李瀚文,季暉,胡慶華
(中國藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室,江蘇 南京 210009)
1929年,Drury和Sze-Gy?rgyi在研究腺苷(adenosine)和腺苷一磷酸(adenosine S′-monophosphate)時首次報道了嘌呤能夠引起血管舒張、心跳減慢等生理反應(yīng)。1953年Holton等觀察到神經(jīng)末梢在一定情況下可以釋放出ATP,在此之前人們一直認(rèn)為ATP僅是機體儲存和供應(yīng)能量的物質(zhì),這次發(fā)現(xiàn)讓人們意識到 ATP可能也起到神經(jīng)遞質(zhì)的作用。1972年,Burnstock在實驗的基礎(chǔ)上提出了“嘌呤能神經(jīng)學(xué)說”,1976年,Burnstock再次提出存在一個獨特的嘌呤能受體家族[1]。不斷的研究證明ATP作為一種重要的胞外信號分子,可以與細(xì)胞膜上的嘌呤受體結(jié)合,參與細(xì)胞功能的調(diào)控,影響一系列生物學(xué)進(jìn)程。
根據(jù)內(nèi)源性激動劑的不同,Burnstock將嘌呤受體分為腺苷受體P1和核苷酸受體P2兩個家族[2]。腺苷受體P1家族的內(nèi)源性激動劑為腺苷,且對黃嘌呤敏感。核苷酸受體P2家族受體內(nèi)源性激動劑是胞外核苷酸分子,包括ATP、UTP、ADP、UDP及其衍生物,不被黃嘌呤衍生物阻斷。P2受體則細(xì)分為配體門控離子通道型P2X和G蛋白偶聯(lián)代謝型P2Y。P2X亞族目前已克隆出7種亞型:P2X1-7,它們以同源或異源三聚體的形式構(gòu)建配體門控離子通道,與ATP結(jié)合后可非選擇性通過鈣離子Ca2+、鈉離子Na+或鉀離子K+。P2Y型受體屬于A類視紫紅質(zhì)樣GPCRs,在哺乳動物中克隆出了8種亞型:P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13、P2Y14。
除了P2Y11,P2Y受體編碼序列均不含有內(nèi)含子,這一點與P2X亞族恰好相反。P2Y受體一級序列通常由308-379個氨基酸殘基組成,糖基化后相對分子量約為41-53kDa。P2Y受體是一種典型的GPCRs,結(jié)構(gòu)上具有胞外的糖基化N-末端、3個胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(intracellular loops,ELs)和3個胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)(extracellular loops ELs)連接的特征性的7個疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain,TMD)、以及1個具有蛋白激酶結(jié)合序列的胞內(nèi)C-末端。不同亞型間N、C末端具有明顯差別。
根據(jù)偶聯(lián)蛋白,人P2Y受體可以分為兩類。第一類Gq蛋白偶聯(lián)型受體主要包括P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11,它們主要通過Gq/11蛋白傳遞信號,活化磷脂酶Cβ(phospholipase Cβ,PLC),磷脂酶Cβ可以將磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯(PIP2)水解為三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)。IP3和DAG作為第二信使分別介導(dǎo)胞內(nèi)儲存的鈣離子釋放和活化蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),從而刺激不同的信號通路:PKC可促使膜結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)蛋白磷酸化,還可激活蛋白激酶通路(mitogen-activated protein kinase signaling pathway,MAPK)或胞外信使調(diào)節(jié)的激酶通路(extracelluar regulated protein kinase,ERK)。第二類Gi蛋白偶聯(lián)型受體主要有P2Y12、P2Y13和P2Y14,它們更傾向于通過Gi/o蛋白傳遞信號,抑制腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)活性和降低3′,5′-環(huán)腺苷一磷酸(3′,5′-cyclic adenosine monophosphate,cAMP)。
事實上,P2Y受體信號系統(tǒng)十分復(fù)雜。P2Y受體能與其他第二信使系統(tǒng)偶合:P2Y2可與G0和G16偶合,P2Y11可與Gs偶合,P2Y2、P2Y6、P2Y12被發(fā)現(xiàn)均可通過G12/13活化Rho蛋白[3-5]。此外,P2Y受體可以像其他GPCRs一樣形成同源或異源寡聚體[6]。這種結(jié)合方式一定程度上可改變受體信號傳導(dǎo),脫敏化和交互方式等。Kawashita等[7]詳細(xì)描述了P2Y6同型二聚體的形成。在研究大鼠腦組織的體內(nèi)實驗中,利用共定位和免疫共沉淀可以觀察到P2Y1/A1AR異聚體的形成[8]。異聚體形成后會顯示一些新的藥理學(xué)特性:P2Y1/A1AR異聚體受P2Y1激動劑作用,信號傳導(dǎo)方面卻與A1AR類似。在P2Y家族中,各亞型異聚的情況依然存在。P2Y1/P2Y2,P2Y1/P2Y4和 P2Y1/P2Y11等異源共聚體的存在已被證實[9]。P2Y受體異聚化可引起受體變構(gòu)調(diào)節(jié)、激動劑親和力和特異性變化、影響胞內(nèi)信號通路,但其生理意義需要進(jìn)一步討論。
從蛋白水平來看,P2Y受體的氨基酸殘基序列表現(xiàn)出高度多樣性,同一亞型在不同物種間表現(xiàn)出較大差異,人類與火雞的P2Y1同源性為84%,與小鼠P2Y1的同源性則是95%。相同組織的P2Y受體在氨基酸組成中也表現(xiàn)出相對高的多樣性,人血小板表達(dá)的P2Y1和P2Y12盡管具有一些相似的藥理學(xué)特征,彼此的同源性也只有17%~19%。P2Y14與P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11之間同源性僅有18%~45%。細(xì)胞膜上表達(dá)的P2Y受體通常依靠N端糖基化進(jìn)行修飾[10],Algaier等[11]已證明糖基化修飾對P2Y12信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是必需的,但對配體結(jié)合或細(xì)胞表面結(jié)合無明顯作用。所有P2Y受體在胞外結(jié)構(gòu)域中均有四個半胱氨酸殘基,它們可能形成二硫鍵:一個在N端結(jié)構(gòu)域和EL3之間,一個在EL1與EL2間的橋梁[12]。
序列比較結(jié)果表明,P2Y受體的TMD區(qū)域較ELs或ILs區(qū)域更為保守。編碼TMD3、6、7的部分序列高度保守并在位置上靠近ILs,這部分受體蛋白可能在配體識別中起到重要作用。將定點突變分析和分子建模技術(shù)結(jié)合起來,研究者可以有效鑒定這些受體的假想配體結(jié)合位點。作為典型的視紫紅質(zhì)類GPCRs,Costanzi等[13]建立的P2Y亞型分子模型表明胞外TMD的極性氨基酸殘基參與結(jié)合配體的過程。定向突變結(jié)果顯示,P2Y受體TM6第6.52位點組氨酸跨物種跨亞型高度保守,而且在P2Y1、P2Y2、P2Y12配體識別中發(fā)揮重要作用[14-15]。相同情形在TM6中的第6.55位堿性殘基(Arg或Lys)中也得到證實,這可能涉及受體蛋白與核苷酸配體中帶負(fù)電荷的磷酸基團的相互作用。P2Y受體具有相似序列的孤兒受體(如P2Y5、GPR23)在6.55位缺乏堿性殘基,不能被胞外核苷酸激活。通過這一位點,Hoffmann等[16]在一系列活性藍(lán)2衍生化合物中鑒定了一個高效的高選擇性P2Y12受體拮抗劑。
除了TM結(jié)構(gòu),P2Y受體的ELs同樣有助于配體識別過程。P2Y1中EL2的Glu-209和EL3的Arg-287能夠額外形成一個親和力較低的結(jié)合位點,其可能參與受體和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的相互作用。P2Y1中EL2的Asp-204被認(rèn)為和鎂離子(Mg2+)協(xié)調(diào)參與核苷酸結(jié)合。人P2Y2中EL1的Arg-95,Gly-96和Asp-97將受體與整聯(lián)蛋白偶聯(lián),并參與頂端靶向[16]。此外,人類P2Y2受體的EL3中的Arg-272被認(rèn)為起到看門人的作用,可能負(fù)責(zé)核苷酸配體的識別和定向[11]。嵌合和突變分析顯示ATP對大鼠P2Y4受體的激動取決于EL2中的3個殘基:Asn-177、Ile-183和Leu-190[17]。P2Y11受體的EL2中的Glu-186有助于受體的配體識別過程[10],并且對于人P2Y12受體中EL2的Lys-174和EL3的Arg-265提出了類似的作用[18-19]。
P2Y受體在幾乎所有細(xì)胞中都有表達(dá),其中就包括免疫細(xì)胞。在巨噬細(xì)胞(P2Y2、P2Y14、P2Y6),樹突狀細(xì)胞(P2Y14、P2Y6、GPR171、P2Y13)和小膠質(zhì)細(xì)胞(P2Y12、GPR34、P2Y13、P2Y6)中,P2Y受體是表達(dá)最豐富的GPCRs之一,P2Y12和GPR34甚至被認(rèn)為是小膠質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記。P2Y受體參與許多免疫應(yīng)答的功能,包括趨化性,吞噬作用和顆粒釋放。核苷酸從突觸小泡或顆粒中主動釋放,充當(dāng)免疫突觸和自動/旁分泌發(fā)射器的(共)發(fā)射器。受損或應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞釋放出ATP或其他核苷酸,免疫系統(tǒng)由此發(fā)現(xiàn)細(xì)胞。P2Y受體缺陷小鼠模型表明,P2Y受體(P2Y2、P2Y6、P2Y12)參與協(xié)調(diào)外周巨噬細(xì)胞和神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的趨化性和吞噬作用[18]。受損細(xì)胞釋放出的核苷酸及其降解產(chǎn)物是否確實將巨噬細(xì)胞引導(dǎo)向炎癥部位,依然還在討論中。P2Y受體活化增加巨噬細(xì)胞遷移,該效應(yīng)也可能促進(jìn)了受損細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的清除[19]。
目前已有P2Y受體基因缺陷的小鼠品系。P2Y缺陷型小鼠模型在標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)條件下,均出現(xiàn)不同的免疫功能改變。將ADP給P2Y1和P2Y12缺陷小鼠時,血小板聚集功能顯示出改變。類似地,P2Y6在受損細(xì)胞釋放UDP募集小膠質(zhì)細(xì)胞過程中起著傳感器的作用。在外周免疫系統(tǒng)中,P2Y6通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化來保護肺免受過敏原誘導(dǎo)的肺部炎癥。 P2Y12的免疫功能先前未被充分認(rèn)識,直到研究其小膠質(zhì)細(xì)胞功能。最近一項研究認(rèn)為,P2Y12和由Toll樣受體2(Toll-like receptor2,TLR2)介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞隨機遷移運動有關(guān)[20]。
與其他嘌呤受體不同,P2Y11是一種低親和力受體。P2Y11的獨特之處在于,它與Gs或Gq蛋白均可偶聯(lián),活化后引起cAMP和IP3水平升高。P2Y11在人腦部和白細(xì)胞中表達(dá)廣泛。在中性粒細(xì)胞中,刺激P2Y11可延遲細(xì)胞凋亡。此外,P2Y11還能夠抑制單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞遷徙。P2Y11是嚙齒動物的假基因(pseudogene),因此很難研究其功能。除此之外,特異性配體的缺乏更進(jìn)一步阻礙了P2Y11的功能研究。大多數(shù)研究使用的都是P2Y11的部分選擇性拮抗劑NF157,直到最近才開發(fā)出特異性更好的拮抗劑NF340和激動劑NF546。最近的一項研究表明,P2Y11基因非編碼區(qū)的突變可能與發(fā)作性睡病易感性存在關(guān)聯(lián)。發(fā)作性睡病可能是對下丘腦泌素(hypocretin)神經(jīng)元的自身免疫攻擊引起的,這種疾病提供了一種研究神經(jīng)元免疫監(jiān)視的獨特模式[21]。作為免疫細(xì)胞存活的重要調(diào)節(jié)因子,P2Y11中相關(guān)等位基因在 CD8 + T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞表達(dá)降低,可能對發(fā)作性睡病和其他自身免疫性疾病產(chǎn)生影響。
P2Y受體的另一個重要作用是誘導(dǎo)囊泡脫顆粒:在血小板顆粒通過自分泌或旁分泌釋放ATP和ADP增強血小板聚集的自分泌嘌呤能信號系統(tǒng)中,P2Y1和P2Y12是重要組成部分[22]?;赑annexin-1通道蛋白,由P2Y2誘導(dǎo)的ATP釋放可以提高中性粒細(xì)胞的趨化能力[23]。目前,研究者認(rèn)為肥大細(xì)胞脫?;徒M胺的釋放與P2Y2,P2Y13和P2Y14的活化有關(guān)。
除了在免疫細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中的作用,P2Y受體與干細(xì)胞增殖分化密切相關(guān):P2Y14在造血譜系原始細(xì)胞中具有嚴(yán)格受限的表達(dá),并且是造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞組織應(yīng)激中再生反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)[24]。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在維持中胚層組織的穩(wěn)態(tài)中起重要作用。MSCs在組織環(huán)境中釋放包括細(xì)胞外核苷酸及其代謝產(chǎn)物的信號分子,介導(dǎo)增殖、分化和存活等過程。研究人員對脂肪組織MCS和外胚間充質(zhì)牙囊細(xì)胞(DFCs)中P2受體進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)P2Y4和P2Y14在脂肪形成和成骨分化的關(guān)鍵節(jié)點上受到基因和蛋白水平的調(diào)節(jié),是早期譜系定型中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。另外,P2Y1和P2Y2對骨生成至關(guān)重要, P2Y11則是參與向脂肪細(xì)胞的分化。Jiang等[25]還詳細(xì)描述了P2Y1和P2Y4信號調(diào)控BM-MSC脂肪形成。此外,在干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中,P2Y13似乎是骨髓祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。在進(jìn)一步的研究中,MSC成骨細(xì)胞和P2Y13受體信號間的聯(lián)系再次被驗證。與野生型對比,P2Y13敲除小鼠的骨骼表型發(fā)生年齡依賴性變化。
4.1 P2Y1P2Y1是P2Y家族中第一個被克隆出的受體,廣泛分布于心、腦、肺和胎盤等組織,且與P2Y12共分布在血小板上。目前,血小板受體的抗栓治療是針對血栓性疾病的主流療法。以P2Y12為靶點的抗血栓藥物雖然在抗血栓方面有不錯的療效,但也有易出血等副作用。P2Y1引起血小板短暫的變形和聚集,針對P2Y1受體的抑制劑引起了研究者的重視。
2015年,中科院上海藥化所對P2Y1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,發(fā)現(xiàn)其存在兩個完全不同的藥物分子作用位點,結(jié)合方式亦與P2Y12不同,這一發(fā)現(xiàn)有助于提高藥物與P2Y1的特異性結(jié)合,能夠幫助研究者設(shè)計出更加高效、特異性強的藥物。
目前針對P2Y1的抑制劑主要有:四氫喹啉系列化合物、二芳基尿素類、香豆酮類、吡咯類、氨噻唑替代尿素類、環(huán)氨基支架取代類尿素衍生物、二氫吲哚基系列以及中草藥中相關(guān)成分。四氫喹啉系列化合物的水溶性較差,阻滯了其進(jìn)一步的藥代動力學(xué)研究。吡咯類化合物具有高親脂性和低溶解度等缺陷。與之相比,環(huán)氨基支架取代類尿素衍生物提高了水溶性和生物利用度。中草藥生物堿能在體外明顯抑制人血小板聚集,其中蓮心堿可能是通過P2Y1產(chǎn)生作用。目前,二芳基尿素類衍生物具有親和力好、抗凝能力強、口服生物利用度高、藥代動力學(xué)活性高等特點,被認(rèn)為是最具有潛力的血小板抗凝藥物,但其水溶性較差,后續(xù)研究還需改善溶解度和保持抗凝活性。
4.2 P2Y2UTP(INS316)是P2Y2的天然激動劑,EC50為0.14 μmol·L-1。UTP由頂端和基底外側(cè)的氣道上皮細(xì)胞分泌,可通過人肺上的P2Y2受體影響PLC活化和IP3的形成,調(diào)節(jié)生理功能。目前,UTP的II期臨床試驗已經(jīng)完成,結(jié)果表明其具有治療肺癌的潛力。P2Y2的另一天然激動劑是ATP,EC50為0.23 μmol·L-1。ATP以自分泌或旁分泌的形式釋放到胞外,響應(yīng)神經(jīng)元刺激、血小板聚集、機械刺激引起的肌肉或肺動脈舒張、黏膜纖毛清除和液體分泌等。由于參與的功能繁多,ATP進(jìn)行了一系列疾病的臨床嘗試。
ATP和UTP分別由3部分組成,分別是堿基,磷酸鹽和核糖。為了得到更多有效的、有選擇性的、穩(wěn)定的P2Y2激動劑,對ATP和UTP的結(jié)構(gòu)修飾主要集中在這三個區(qū)域。一般來說修飾遵循兩個原則:一是如ADP或UDP般減少磷酸鹽,得到效力較弱的激動劑。另一種是用亞甲基或帶電荷的硫原子代替橋接的氧原子,得到與ATP或UTP活性接近但代謝穩(wěn)定的產(chǎn)物,其中具有代表性的有ATP-γ-S和UTP-γ-S。UTP在人體組織中具有快速代謝的特點,限制了它成為囊性纖維化(CF)或原發(fā)性纖毛運動障礙(PCD)等P2Y2受體相關(guān)疾病的治療藥物。因此藥理活性相似,代謝更慢的UTP-γ-S成了更具潛力和選擇性的激動劑。
地夸磷索(INS 365,Diquafosol)是由Inspire Pharmaceuticals研發(fā)的P2Y2選擇性激動劑,2001年在日本上市。憑借市場的成功,地夸磷索贏得了極大的關(guān)注。默克制藥研發(fā)地紐福素(INS37217,Denufosol)的重點是治療囊性纖維化(CF),Ⅲ期臨床試驗已于2008年完成。與地夸磷索相比,地紐福素具有顯著的酶水解抗性。
4.3 P2Y4P2Y4在藥理性質(zhì)和機構(gòu)上與P2Y2密切相關(guān),但表達(dá)較P2Y2更受限。它主要在胃腸道中表達(dá),功能可能是介導(dǎo)胃腸道中Cl-的分泌,另一個功能是在耳蝸中維持Na+平衡。此外,P2Y4對出生后心臟發(fā)育有重要作用,在P2Y4敲除小鼠中出現(xiàn)心臟微小的情況。與其他P2Y亞型相比,P2Y4的靶向化合物相對較少。P2Y4通常與大量P2Y2在相同組織中表達(dá),有時甚至在相同的細(xì)胞中??紤]到它們相似的藥理學(xué)特征,很難對二者進(jìn)行區(qū)分。大量的工作開發(fā)出了幾種P2Y2選擇性激動劑,卻對P2Y4選擇性激動劑的可用性產(chǎn)生極大限制。
4.4 P2Y6P2Y6主要介導(dǎo)胞外核苷酸的活動,以參與心血管疾病的發(fā)生最為重要,主要表現(xiàn)為促進(jìn)血管炎癥反應(yīng),促進(jìn)平滑肌細(xì)胞收縮等[26],因此尋找P2Y6阻斷劑可能是未來心血管疾病領(lǐng)域的一個熱點。此外P2Y6廣泛調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),并和CysLT1R等受體協(xié)同調(diào)整炎癥因子表達(dá)[27],給抗炎癥藥物的研究提供了新靶點。
目前,關(guān)于P2Y6抑制劑的研究還很少。文獻(xiàn)報道的P2Y6抑制劑主要是Mamedova等人合成的一系列二異硫氰酸酯衍生物,其中最具有藥效與選擇性的有MRS2578、MRS2567和MRS252575。它們與P2Y6的IC50分別為37、16和155 nmol·L-1。二異硫氰酸酯衍生物在水性溶液中溶解性低,在含水介質(zhì)中的不穩(wěn)定,能與親核試劑反應(yīng)。這些特點限制了其作為藥理學(xué)工具的用途。MRS2578是目前應(yīng)用最廣泛的P2Y6抑制劑,但其可能不適合用于體內(nèi)研究。
4.5 P2Y11P2Y11主要受ATP等內(nèi)源性嘌呤核苷酸的刺激,易被腺嘌呤核苷酸激活(ATP>ADP)而UTP、UDP、GTP、ITP等均無活性。與P2Y家族其他成員對比,P2Y11具有幾個獨特的性質(zhì):①P2Y11是唯一在編碼序列有內(nèi)含子的人P2Y受體基因;②P2Y11基因在嚙齒動物基因組中似乎不存在;③它與PLC和AC均可偶聯(lián)。P2Y11在大鼠和小鼠中的缺失和藥理學(xué)工具的有限,阻礙了研究者對其功能與性質(zhì)的認(rèn)識和理解。
文獻(xiàn)報道中,P2Y11最有效的激動劑ARC67085XX同時也會拮抗P2Y12,這限制了其表證P2Y11功能的作用。對磺酸和膦酸衍生物庫篩選,研究者鑒別出hP2Y11的完全激動劑NF546。NF546的效力比ATP低2.5倍,對其他P2Y亞型具有一定程度選擇性。NF546對hP2Y11的EC50值分別比hP2Y2,hP2Y6和hP2Y12受體的EC50值低28倍,102倍和604倍。它對人P2Y1和P2Y4受體幾乎沒有影響,在其他P2X和P2Y亞型的活性尚未見報道。
蘇拉明和PPADS是一般的非選擇性P2受體拮抗劑,低濃度的蘇拉明卻是一種可克服的hP2Y11拮抗劑。蘇拉明類似物NF157是一種競爭性P2Y11拮抗劑,NF157對P2X1的無選擇性限制了可用性。另一種蘇拉明類似物NF340也是P2Y11的競爭性拮抗劑,NF340選擇性較NF157更好,更有可能用于探索P2Y11的生理功能。
NF340和NF546是目前已知對P2Y11選擇性最高的兩種化合物。鑒于參與NF340和NF546結(jié)合的P2Y11氨基酸殘基與ATP的結(jié)合部位大部分重疊,NF340和NF546可能與其他ATP結(jié)合受體結(jié)合。這些化合物尚未證實對P2Y11外的其他ATP受體具有特異性,還需要在所有結(jié)合ATP 的P2受體上進(jìn)行測試。
4.6 P2Y12抗血小板聚集在抗血栓治療中發(fā)揮著重要作用,ADP受體抑制劑是一類重要的抗血小板聚集藥物。P2Y12受體抑制劑則是目前臨床應(yīng)用最廣泛的一種ADP受體抑制劑。
P2Y12受體抑制劑主要分為噻吩并吡啶類和非噻吩并吡啶類兩種。目前,噻吩并吡啶類藥物已發(fā)展到第三代。第一代藥物噻氯吡啶1979年在法國上市,1991年獲得FDA認(rèn)證。噻氯吡啶不良反應(yīng)較多,后被第二代產(chǎn)品氯吡格雷取代。氯吡格雷在1997年獲得FDA認(rèn)證,隨后在美國和歐洲上市,廣泛用于臨床并得到大量關(guān)注。氯吡格雷實際療效受患者CYP2C19基因多態(tài)性的影響,因此出現(xiàn)顯著的個體差異,嚴(yán)重者會出現(xiàn)氯吡格雷抵抗現(xiàn)象。2009年,第三代產(chǎn)品普拉格雷先后在歐洲上市并獲得FDA認(rèn)證。普拉格雷抗血小板凝聚能力較好,且其療效不受CYP2C19基因多態(tài)性的影響,較氯吡格雷更有優(yōu)勢。
非噻吩并吡啶類藥物主要是替格瑞洛和坎格雷洛。替格瑞洛2010年在歐洲上市,2011年獲得FDA認(rèn)證。替格瑞洛是P2Y12的選擇性抑制劑,與P2Y12快速而可逆的結(jié)合抑制血小板聚集,具有起效迅速,停藥后血小板功能恢復(fù)快的特點,可用于出現(xiàn)氯吡格雷抵抗的患者??哺窭茁迨堑谝粋€通過靜脈給藥的P2Y12拮抗劑,并在2015年獲得了FDA認(rèn)證。坎格雷洛具有快速起效和失效的特點,在急性冠狀動脈綜合征(ACS)方面有良好應(yīng)用。因其不能口服用藥,所以治療用途較為單一。
在對氯吡格雷代謝機制的研究中,研究者合成出一種新型二硫化合物ClopNPT。ClopNPT避免了CYP2C19缺失和氯吡格雷生物利用度低等缺陷,有望用于ACS攜帶功能缺失等位基因較多的亞洲人群。ClopNPT或在未來成為新型的抗血小板聚集藥物,使更多患者受益。
4.7 P2Y13P2Y13是近年來新克隆的P2Y受體,它與P2Y12、P2Y14歸屬于響應(yīng)Gi蛋白的亞族。P2Y13與P2Y12具有共同的序列同一性,但它們可以根據(jù)不同的藥理學(xué)和信號傳導(dǎo)特性加以區(qū)分。P2Y13在人的脾臟與大鼠腦中表達(dá)豐富,表明其在免疫和神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用。
PPADS對P2Y13受體的阻斷能力較弱,其衍生物MRS2211卻是高選擇性的P2Y13受體拮抗劑。目前,研究者對P2Y13的工作主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)。有研究者將MRS2211用于糖尿病神經(jīng)性疼痛、機械疼痛以及脫髓鞘等疾病的研究中。隨著研究的進(jìn)展,人們逐漸認(rèn)識到P2Y13在神經(jīng)元活動中的重要地位,這給神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診治提供了一個新的潛在靶點。毫無疑問,以P2Y13為靶點的藥物對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有重要的意義。
4.8 P2Y14P2Y14在1994年被發(fā)現(xiàn),最初被稱為KIAA0001或GPR105。P2Y14在體內(nèi)普遍表達(dá),大多數(shù)組織和器官中在蛋白質(zhì)水平可檢測到。P2Y14的生理功能并不清楚,但實驗觀察及其在免疫細(xì)胞中的突出表達(dá)表明其可能參與炎癥和免疫反應(yīng)。
P2Y14與其他P2Y受體均在人漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞中表達(dá),經(jīng)胞外核苷酸活化后抑制干擾素-α的釋放,可能是為了避免過度的組織損傷或自身免疫表達(dá)。基于此,P2Y14激動劑或可用于自身免疫性疾病。P2Y14敲除小鼠出現(xiàn)胰島素分泌的受損,其激動劑或可用于糖尿病的治療。
P2Y14顯著表達(dá)于免疫系統(tǒng)的不同細(xì)胞,活化后可促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨向性和募集、促炎因子的釋放。實驗觀察表明,UDP-糖通過P2Y14發(fā)揮作用,起到胞外炎癥介導(dǎo)的作用。因此,P2Y14拮抗劑可用于治療過度炎癥。肥胖的P2Y14敲除小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗的現(xiàn)象,P2Y14拮抗劑可用于2型糖尿病。此外,UDP-糖刺激破骨細(xì)胞生成,沉默P2Y14可以抑制破骨細(xì)胞形成。因此,拮抗劑也可用于治療骨疾病。目前針對P2Y14的抑制劑還較少,萘酸類衍生物 PPTN顯示出了與 P2Y14的高度親和力和選擇性,然而其溶解性較差,生物利用度低,限制了它的成藥性
核苷酸廣泛存在于人體所有類型的細(xì)胞,可能是細(xì)胞早期進(jìn)化過程中最早的一批信息傳感器。因此,P2Y受體對人體疾病發(fā)展十分重要并不奇怪。P2Y受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體,后者占到目前臨床用藥靶點的三分之一。因此P2Y受體也極有可能是藥物的有效靶點。
到目前為止,已經(jīng)克隆出八種P2Y受體:對ADP敏感的P2Y1、P2Y12和P2Y13,對UTP和ATP敏感的P2Y2和P2Y4,對UDP敏感的P2Y6,對ATP敏感的P2Y11,對UDP和UDP糖苷敏感的P2Y14。外核苷酸存在于血液循環(huán)與細(xì)胞表面,可將ATP迅速降解為ADP、AMP和腺苷。這一特點給藥物特異性作用和減少副作用提供了機會。
5.1 急性冠狀動脈綜合征(ACS) 動脈中血栓形成依賴于血小板黏附在受損血管壁的能力。一旦黏附,血小板囊泡釋放出ADP,ADP激活血小板表面P2Y1和P2Y12受體,導(dǎo)致血小板形狀改變,膜聯(lián)蛋白產(chǎn)生凝血酶,進(jìn)而激活凝血系統(tǒng)?;罨难“暹€可以形成血小板-單核細(xì)胞復(fù)合物,導(dǎo)致炎性細(xì)胞活化。最后激活纖維蛋白原GpIIb/IIIa受體,導(dǎo)致血小板聚集。血小板上有兩種ADP受體(P2Y1和P2Y12)和一個ATP受體(P2X1)表達(dá)。P2Y12與cAMP引起的抑制作用偶聯(lián),是血小板上最重要的P2受體。
阿司匹林與P2Y12抑制劑聯(lián)合用藥是目前ACS患者治療的主要方法。目前有兩種口服P2Y12抑制劑(氯吡格雷和替卡格雷)取得ACS適應(yīng)證,一種(普拉格雷)用于采取經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)的ACS。歐洲、美國監(jiān)管機構(gòu)最近還批準(zhǔn)了靜注坎格雷洛用于接受PCI治療的患者。
5.2 干眼病(dry eye disease) UTP和ATP對支氣管上皮細(xì)胞的P2Y2受體的激活刺激了上皮下氯化物,水和黏液分泌。此外,它刺激纖毛運動和搏動頻率,這對于從氣道中清除黏液和細(xì)菌是必不可少的。當(dāng)氣道被拉伸時,ATP和UTP可以被釋放,并且已經(jīng)表明咳嗽的一個重要原因是釋放ATP和UTP,其反過來刺激分泌和纖毛運動。囊性纖維化是我們所知的最常見的單基因遺傳性疾病之一。DNA多態(tài)性產(chǎn)生氯通道失效,其導(dǎo)致干燥黏液失調(diào),慢性感染和呼吸功能不全的早期死亡。ISPH開發(fā)了穩(wěn)定的吸入UTP類似物,它們是P2Y2受體的模擬物。藥物地紐福素已獲得孤兒藥指定,囊性纖維化的臨床試驗已成功進(jìn)入Ⅲ期。
干眼病在全世界發(fā)病率為5%~35%[28],困擾數(shù)百萬人群。2007年,干眼病定義中引入了炎癥。相比傳統(tǒng)定義,干眼病的抗炎治療會成為新的熱點?;谂c囊性纖維化治療相似的原理,UTP類似物也用于干眼病治療。P2Y2選擇性激動劑地夸磷索能夠活化眼表P2Y2,刺激淚液分泌。它可以有效治療干眼病,減少角膜擦傷,于2010年獲批用于日本市場。P2Y2激動劑Denufosol在囊性纖維化試驗階段反響良好,但在后期階段失敗,原因可能是長期治療過程中P2Y2信號通路出現(xiàn)促炎癥作用。
5.3 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS) AS是由于血液低密度脂蛋白膽固醇水平增高導(dǎo)致大/中等動脈內(nèi)膜產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)性疾病。近年來,AS逐漸被認(rèn)為是血管壁內(nèi)皮細(xì)胞、脂質(zhì)、單核巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及血小板相互作用而導(dǎo)致的慢性炎性反應(yīng)?;A(chǔ)和臨床實驗均證實,臨床用于AS防治的藥物,如調(diào)血脂藥、抗血小板藥、抗氧化劑、COX-1抑制劑、PPAR-α激動劑、PPAR-γ激動劑等,均對AS發(fā)生的相關(guān)細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞)具有抗炎作用,提示抗感染治療可成為AS防治的一條新途徑[29]。
AS發(fā)展進(jìn)程中最重要的炎性細(xì)胞是斑塊中的單核細(xì)胞,其可以分化為巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。二者表達(dá)大量P2受體,且被認(rèn)為是AS的重要調(diào)節(jié)劑。最明顯與AS炎癥有關(guān)的P2Y受體有P2Y1、P2Y2和P2Y11。P2Y1-/-小鼠巨噬細(xì)胞的斑塊面積變小,這一功能依賴內(nèi)皮上的P2Y1激活粘附白細(xì)胞受體的表達(dá)。這是AS早期重要事件,可以導(dǎo)致炎癥細(xì)胞向斑塊募集。P2Y2介導(dǎo)ATP與UTP對樹突細(xì)胞的趨化性,將炎癥細(xì)胞吸引到斑塊周圍。此外,P2Y2受體還能釋放人巨噬細(xì)胞中的自由基。刺激P2Y11后,T細(xì)胞活化(CD4+)被抑制。ATP作用于P2Y11刺激樹突細(xì)胞的成熟過程,削弱T細(xì)胞輔助因子1和刺激T細(xì)胞輔助因子2造成免疫抑制。P2Y11多態(tài)性增加心肌梗死的風(fēng)險已在臨床引起重視。總之,P2Y11受體通過T淋巴細(xì)胞,巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞介導(dǎo)的抗炎作用在動脈粥樣硬化的發(fā)展中起重要作用。
目前已知的幾種ATP和UTP刺激引起的幾種炎癥反應(yīng)對AS發(fā)展很重要。 P2Y1和P2Y2拮抗劑和P2Y11激動劑可能是未來用于治療動脈粥樣硬化的P2Y藥物。
5.4 骨質(zhì)疏松(Osteoporosis) 骨質(zhì)疏松可導(dǎo)致骨折和疼痛,是老年人群面對的主要疾病之一。雙膦酸鹽是目前用于治療骨質(zhì)疏松最重要的藥物,它可以抑制破骨細(xì)胞再吸收并刺激成骨細(xì)胞增殖。研究表明,采用雙磷酸鹽治療促進(jìn)了非溶解性ATP釋放,通過P2Y受體參與激活ERKs,促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖上升。P2Y1和P2Y2似乎參與了這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外,最近在P2Y13-/-雌性小鼠中也觀察到骨密度增加的表型。一項由歐盟資助的項目正在努力嘗試找出相關(guān)受體并為未來的治療提供建議[30]。
5.5 糖尿病(Diabetes) 大量研究表明胞外ATP和UDP在P2Y受體調(diào)節(jié)胰島素(Insulin)分泌過程中起到重要作用。新型生物傳感器已經(jīng)證明葡萄糖能夠刺激單個胰腺β細(xì)胞分泌ATP到胞外,局部濃度可超過25 mmol·L-1。在體內(nèi)、體外實驗和人β細(xì)胞中均顯示ADP通過P2Y受體增加胰島素分泌。β細(xì)胞可被ADP活化,也可通過間歇性釋放ATP此信號。然而,還有報道ADP降低胰島素釋放[31-32]。出現(xiàn)這種差異的原因可能是有多種的嘌呤受體參與對胰島素釋放的調(diào)控。
值得關(guān)注的是,P2Y受體對胰島素似乎能產(chǎn)生不同的效應(yīng)。當(dāng)ADP作用于P2Y1時可以刺激胰島素的分泌,作用于P2Y13時卻是胰島素分泌的抑制劑。體內(nèi)與體外實驗中,ADP作用于P2Y13時均起到胰島素釋放抑制劑的作用[31]。β細(xì)胞凋亡是糖尿病的發(fā)病機制中關(guān)鍵因素。在P2Y13表現(xiàn)為凋亡受體的細(xì)胞中,ADP能夠誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡,此效應(yīng)可被P2Y13拮抗劑MRS2211阻止[33-34]。因此,P2Y13拮抗劑增加胰島素分泌和保護β細(xì)胞,可適用于糖尿病長期治療。
UDP可通過活化P2Y6刺激胰島素分泌。已知多種神經(jīng)激素,胃腸激素和代謝信號可通過GPCR增強胰島素分泌。β細(xì)胞中編碼Gαq和Gα11的基因特異性失活可導(dǎo)致小鼠糖耐量和胰島素分泌降低,而且對葡萄糖本身的自分泌反應(yīng)也變?nèi)?。在自分泌介?dǎo)物中,UDP通過Gq/G11偶聯(lián)的P2Y6參與到過程中來。因此,Gq/G11介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑通過整合全身和自分泌/旁分泌介質(zhì)來增強胰島素的分泌以應(yīng)對葡萄糖變化。
當(dāng)葡萄糖水平由5 mmol·L-1上升至15 mmol·L-1時,血管平滑肌細(xì)胞中導(dǎo)致動脈粥樣硬化的NFAT信號通路顯著增加。這種效應(yīng)由葡萄糖誘導(dǎo)分泌的ATP和UTP介導(dǎo),首先激活P2Y2,UTP降解為UDP后激活P2Y6。因此,核苷酸釋放可看作是動脈平滑肌響應(yīng)高葡萄糖的潛在代謝傳感器。糖尿病患者微血管病變的特征在于血管平滑肌細(xì)胞數(shù)增加引起的壁腔比上升與冠狀動脈成形術(shù)后的較高的狹窄率。高葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞外核苷酸釋放作用于P2Y受體,通過活化NFAT刺激平滑肌細(xì)胞生長或許提供了糖尿病和糖尿病血管疾病之間的聯(lián)系。
簡而言之,P2Y受體具有成為治療糖尿病靶點的潛力,用于改善胰島素分泌,預(yù)防β細(xì)胞死亡和保護微循環(huán)。
作為目前最受重視的嘌呤受體,P2Y受體自1978年發(fā)現(xiàn)至今已40多年。P2Y受體在許多病理條件下顯示出可塑性,表明它們可能是治療這些疾病的有用靶標(biāo)。雖然處于起步階段,但嘌呤能信號傳導(dǎo)的臨床操作已經(jīng)開始。一些臨床相關(guān)的藥物干預(yù)已經(jīng)成為日常實踐的一部分。但目前P2Y受體亞型高特異性激動劑和拮抗劑的缺乏,信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的亟待闡明以及受體間相互作用方式尚不明了,限制了P2Y受體的進(jìn)一步研究與應(yīng)用。隨著研究的深入,針對P2Y受體設(shè)計開發(fā)藥物對于未來疾病的治療必然具有巨大價值。