埋的組織[1]。該法檢測(cè)18種HPV亞型，包括13種HR HPV亞型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)和5種LR HPV亞型(6、11、42、43、44)[1]。

其基本原理是將標(biāo)記好的與不同亞型HPV DNA互補(bǔ)的混合RNA探針和變性的單鏈靶HPV-DNA雜交，再轉(zhuǎn)移至錨定了可以與特定的HPV-DNA和RNA雜交物相結(jié)合的捕獲抗體的微孔板上，洗脫背景后，通過抗體共軛結(jié)合堿性磷酸酶和化學(xué)發(fā)光底物，得到陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。

優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)本處理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，敏感度高(87%～96%)，最低可以檢出0.2～1.0pg/ml的HPV DNA，相當(dāng)于1000～5000個(gè)拷貝的HPV DNA。可以判斷高危/低危亞型，也可以對(duì)病毒負(fù)荷進(jìn)行半定量。缺點(diǎn)是費(fèi)用較高；并且不能區(qū)分具體的HPV亞型；特異性相對(duì)較低(20%～85%)[1, 2]。由于交叉反應(yīng)的問題，假陽(yáng)性率約為10%～19%。另外沒有內(nèi)對(duì)照。在很多國(guó)家，HC2被廣泛用于臨床作為標(biāo)準(zhǔn)化的HPV檢測(cè)方式。最近新一代的hybrid capture 3 (HC3)自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)也已經(jīng)出現(xiàn)，仍是檢測(cè)13種HR-HPV亞型,但降低了非特異性的檢測(cè)結(jié)果，減少了假陽(yáng)性的發(fā)生。

2.cervista HPV HR檢測(cè)和cervista HPV 16/18檢測(cè)試劑盒：是FDA于2009年批準(zhǔn)的臨床HPV檢測(cè)方法[1]?；驹硪彩遣捎玫男盘?hào)放大技術(shù)檢測(cè)核酸序列，具體是通過其專利的兩個(gè)同步等溫反應(yīng)和信號(hào)放大反應(yīng)檢測(cè)特定的核酸序列，同時(shí)檢測(cè)人組蛋白2基因作為內(nèi)對(duì)照，從而更好地消除假陰性的結(jié)果。

cervsita HPV HR試劑盒檢測(cè)14種HR HPV(在HC2檢測(cè)的13種亞型基礎(chǔ)上增加了HPV66)。初始版本的cervista試劑盒有很多需要手工操作的步驟，不適用于大批量標(biāo)本的檢測(cè)。2009年11月后出現(xiàn)了全自動(dòng)操作版本，敏感度和特異性與HC2檢測(cè)相當(dāng)。在CIN Ⅱ和CIN Ⅲ標(biāo)本中，敏感度分別高達(dá)98%和100%[15]。這種試劑盒設(shè)計(jì)的目的是用來快速區(qū)分高危和低危亞型HPV感染，但不區(qū)分具體是哪一種或者哪幾種亞型的感染。cervista HPV 16/18試劑盒采用的同樣的檢測(cè)技術(shù)，但可以并只能區(qū)分HPV16/18亞型。這是FDA批準(zhǔn)的第一種HPV基因分型檢測(cè)方法，相比cervista HPV HR試劑盒有更好的敏感度，更低的假陽(yáng)性率。通常作為一種隨訪檢查手段和cervsita HPV HR配合應(yīng)用[1]。

三、核酸擴(kuò)增及衍生技術(shù)

1.普通聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)：一般認(rèn)為，PCR技術(shù)有高敏感度、高特異性的特點(diǎn)，簡(jiǎn)便快速，臨床應(yīng)用廣泛[6]。如果選擇針對(duì)HPV基因組保守序列的引物，比如L1區(qū)序列，可以同時(shí)擴(kuò)增多種HPV。然后進(jìn)一步采用RFLP、線性探針檢測(cè)或者直接測(cè)序等手段進(jìn)一步區(qū)分亞型。也可以開始就采用亞型特異性的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以免去第二步分型的步驟。

PCR的缺點(diǎn)：如果有多種亞型感染，不同亞型的HPV DNA在擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)引物競(jìng)爭(zhēng)，這樣含量較少的HPV亞型就可能競(jìng)爭(zhēng)失敗，出現(xiàn)假陰性的檢測(cè)結(jié)果。因?yàn)榇嬖谶@個(gè)問題，PCR可能無法檢測(cè)出標(biāo)本中所有的被感染的HPV亞型。進(jìn)一步測(cè)序需進(jìn)行亞型分析，操作較繁瑣。如果直接用亞型特異性引物，可省掉進(jìn)一步分型的步驟，但需要對(duì)目標(biāo)亞型一一檢測(cè)。PCR檢測(cè)可以用于新鮮標(biāo)本，也可以用于石蠟包埋的標(biāo)本，但是甲醛溶液固定會(huì)導(dǎo)致DNA降解，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.巢式PCR: 是用第一輪PCR的產(chǎn)物為底物模板，進(jìn)行第二輪PCR。這種PCR比傳統(tǒng)PCR的敏感度顯著提高，并且節(jié)省標(biāo)本；但是另一方面，操作也比較繁瑣，需要更多的試劑，也更昂貴。主要缺點(diǎn)是標(biāo)本間容易出現(xiàn)交叉污染，從而大大降低其臨床應(yīng)用的價(jià)值[1]。

3.聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段多態(tài)性(polymerase chain reaction -restricted fragment length polymorphisms，PCR-RFLP): 是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶消化成為若干大小不一的片段，然后電泳并對(duì)照參照物區(qū)分亞型。常用的內(nèi)切酶包括PstⅠ、HaeⅢ、DdeⅠ和RsaⅠ，可區(qū)分17種HR-HPV和11種LR-HPV[7]。這種方法和基因芯片檢測(cè)比較，敏感度稍差，可用作HPV初篩檢測(cè)。但對(duì)HPV多重亞型感染的檢出不理想，檢出率只有25%(20/80)。操作比測(cè)序容易，也更經(jīng)濟(jì)，不需要復(fù)雜的設(shè)備，因此適合資源欠缺地區(qū)對(duì)HPV進(jìn)行分型檢測(cè)。

4.反向線性點(diǎn)雜交技術(shù)(reverse line-blot assay，RLB)：這種技術(shù)是把寡核苷酸探針固定在固相尼龍膜上，PCR產(chǎn)物加入液相，以檢測(cè)有信號(hào)的產(chǎn)物。其優(yōu)勢(shì)在于可快速進(jìn)行亞型分型檢測(cè)。并在檢測(cè)HPV陽(yáng)性標(biāo)本時(shí)，與HC2法有很高的一致性。缺點(diǎn)是比較耗時(shí)、操作繁瑣[8]。甲醛溶液固定的標(biāo)本往往出現(xiàn)DNA的降解，會(huì)影響檢測(cè)，不宜直接用RLB法檢測(cè)[8]。

5.線陣檢測(cè)法(linear array，LA)：是Roche公司將廣譜PCR和反向線點(diǎn)雜交技術(shù)結(jié)合，發(fā)明的一種新的HPV分型檢測(cè)技術(shù)?？梢詸z測(cè)36種高危和低危HPV亞型。缺點(diǎn)是溫育步驟比較繁瑣、耗時(shí)。2006年Matthew等對(duì)這種方法進(jìn)行了改良，用干風(fēng)溫育代替了水浴，而檢測(cè)結(jié)果的敏感度和特異性都不受影響。但由于交叉非特異性雜交的存在，線陣分析的假陽(yáng)性率高于PCR檢測(cè)方法。

6.APTIMA HPV檢測(cè)技術(shù)：是FDA于2011年批準(zhǔn)的一種基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增和探針雜交的HPV檢測(cè)，包括3個(gè)步驟： 靶基因捕獲、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增、雜交保護(hù)檢測(cè)擴(kuò)增的產(chǎn)物[1]。它有自帶的內(nèi)對(duì)照，通過高度自動(dòng)化的步驟同時(shí)檢測(cè)14種高危亞型的E6/E7 mRNA，是比較少見的不以HPV的L1區(qū)為靶標(biāo)、不直接檢測(cè)HPV DNA的檢測(cè)方法。它只得到一個(gè)HR-HPV合并陽(yáng)性或者陰性的結(jié)果，不能區(qū)分亞型[9，10]。其敏感度與HC2以及后文提到的cobas HPV檢測(cè)相似，但特異性更好[1，9，11]。HR-HPV引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化主要通過E6/E7區(qū)基因，以其為靶區(qū)也提高了篩查HR-HPV的特異性和敏感度。

7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR及衍生技術(shù)：這類方法不但能檢出具體的HPV亞型，而且可以對(duì)病毒負(fù)載量進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)是敏感、快速、可靠，特異性也很好。與HC2檢測(cè)有很高的一致性(91.4%～98.0%)[12]。如果采用不同熒光，可以同時(shí)檢測(cè)不同的HPV亞型。此類方法例如美國(guó)FDA于2011年批準(zhǔn)的cobas 4800 HPV檢測(cè)，就是一種高度自動(dòng)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[1]。cobas檢測(cè)以HPV的L1區(qū)為靶區(qū)，以β球蛋白基因作為內(nèi)對(duì)照。此類方法的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)成本低，用時(shí)也比較短，僅需約2.5h[13]。由于不同HPV高危亞型的致癌潛力不同，因此HPV分型檢測(cè)技術(shù)得到越來越多的關(guān)注。cobas HPV可以檢測(cè)14種HR-HPV，并對(duì)16 和18亞型可以進(jìn)行特異性的基因分型。

基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的HPV檢測(cè)方法還有很多，例如Anyplex Ⅱ HPV28檢測(cè)試劑盒可以檢測(cè)19種HR-HPV和9種LR-HPV[12]。AdvanSure HPV GenoBlot 檢測(cè)方法是近年來發(fā)展的另一種熒光定量PCR技術(shù)[14]。它采用單管巢式非對(duì)稱實(shí)時(shí)PCR，通過擴(kuò)增HPV L1區(qū)和反向雜交，后續(xù)采用AdvanSure GenoLine Station系統(tǒng)自動(dòng)分析PCR陽(yáng)性的標(biāo)本，可以同時(shí)檢測(cè)20種高危HPV亞型(16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、69、70、73和82)和15種低危HPV亞型(6、11、32、34、40、42、43、44、54、55、57、61、62、81和83)。這種方法和HC2的檢測(cè)一致性高達(dá)98.5%，并且有更高的特異性[14]。

8.基因芯片技術(shù)：是將PCR產(chǎn)物和基因芯片雜交，經(jīng)過洗脫步驟后，雜交的信號(hào)用專用的芯片掃描儀讀出，常用ADAT1基因作為內(nèi)對(duì)照[15]。該法比普通的凝膠電泳檢測(cè)方法的敏感度和特異性更高，敏感度接近100%，特異性達(dá)到97.4%。可以分型檢測(cè)，也適合大量標(biāo)本平行分析。與HC2相比，在檢測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤變2級(jí)的標(biāo)本時(shí)，敏感度和特異性相似，并在HPV陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)上有很高的一致性[16]。缺點(diǎn)是必須先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，芯片比較昂貴，檢測(cè)需要商業(yè)化的基因芯片掃描儀，檢測(cè)成本較高[16]。

9.下一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)：和一般測(cè)序不同，NGS可以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行平行大批量測(cè)序，提供很多其他檢測(cè)方法不能提供的信息，不僅包括病毒亞型、負(fù)荷量，還可以檢測(cè)細(xì)胞染色體DNA水平的損害，例如HPV DNA的整合、插入位點(diǎn)等，但是檢測(cè)試劑比較昂貴，設(shè)備比較復(fù)雜，對(duì)操作人員的知識(shí)水平要求也比較高[17,18]。近年來Helicos Biosciences公司開發(fā)的基于Illumina平臺(tái)的NGS與其他平臺(tái)相比，大大降低了費(fèi)用，并且檢測(cè)效率大大提高，目前已經(jīng)得到了很多臨床實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可[1,19,20]。

10.Xpert HPV檢測(cè): 是近年來開發(fā)的一種新的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。其擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，采用全自動(dòng)工作流程，并且反應(yīng)體系完全內(nèi)部質(zhì)控，無需外部對(duì)照?？梢詫?duì)14種HR-HPV亞型分型檢測(cè)，并可以提供病毒負(fù)荷量信息[21]。除了新鮮細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，也可用于甲醛溶液固定的標(biāo)本[22]。與HC2比較，其敏感度稍強(qiáng)而特異性稍差，二者檢測(cè)結(jié)果有非常好的一致性。并且此種方法成本低、操作更為迅速，一般1h左右即可，便于大批量處理標(biāo)本，也可以隨時(shí)進(jìn)行任意檢測(cè)而無需批次檢測(cè)[22]。雖然目前還沒有得到FDA的認(rèn)定，但是很多研究者認(rèn)為這是將來很有前景的一種HPV檢測(cè)技術(shù)[21,23]。

四、生物化學(xué)檢測(cè)方法

1.質(zhì)譜分析法 (mass spectrometry)：可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大批量的臨床標(biāo)本，是一種快速、可靠、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法[24]。其快捷程度可以與基因芯片檢測(cè)方法相比。敏感度和特異性均優(yōu)于HC2,并且可以用于甲醛溶液固定、石蠟包埋的組織標(biāo)本的檢測(cè)，可以檢測(cè)各種高危和低危亞型HPV。既可以檢測(cè)L1區(qū)，也可以檢測(cè)E6/E7區(qū)。

2.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS): 是最近出現(xiàn)的一種軟電離質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，通過檢測(cè)HPV的蛋白質(zhì)指紋圖譜，并與質(zhì)譜圖庫(kù)對(duì)比，做出快速的檢測(cè)。它同時(shí)檢測(cè)14種HR-HPV, 比PCR基因測(cè)序檢測(cè)更敏感，易于大批量自動(dòng)化檢測(cè)，并且快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確，適合HPV的初篩。

3.表面等離子共振技術(shù)(surface plasmon resonance, SPR): 其原理是物質(zhì)間的相互作用導(dǎo)致芯片表面質(zhì)量變化，從而對(duì)HPV進(jìn)行分型檢測(cè)。優(yōu)勢(shì)在于快速、免標(biāo)記、高通量、高靈敏，并可進(jìn)行定量和亞型分析。它可以檢測(cè)16種HR-HPV和8種LR-HPV。研究表明其敏感度與HC2相似，而且特異性更高(53.33% vs 33.33%)。

五、展 望

HPV是公認(rèn)的4種致癌微生物之一，也是IARC認(rèn)定的11個(gè)一類致癌生物因子之一。對(duì)其感染進(jìn)行早期和正確的診斷，無疑對(duì)于宮頸癌及其他HPV相關(guān)惡性腫瘤的預(yù)防及診治有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值[25]。由于HPV不能培養(yǎng)，準(zhǔn)確的診斷完全取決于適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)檢測(cè)技術(shù)。目前市場(chǎng)上的HPV檢測(cè)藥盒有數(shù)百種之多，采用不同的檢測(cè)方法，有不同的檢測(cè)敏感度、特異性和標(biāo)本及臨床適用性。根據(jù)具體的檢測(cè)目的、要求、標(biāo)本狀況等因素選擇適當(dāng)?shù)腍PV檢測(cè)技術(shù)是得到滿意結(jié)果的保證。要得到一個(gè)同時(shí)具有高敏感度和高特異性的檢查方法，理論上來說是互相矛盾的。每種HPV檢測(cè)方法都有其優(yōu)勢(shì)和不足，總有一種或幾種合適的選擇。通過了解不同的檢測(cè)手段，根據(jù)不同的檢測(cè)要求，合理的權(quán)衡比較，選擇正確的檢測(cè)方法，一定會(huì)得到有效、經(jīng)濟(jì)、理想的結(jié)果。