NLRP6炎癥小體在腸道中的功能

魏 薇，牛冰玉，姚樹坤

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京100032； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029； 3.中日友好醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100029)

人體依靠固有免疫和適應(yīng)性免疫抵御病原體入侵，炎癥小體的活化及下游炎癥因子的分泌對(duì)固有免疫具有重要意義，并可將固有免疫與適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來[1]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)6是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)家族亞類NLRP之一，NLRs是一類模式識(shí)別受體。目前，較明確的NLRs功能包括以下3方面：①其中一組NLRs是炎癥小體的重要組成部分，可以調(diào)節(jié)胱天蛋白酶(caspase)1的活化和促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1β、IL-18的轉(zhuǎn)錄；②NLRs可參與常見細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控(如核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶通路)，從而影響下游細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)；③NLRs還可參與抗病毒免疫的調(diào)節(jié)[2]。以上3種功能均有NLRP6的參與，NLRP6在腸道黏膜宿主-菌群的相互作用中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)主要結(jié)合近年來NLRP6炎癥小體調(diào)控腸道菌群、改善腸屏障功能的相關(guān)研究，對(duì)腸道中NLRP6炎癥小體的功能予以綜述。

1 NLRP6炎癥小體結(jié)構(gòu)及NLRP6表達(dá)部位

NLRP6蛋白編碼基因位于人第11號(hào)染色體，N端為熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)，中間為核苷酸偶聯(lián)結(jié)構(gòu)域(NACHT/NOD)，C端為富含亮氨酸的重復(fù)序列。NLRP6可與caspase-1和含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD，ASC)通過PYD-PYD連接作用組成細(xì)胞內(nèi)多聚蛋白復(fù)合物，稱為NLRP6炎癥小體，N端的PYD為NLRP6炎癥小體組裝的核心結(jié)構(gòu)，其中的細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)可募集ASC的PYD[3]。NLRP6可在小鼠各器官表達(dá)，如膀胱、腎臟、肝臟、肺、十二指腸、回腸、盲腸和結(jié)腸等，其中在結(jié)腸肌成纖維細(xì)胞表達(dá)最高，其次為結(jié)腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、肥大細(xì)胞，此外，在外周巨噬細(xì)胞亦有少量表達(dá)[4-5]。而人體NLRP6主要在小腸表達(dá)[6]。

2 NLRP6炎癥小體在腸道中的功能

2.1NLPR6炎癥小體與腸道菌群的相互作用

2.1.1腸道菌群對(duì)NLRP6炎癥小體的激活作用 NLRP6炎癥小體的活化受腸道菌群調(diào)節(jié)，腸道菌群提供兩種激活信號(hào)：第一種為Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)配體，促進(jìn)炎癥小體成分和IL-18的轉(zhuǎn)錄；第二種包括一些微生物代謝物，如膽汁酸、氨基酸、組胺等；共生原生動(dòng)物也可調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞對(duì)IL-18的分泌，但目前機(jī)制尚不明確[2]。對(duì)圍生期大鼠和小鼠的研究顯示，微生物在腸道定植后，NLRP6炎癥小體成分及其下游炎癥因子 IL-18 表達(dá)上調(diào)，可見微生物可促進(jìn)NLRP6炎癥小體成分的轉(zhuǎn)錄及組裝[7-8]。

腸道菌群代謝產(chǎn)物方面，?；撬?、碳水化合物和長(zhǎng)鏈脂肪酸在野生型(wild type，WT)小鼠中較Asc-/-小鼠多，提示?；撬?、碳水化合物和長(zhǎng)鏈脂肪酸可能是NLRP6炎癥小體的激活劑，其中?；撬嵴T導(dǎo)IL-18的作用最強(qiáng)；相反，組胺和精胺在WT小鼠中較Asc-/-小鼠少，并導(dǎo)致腸道IL-18減少，提示組胺和精胺可能對(duì)NLRP6炎癥小體有抑制作用[8]。炎癥小體的活化導(dǎo)致caspase-1依賴的促炎細(xì)胞因子(IL-18)的分泌，可能以內(nèi)分泌的方式觸發(fā)細(xì)胞因子相應(yīng)受體，并促進(jìn)抗原提呈、共刺激分子上調(diào)及細(xì)胞因子釋放，最終刺激抗原特異T細(xì)胞和B細(xì)胞[9]。除微生物相關(guān)機(jī)制外，NLRP6炎癥小體成分的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)還與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，避水應(yīng)激建立動(dòng)物模型的血清促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素升高，小腸和結(jié)腸NLRP6表達(dá)降低，并出現(xiàn)腸道菌群改變以及腸道屏障功能降低[2,10-11]。

2.1.2NLRP6炎癥小體對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用 目前，支持NLRP6炎癥小體對(duì)腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)較多。Elinav等[4]研究顯示，NLRP6炎癥小體缺陷小鼠(Nlrp6-/-小鼠、Asc-/-小鼠、caspase-1-/-小鼠)糞便菌群中普氏菌屬和TM7菌屬增加，乳桿菌和厚壁菌門減少；與WT小鼠相比，NLRP6炎癥小體缺陷小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的右旋糖酐硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎、腸道IL-18水平下降；此外，與單獨(dú)飼養(yǎng)WT小鼠相比，與NLRP6炎癥小體缺陷小鼠共飼養(yǎng)的WT小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的DSS結(jié)腸炎，而共飼養(yǎng)后WT小鼠的糞便菌群與NLRP6炎癥小體缺陷小鼠類似，故推測(cè)WT小鼠DSS結(jié)腸炎的加重可能與腸道菌群的轉(zhuǎn)變相關(guān)，且NLRP6對(duì)腸道菌群的影響由IL-18介導(dǎo)，菌群失調(diào)導(dǎo)致CC類趨化因子配體5表達(dá)上調(diào)，募集更多免疫細(xì)胞，從而導(dǎo)致自發(fā)性腸道炎癥。此外，與WT小鼠相比，Nlrp6-/-和Asc-/-小鼠的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌更嚴(yán)重，菌群失調(diào)導(dǎo)致的 CC類趨化因子配體5增加亦有參與，可激活I(lǐng)L-6旁路，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖[12]；與單獨(dú)飼養(yǎng)WT小鼠相比，與Nlrp6-/-和Asc-/-小鼠共飼養(yǎng)WT小鼠的膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎更嚴(yán)重，肝臟中多種炎癥細(xì)胞顯著增加[13]。另有研究顯示，共飼養(yǎng)并不能使其他小鼠腸道菌群與Nlrp6-/-小鼠相近，但Nlrp6-/-小鼠存在菌群失調(diào)，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增加尤其明顯，菌群失調(diào)是DSS結(jié)腸炎加重的基礎(chǔ)[14]。由此可見，NLRP6炎癥小體對(duì)腸道菌群的組成有重要影響，具有減輕腸道炎癥的作用。

但有研究發(fā)現(xiàn)，Nlrp6-/-小鼠對(duì)單核李斯特菌、鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌的易感性減弱，感染上述菌群的Nlrp6-/-小鼠外周血中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞數(shù)量增加，核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶依賴的炎癥因子和趨化因子水平更高[15]。最近的研究亦顯示，Nlrp6-/-小鼠對(duì)單核李斯特菌的易感性減弱，單核李斯特菌產(chǎn)生的脂磷壁酸(由革蘭陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生)可結(jié)合NLRP6的C端富含亮氨酸的重復(fù)序列，并激活NLRP6；當(dāng)WT小鼠感染單核李斯特菌時(shí)，NLRP6與caspase-1、caspase-11形成復(fù)合物，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18；注射IL-18的Nlrp6-/-小鼠對(duì)單核李斯特菌的易感性增加，因此推測(cè)單核李斯特菌感染加重與巨噬細(xì)胞分泌IL-18有關(guān)，表明NLRP6炎癥小體可能對(duì)某些細(xì)菌感染有不利影響[16]。

近年來，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)研究條件更嚴(yán)格的限定進(jìn)一步加深了對(duì)NLRP6炎癥小體調(diào)節(jié)腸道菌群作用的認(rèn)識(shí)。Lemire等[17]研究發(fā)現(xiàn)，同窩出生WT小鼠與Nlrp6-/-小鼠(來源于Nlrp6+/-小鼠)的腸道菌群無明顯差異，且經(jīng)DSS處理后的結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸組織病理學(xué)、IL-18分泌情況亦無顯著差異，僅表現(xiàn)為雌性Nlrp6-/-小鼠體重下降更快，故認(rèn)為NLRP6 炎癥小體并不能調(diào)節(jié)腸道菌群，但這一結(jié)論對(duì)問題進(jìn)行了過度的簡(jiǎn)化，這種情況下還應(yīng)想到是否可能在環(huán)境中存在促發(fā)菌群失調(diào)的病原菌[18]。Galvez等[19]研究發(fā)現(xiàn)，遺傳和環(huán)境因素對(duì)菌群的影響超過基因表型的影響，且NLRP6對(duì)菌群組成的影響主要發(fā)生在病原菌入侵后，當(dāng)機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)且在無特定病原體環(huán)境中飼養(yǎng)時(shí)，WT小鼠和Nlrp6-/-小鼠菌群無明顯差異。據(jù)此推測(cè)，在黏膜破損等疾病狀態(tài)下(如炎癥性腸病)，腸道菌群的改變可能導(dǎo)致NLRP6炎癥小體活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，但無疾病狀態(tài)下的NLRP6炎癥小體并不干預(yù)菌群結(jié)構(gòu)。

2.2NLPR6炎癥小體與腸道病毒的相互作用Nlrp6-/-小鼠對(duì)腸道RNA病毒亦存在易感性，如腦心肌炎病毒和小鼠諾如病毒。NLRP6通過非炎癥依賴機(jī)制發(fā)揮抗RNA病毒作用，腸道上皮細(xì)胞的NLRP6 通過與RNA解旋酶Dhx15形成復(fù)合體結(jié)合病毒RNA，并激發(fā)線粒體抗病毒信號(hào)蛋白依賴的抗病毒途徑，促進(jìn) Ⅰ 型干擾素的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生抗病毒作用[20]。

2.3NLRP6炎癥小體對(duì)腸道屏障的影響 腸屏障對(duì)維持宿主內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用，腸道黏液、免疫球蛋白A、抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)、免疫細(xì)胞等均參與腸道菌群與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用[21]。屏障功能受損可能導(dǎo)致細(xì)菌脂多糖入血，出現(xiàn)代謝性內(nèi)毒素血癥，導(dǎo)致機(jī)體處于低度炎癥狀態(tài)，并可出現(xiàn)代謝綜合征，如肥胖、心血管疾病、胰島素抵抗[22-23]。

腸屏障可分為化學(xué)屏障和物理屏障，前者包括AMPs，后者包括黏液層、單層腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的緊密連接。腸道黏液層是抵御病原體入侵、保護(hù)上皮免受物理刺激的第一道屏障，其中發(fā)揮關(guān)鍵生理作用的成分為黏蛋白；結(jié)腸黏液層包括外層黏液層(結(jié)構(gòu)松散，其中包含菌群)以及內(nèi)層黏液層(緊附于上皮層，密布黏蛋白，可抵御細(xì)菌)；小腸黏液層缺乏明確的內(nèi)外層分界[24]。腸上皮的杯狀細(xì)胞可產(chǎn)生黏蛋白顆粒并分泌入腸腔形成黏液層。NLRP6炎癥小體可通過影響腸道黏液層、腸道AMPs、結(jié)腸黏膜修復(fù)來影響腸屏障功能。

2.3.1NLRP6炎癥小體對(duì)腸道黏液層的影響 NLRP6炎癥小體可能影響腸道黏液層的形成。 Wlodarska等[25]的研究顯示，杯狀細(xì)胞中存在NLRP6 表達(dá)，且Nlrp6-/-小鼠存在黏液顆粒釋放障礙，提示NLRP6可能參與黏液屏障的形成；Nlrp6-/-、Asc-/-或caspase-1-/-小鼠腸道未形成厚實(shí)連續(xù)的內(nèi)黏液層，而IL-18-/-小鼠腸道黏液層正常形成，表明黏液分泌需要NLRP6炎癥小體的介導(dǎo)，但不依賴NLRP6炎癥小體下游的炎癥因子IL-18。此外，Wlodarska等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP6缺乏可影響杯狀細(xì)胞中自噬體的形成。既往研究顯示，自噬對(duì)于潘氏細(xì)胞、破骨細(xì)胞和肥大細(xì)胞的分泌功能至關(guān)重要，故認(rèn)為 NLPR6 可通過影響杯狀細(xì)胞自噬而影響?zhàn)ひ悍置赱26-28]。Birchenough等[29]的研究識(shí)別了一種位于結(jié)腸隱窩入口處的“哨兵”杯狀細(xì)胞，這種細(xì)胞可通過激活TLR-髓樣分化因子88依賴的Nox/Duox活性氧合成下游的NLRP6炎癥小體，非特異性地吞噬TLR2/1、TLR4及TLR5配體并與之反應(yīng)，激發(fā)鈣離子依賴的MUC2分泌途徑，并形成細(xì)胞間信號(hào)，促使隱窩上部鄰近杯狀細(xì)胞分泌MUC2抵御細(xì)菌，且不依賴IL-18。與NLRP6炎癥小體對(duì)菌群的調(diào)節(jié)類似，“哨兵”杯狀細(xì)胞依賴NLRP6炎癥小體調(diào)節(jié)黏液層的途徑只在細(xì)菌入侵機(jī)體時(shí)發(fā)揮作用。

2.3.2NLRP6炎癥小體對(duì)腸道AMPs的影響 NLRP6炎癥小體對(duì)AMPs的分泌亦有調(diào)節(jié)作用。AMPs主要由潘氏細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生，包括 α防御素、β防御素、C型凝集素等，不同抗菌肽可針對(duì)不同菌群產(chǎn)生抗菌活性，對(duì)腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用[30]。AMPs中內(nèi)凝集素1、抵抗素樣分子β、血管生成素4的分泌受IL-18誘導(dǎo)，在無菌小鼠中基本無內(nèi)凝集素1、抵抗素樣分子β、血管生成素4表達(dá)，Nlrp6-/-小鼠和Asc-/-小鼠的內(nèi)凝集素1、抵抗素樣分子β、血管生成素4表達(dá)降低，提示這些抗菌肽的產(chǎn)生依賴于腸道菌群刺激NLPR6炎癥小體產(chǎn)生的IL-18[8]。

2.3.3NLRP6炎癥小體對(duì)結(jié)腸黏膜修復(fù)的影響 DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎建模過程中結(jié)腸NLRP6表達(dá)顯著降低，停用DSS后NLRP6表達(dá)逐漸增加，且結(jié)腸黏膜活檢后Nlrp6-/-小鼠的局部損傷修復(fù)速度較WT小鼠明顯減慢，表明NLRP6可促進(jìn)黏膜修復(fù)[5]。NLRP6炎癥小體對(duì)黏膜修復(fù)的促進(jìn)可能與IL-18相關(guān)；IL-22在結(jié)腸上皮細(xì)胞的修復(fù)過程中有重要作用，IL-22結(jié)合蛋白可使IL-22失效，而 NLRP6 炎癥小體可通過IL-18依賴的途徑下調(diào)IL-22 結(jié)合蛋白水平[31]。此外，NLRP6對(duì)DSS相關(guān)結(jié)腸炎的保護(hù)作用還與Ly6Chi炎癥單核細(xì)胞相關(guān)，DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎存在Ly6Chi炎癥單核細(xì)胞浸潤(rùn)，其中NLRP6表達(dá)上調(diào)，將WT小鼠的Ly6Chi炎癥單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移給Nlrp6-/-小鼠，后者腸屏障功能顯著好轉(zhuǎn)、腸道損傷顯著減輕[32]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Nlrp6-/-小鼠結(jié)腸損傷部位周圍的上皮細(xì)胞增殖更明顯，與細(xì)胞增殖有關(guān)的分子酪蛋白激酶1ε和SMARCC1(SWI/SNF家族成員)的轉(zhuǎn)錄水平亦提高，提示缺乏NLRP6可能導(dǎo)致結(jié)腸黏膜損傷后的病理性增殖，并與結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)[5]。

2.4NLRP6炎癥小體在腸道疾病中的作用 腸道中NLRP6炎癥小體的重要作用已引起研究者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，某些腸道疾病中存在腸道NLRP6 的異常表達(dá)，如先天性巨結(jié)腸患者結(jié)腸NLRP6 表達(dá)顯著下降[33]；炎癥腸病患者結(jié)腸 NLRP6 表達(dá)隨病情活動(dòng)度的增加而升高[34]；Chen等[35]發(fā)現(xiàn)，NLRP6缺陷小鼠對(duì)結(jié)腸炎相關(guān)癌變的易感性增強(qiáng)，這與血清和結(jié)腸IL-18水平下降有關(guān)；Zhao等[36]發(fā)現(xiàn)，腸易激綜合征模型小鼠結(jié)腸NLRP6的表達(dá)低于正常小鼠，丁酸梭菌通過對(duì)NLRP6 的作用抑制結(jié)腸黏膜低度炎，可能對(duì)腸易激綜合征的內(nèi)臟超敏反應(yīng)發(fā)揮有益作用。

目前與NLRP6相關(guān)的絕大多數(shù)研究為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，相關(guān)人體的研究較少，某些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論可能與人體并不符合，因此應(yīng)謹(jǐn)慎看待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的一些機(jī)制和結(jié)論。如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示NLRP6與結(jié)直腸癌相關(guān)，但結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和癌旁2 cm以上正常結(jié)腸黏膜的NLRP6 RNA轉(zhuǎn)錄水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[37]。NLRP6炎癥小體對(duì)腸道菌群及腸道屏障均有調(diào)節(jié)作用，故需進(jìn)一步探究其在腸道炎癥性疾病、腸道腫瘤、肝膽系疾病、代謝綜合征等疾病中的作用。此外，NLRP6炎癥小體的活化亦與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素相關(guān)，而下丘腦-垂體-腎上腺軸在腦-腸互動(dòng)中有重要作用，因此NLRP6炎癥小體與應(yīng)激相關(guān)疾病(如腸易激綜合征)的關(guān)系也需要進(jìn)一步的研究。

3 結(jié) 語(yǔ)

NLRP6炎癥小體與腸道微生物間存在相互作用，腸道菌群、病毒對(duì)NLRP6炎癥小體有激活作用。當(dāng)病原菌侵入腸屏障時(shí)，NLRP6炎癥小體可發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，NLRP6炎癥小體亦可結(jié)合病毒RNA、促進(jìn)干擾素基因表達(dá)；此外，NLRP6 炎癥小體還可促進(jìn)腸道黏液的分泌，部分抗菌肽的產(chǎn)生也依賴于NLRP6炎癥小體。腸黏膜損傷后，NLRP6炎癥小體可促進(jìn)黏膜修復(fù)，同時(shí)抑制修復(fù)過程中的病理性增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是疾病機(jī)制探究的重要工具，目前DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型在NLRP6炎癥小體相關(guān)研究中的應(yīng)用較多，今后可考慮應(yīng)用其他疾病動(dòng)物模型進(jìn)行相對(duì)廣泛的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。目前，關(guān)于NLRP6炎癥小體對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)的研究結(jié)論并不完全一致，腸道菌群與遺傳、性別、年齡、飲食、環(huán)境、應(yīng)激等多種因素密切相關(guān)，故應(yīng)注意控制研究中的干擾因素，以得到更為可靠的結(jié)論。