自噬在急性胰腺炎中作用機制的研究進展

張 玲，張海丹，趙 婧，肖丹陽，李培武

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急診科,蘭州730030)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是指多種病因?qū)е乱鹊鞍酌冈せ睿^以胰腺局部炎癥性反應(yīng)為主要特征、可伴有全身炎癥反應(yīng)綜合征和(或)多臟器功能衰竭等嚴重并發(fā)癥的自身消化性疾病，其起病急、病情重、并發(fā)癥多。近年來，AP的發(fā)病率呈上升趨勢，總體病死率為5%～10%[1]。經(jīng)多年研究，胰蛋白酶原的病理性激活和隨后的胰腺組織自我消化性損傷已成為對AP的認識基礎(chǔ)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶原的異常激活及其酶原顆粒的形態(tài)學(xué)變化與自噬活性有關(guān)[4]。同時，研究顯示自噬受損是AP中突出的病理事件，與胰酶的異常激活密切相關(guān)[5]。此外，腺泡細胞中自噬溶酶體大量積累，表現(xiàn)為溶酶體標志物微管相關(guān)輕鏈蛋白3(light chain 3 protein，LC3)和p62水平增加[6]。此時，因受損的線粒體清除障礙、氧化應(yīng)激以及核因子κB途徑的激活，導(dǎo)致大量活性氧類積累，進一步加重胰腺損傷[7]。相反，Wan等[8]研究顯示，自噬抑制劑(3-甲基腺嘌呤)抑制或糾正細胞異常自噬后能顯著降低胰酶活性、組織損傷的嚴重程度以及細胞因子水平，并能改善預(yù)后?？傊?，生理性自噬或高效自噬可能保護或減輕胰腺組織免受應(yīng)激性損傷，而異常自噬可引起胰蛋白酶原異?；罨?、促進胰腺的級聯(lián)反應(yīng)。現(xiàn)就自噬在AP中作用機制的研究進展予以綜述。

1 自噬概述

1962年Ashford和Porter[9]在肝細胞中首次發(fā)現(xiàn)細胞自噬。它是一種將細胞內(nèi)受損的細胞器和大分子物質(zhì)運送至溶酶體進行降解的細胞“清除”過程，是細胞對外來刺激做出的防御反應(yīng)，受自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，Atg) 的介導(dǎo)，受生長因子、營養(yǎng)素、能量供應(yīng)、細胞因子和感染等多種自噬信號的調(diào)節(jié)[10]。根據(jù)降解物的不同，自噬執(zhí)行不同的功能，包括質(zhì)量控制(線粒體自噬)，病原體清除(蟲噬)和能量供應(yīng)/代謝控制(脂噬)[11]。自噬發(fā)生有四大關(guān)鍵步驟：自噬的誘導(dǎo)；自噬小體的形成；自噬溶酶體的形成；內(nèi)容物的降解。以上四步缺一不可。在大多數(shù)細胞中，自噬是一種重要的保護機制，能使細胞存活并適應(yīng)環(huán)境條件的改變。生理條件下，細胞內(nèi)出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)并包裹多余的蛋白質(zhì)和細胞器形成自噬小體，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，將內(nèi)容物降解為氨基酸和非酯化脂肪酸供細胞再利用[12]。當細胞發(fā)生感染等各類應(yīng)激時，損傷相關(guān)分子模式和病原體相關(guān)分子模式通過Toll樣受體4或Toll樣受體9激活核因子κB、促分裂原活化的蛋白激酶等信號通路直接調(diào)控自噬相關(guān)蛋白的表達，或通過蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路誘導(dǎo)自噬的激活，從而執(zhí)行其降解及清除功能[13]?？傊允赏ㄟ^更新細胞內(nèi)老化物質(zhì)以維持細胞穩(wěn)態(tài)，是一種重要的細胞活動。

1.1自噬分類 根據(jù)與溶酶體的作用關(guān)系，自噬可分為巨自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬和微自噬[14]。其中巨自噬是真核細胞主要的降解途徑，既能緩解細胞應(yīng)激反應(yīng)又能提供細胞生物發(fā)生的基本物質(zhì)，故通常稱為自噬[15]。根據(jù)降解底物的不同可分為選擇性自噬和非選擇性自噬，其中自噬主要是指非選擇性降解系統(tǒng)[16]；分子伴侶介導(dǎo)的自噬通過熱激蛋白70調(diào)控一種選擇性降解系統(tǒng)；而微自噬兼選擇性和非選擇性降解功能[17]。

1.2自噬蛋白 誘導(dǎo)自噬的4大關(guān)鍵步驟是相繼發(fā)生的，其中自噬誘導(dǎo)至自噬小體形成過程中涉及自噬標記蛋白的產(chǎn)生，目前最常用的有LC3(主要指LC3Ⅱ或LC3Ⅱ/Ⅰ比值)和Beclin-1，在自噬體膜的形成和延伸中起關(guān)鍵作用[6，18]。此外，自噬小體本身又被用于監(jiān)測自噬活性。

1.2.1LC3 LC3是與細胞微管的功能部位緊密結(jié)合的可溶性胞質(zhì)蛋白，有兩種存在形式，即LC3-Ⅰ(胞質(zhì)型)和LC3-Ⅱ(膜結(jié)合型)，其中LC3-Ⅰ由LC3前體裂解而來，并進一步轉(zhuǎn)化成LC3-Ⅱ，成為自噬小體膜結(jié)合蛋白[19-20]。研究顯示，在自噬信號作用下，LC3-Ⅰ通過與Atg7、Atg3、Atg10和Atg12-5-16L泛素樣系統(tǒng)的結(jié)合作用，與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ，然后被募集到分離膜上參與自噬過程[21]。據(jù)報道，LC3-Ⅱ是第一個發(fā)現(xiàn)的與自噬體膜特異性結(jié)合的哺乳動物類蛋白，參與自噬體對蛋白的靶向識別和包裹，起到自噬膜的形成、延伸以及閉合作用，通常用來監(jiān)測自噬[18]。Wu等[21]研究顯示大鼠LC3與酵母Apg8/Aut7 /Cvt5(Atg8)具有28%的氨基酸同源性，這也是酵母發(fā)生自噬的關(guān)鍵因素。LC3存在于自噬體內(nèi)、外膜上，對于自噬體的成熟必不可少，是監(jiān)測自噬活性的主要指標之一[22]。

而哺乳動物Beclin-1是酵母Atg6和液泡分選蛋白30基因的同源物，主要存在于反面高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體膜上，在自噬小體膜形成的早期階段起至關(guān)重要的作用，也是用來監(jiān)測細胞自噬的主要蛋白[23]。

1.2.2自噬小體在各類應(yīng)激誘導(dǎo)自噬發(fā)生期間，胞質(zhì)中首先出現(xiàn)囊狀雙層分隔膜(主要包含質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等)在異常物質(zhì)(異常蛋白質(zhì)、受損細胞器及病原體)周圍形成、延伸，并將其隔離并包裹形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體[24]。隨后自噬小體將內(nèi)容物運送至溶酶體，通過與內(nèi)涵體的融合經(jīng)歷自噬體成熟過程后再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，執(zhí)行降解功能[25]。需要注意的是，自噬小體本身不具備降解功能，只有與溶酶體融合形成自噬溶酶體后才能降解并清除異常物質(zhì)。

2 自噬與AP的關(guān)系

自噬過程廣泛存在于生物體內(nèi)，且高度復(fù)雜，在各類應(yīng)激狀態(tài)下其作用更為顯著。自噬可能是各種應(yīng)激因素引起AP的最后共同通路之一[26-27]。研究顯示，胰腺腺泡細胞內(nèi)的自噬空泡或自噬小體含有胰蛋白酶原顆粒，是AP早期的主要病理學(xué)特征，并與AP預(yù)后密切相關(guān)。關(guān)于人類AP的早期報道中就提到了腺泡細胞具有自噬特征的超微結(jié)構(gòu)[28]。Yu等[29]在大鼠AP中也觀察到腺泡中囊泡結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出典型的自噬樣形態(tài)。據(jù)報道，生理性自噬并不觸發(fā)AP的病理性進展[30]，此外，自噬溶酶體還可以清除異常激活的胰蛋白酶，從而保護胰腺組織損傷[4]。這一結(jié)果與理論意義上自噬作為一種細胞清除過程、執(zhí)行異常物質(zhì)的降解功能是相符的。因此，正?；蛏硇宰允刹粫又谹P的病理性損傷，而是通過發(fā)揮其本質(zhì)作用以清除胰腺腺泡細胞內(nèi)的異常蛋白質(zhì)和受損細胞器(尤其是線粒體)，減輕胰腺腺泡細胞的各類應(yīng)激性損傷，同時還有助于維持胰腺的外分泌功能[31]。然而，當自噬功能失代償后，便出現(xiàn)異常自噬，此時，自噬反而加重AP的病理性損傷，增加AP病死率。

2.1異常自噬加重AP的病理性損傷 Mareninova等[6]研究表明胰蛋白酶原過早激活與胞質(zhì)空泡的異常積累是AP的兩個關(guān)鍵表現(xiàn)。Resau等[32]在1985年提出AP胰腺實質(zhì)的變化包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、高爾基復(fù)合體囊泡形成和自噬空泡的異常堆積。Diakopoulos等[33]通過敲除Atg5基因構(gòu)建自噬受損小鼠模型，發(fā)現(xiàn)自噬在胰腺的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，同時發(fā)現(xiàn)異常自噬是引起AP病理損傷的關(guān)鍵點。此外，Liu等[34]通過精氨酸誘導(dǎo)大鼠AP模型發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細胞內(nèi)胰蛋白酶原的活化可能與自噬通量受損有關(guān)，表明自噬受損可引起AP嚴重的病理反應(yīng)、加重胰腺的自身消化性損傷。Yang等[7]研究表明，腺泡細胞中自噬小體的異常聚集是導(dǎo)致急性壞死性胰腺炎的關(guān)鍵病理反應(yīng)。同時，有研究特別表明自噬通量受損不僅介導(dǎo)胞質(zhì)空泡化，還介導(dǎo)胰腺的特征性反應(yīng)，即腺泡內(nèi)胰蛋白酶活性增加，表明異常自噬有助于胰蛋白酶原的活化[16]。Lewinska等[35]、Wang等[36]在急性壞死性胰腺炎大鼠中發(fā)現(xiàn)自噬受損還與細胞凋亡密切相關(guān)，并將加重疾病的嚴重程度。

2.2自噬與胰蛋白酶原的活化 生理條件下，胰蛋白酶以非活性形式儲存于膜限制性的酶原顆粒中，到達十二指腸經(jīng)腸肽酶激活并相繼活化其他消化酶。胰蛋白酶原的病理性激活是AP的主要機制。研究已證實了AP時胰蛋白酶原的腺泡細胞內(nèi)激活機制[34]。AP期間出現(xiàn)自噬通量受損，引起自噬小體在胞質(zhì)內(nèi)大量堆積，此時自噬小體將胰蛋白酶原運送至溶酶體中被活化成有活性的胰蛋白酶，從而對腺泡細胞產(chǎn)生破壞性作用，表明AP時胰蛋白酶原的異?；罨c自噬通量受損密切相關(guān)[37]。此外，Ohmuraya和Yamamura[38]研究發(fā)現(xiàn)通過特異性敲除Atg5解除或糾正大鼠AP時的異常自噬后，胰腺組織的病理性損傷明顯減輕，同時胰蛋白酶原的活化程度被大大抑制，表明異常自噬參與胰蛋白酶原的活化。這一研究結(jié)果也得到了Hashimoto等[16]的證實。

另外，Dolai等[39]研究發(fā)現(xiàn)Syntaxin 2(即STX2，一種突觸融合蛋白，介導(dǎo)腺泡細胞頂端質(zhì)膜與酶原顆粒復(fù)合物參與的頂端胞吐作用[40])的缺失通過某種機制導(dǎo)致胰蛋白酶原被異位釋放而過早激活，引起胰腺自我消化性損傷，最終觸發(fā)AP。同時，Ravikumar等[41]研究表明STX2的缺失通過增強自噬相關(guān)蛋白16樣1/網(wǎng)格蛋白重鏈-1復(fù)合物介導(dǎo)的質(zhì)膜基底外側(cè)胞吐作用而引起異常自噬。由此推測，STX2在異常自噬與胰蛋白酶原的異?；罨^程中具有潛在作用。

異常自噬引起胰蛋白酶原的活化機制至少有兩種途徑：溶酶體組織蛋白水解酶的失調(diào)；溶酶體相關(guān)膜蛋白的異常表達。Gukovsky等[42]研究表明，AP期間出現(xiàn)異常自噬的主要原因可能與溶酶體活性的改變有關(guān)，主要表現(xiàn)為組織蛋白酶加工損傷和成熟的組織蛋白酶數(shù)量減少。研究表明，在胰蛋白酶原的活化過程中組織蛋白水解酶L和組織蛋白水解酶B起到完全相反的作用，即前者可以使胰蛋白酶原和胰蛋白酶失去活性[43]，而后者有助于胰蛋白酶原向胰蛋白酶的活化[16]。Dennemarker等[44]通過敲除組織蛋白水解酶L基因后發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)自噬對胰蛋白酶原的降解水平顯著降低。當自噬受損后，成熟的組織蛋白水解酶L和組織蛋白水解酶B數(shù)量明顯減少、活性下降，且前者較后者下降更為顯著，比例失調(diào)，導(dǎo)致前者無法拮抗后者的作用，引起溶酶體中胰蛋白酶增多，自噬空泡數(shù)量異常堆積，觸發(fā)AP的病理性損傷[6]。Halangk等[45]通過敲除小鼠組織蛋白水解酶B基因，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)胰蛋白酶活性明顯降低，同時胰腺腺泡細胞的壞死量減少、組織壞死程度明顯減輕。胰蛋白酶原的過早或異常激活是AP發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)，提示AP期間細胞自噬功能受損是導(dǎo)致胰蛋白酶原異?；罨⒁认俳M織發(fā)生進一步損傷的可能原因。

2.3自噬與炎癥放大反應(yīng) AP的病理特征之一是胰腺腺泡細胞釋放大量細胞因子，如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、白細胞介素-2、白細胞介素-12、γ干擾素[46]等，其作用于Toll樣受體或啟動核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白信號通路，使核因子κB活化，進一步產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，引起組織炎性浸潤，導(dǎo)致局部或全身爆發(fā)性炎癥反應(yīng)，最終加重胰腺細胞壞死[47]。一般地，自噬作為一種細胞防御反應(yīng)，經(jīng)各類應(yīng)激的刺激和誘導(dǎo)參與各種病理生理反應(yīng)，其中自噬在感染與炎癥及免疫系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用尤為顯著，通過形成自噬溶酶體降解并清除炎性小體等異常物質(zhì)，減輕組織的炎性損傷。然而，當自噬功能受損后，其清除能力被大大削弱，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的清除率顯著降低，炎性小體過度堆積加重組織損傷[48]。自噬受損時p62得不到及時的降解，從而引起核因子κB的過度活化，釋放大量炎癥因子，其中腫瘤壞死因子-α又進一步誘導(dǎo)胰蛋白酶原激活，加重胰腺損傷?？梢姡珹P期間細胞自噬功能受損對胰腺細胞的損傷是雙重的。

3 小 結(jié)

AP是一類病因復(fù)雜的疾病，觸發(fā)AP的一個中心機制是胰蛋白酶原的異常激活。正?；蚧A(chǔ)水平的高效自噬主要通過自噬溶酶體執(zhí)行清除及降解細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)。而當細胞自噬異常時，不僅誘導(dǎo)胰蛋白酶原的異?；罨?，還使AP期間的炎癥反應(yīng)被逐一放大。近年來，雖然關(guān)于自噬對AP作用機制的研究已取得一定進展，但自噬功能受損與AP之間的因果關(guān)系尚未闡明。同時自噬作為一種細胞活動，是動態(tài)過程，在AP期間的自噬動力學(xué)尚不清楚。因此，自噬功能受損出現(xiàn)在AP哪個階段，以及出現(xiàn)自噬異常的具體機制有待進一步探索。此外，還需大量實驗研究揭示異常自噬被解除或糾正后的自噬狀態(tài)對胰腺細胞的影響以及AP時異常自噬的分子生物學(xué)機制。目前AP的治療還止步于液體復(fù)蘇、抗感染、對癥支持等綜合治療，而自噬這一概念的提出將為未來實現(xiàn)AP的特異性治療提供新的理論依據(jù)，同時，這對目前AP的對癥治療理念也是一種新挑戰(zhàn)。