大麥發(fā)芽期耐鹽性種質(zhì)鑒定及其生理響應(yīng)特征分析

孫 建，徐曉蕓，馬增科，何建軍，汪軍成，姚立蓉，李葆春，馬小樂，司二靜，楊 軻，王化俊，孟亞雄

(1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070)

土壤鹽漬化是抑制作物生長、造成作物減產(chǎn)的主要非生物脅迫之一[1]。我國耕地鹽漬化面積達到0.05億hm2,占全國耕地面積的6.1%，且土壤鹽漬化危害面積和程度均有逐年提高的趨勢[2]。國內(nèi)外研究證明，篩選耐鹽性品種，利用生物治鹽、改鹽是改善生態(tài)環(huán)境、提高鹽漬化土地利用率的一條有效途徑，選育高耐鹽性作物顯得尤為重要。

鹽脅迫對植物種子的萌發(fā)、生長發(fā)育和基因表達均造成不同程度的影響。高鹽濃度抑制小麥種子的萌發(fā)和幼苗的生長, 隨著鹽濃度的增加，幼苗長度和主根長度逐漸降低[3]。苗期種子在發(fā)芽階段的耐鹽性是耐鹽作物篩選與早期鑒定的重要依據(jù)，也是決定植株能否在鹽漬化土壤中生存的關(guān)鍵[4]。彭智等[5]通過對小麥種質(zhì)材料的篩選和鑒定，得到了小麥芽期耐鹽性鑒定的最適 NaCl 溶液濃度和苗期耐鹽性鑒定的最適土壤 NaCl 濃度。同時，植物主要通過根系限制鹽分的進入和調(diào)整根的分布來適應(yīng)鹽脅迫[6]，小麥、水稻則通過調(diào)節(jié)根系 K+吸收系統(tǒng)而維持葉片具有較高的K+/Na+值[7-8]，以進行滲透調(diào)節(jié)來建立植物體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)也是重要的耐鹽性機制之一。關(guān)于鹽脅迫對大麥苗期的種質(zhì)篩選和鑒定[9-11]大多側(cè)重于對數(shù)量性狀和生物量的研究，而對大麥種質(zhì)材料的生理特征響應(yīng)的研究較少。

大麥(HordeumvulgateL．)是世界上栽培歷史最悠久的作物之一，主要用作飼料、糧食、啤酒工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和保健食品開發(fā)的原料，也是禾本科植物中較為耐鹽的作物。獲得優(yōu)異的耐鹽種質(zhì)，培育耐鹽作物新品種是解決土壤鹽漬化問題的有效措施之一[12]。因此，耐鹽種質(zhì)的篩選、鑒定和評價就顯得尤為重要。本實驗在2017年對不同大麥材料大田耐鹽性鑒定的基礎(chǔ)上篩選采集的不同耐鹽材料，于2018年進一步對大麥發(fā)芽期耐鹽特性進行評價，分析篩選出的高耐鹽性、鹽敏感性兩種極端類型材料鹽脅迫響應(yīng)的生理學特征，以期為耐鹽大麥新品種的培育提供種質(zhì)資源和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年7—9月在甘肅農(nóng)業(yè)大學智能溫室進行，供試126份大麥材料由甘肅省干旱生境作物學重點實驗室麥類育種課題組提供，詳見表1。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 種子發(fā)芽期耐鹽材料篩選 將滅菌后的種子均勻擺放于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50粒，然后每皿添加10 mL 200 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)液，3次重復(fù)，以不添加NaCl的培養(yǎng)液處理為對照，最后置于晝/夜溫度23℃/18℃，濕度50%～60%，光周期14 h，光強為400～500 μmol·m-2·s-1的人工氣候室中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，觀察種子發(fā)芽情況并記錄。以生根長芽，且芽長等于種子長度的1/2作為發(fā)芽標準。在開始萌發(fā)后第3天統(tǒng)計種子發(fā)芽勢，第7天統(tǒng)計種子發(fā)芽率，并在發(fā)芽第7天測量幼苗株高、根長和統(tǒng)計總根數(shù)(表2)。

表1 種質(zhì)材料

通過統(tǒng)計分析不同大麥材料在鹽脅迫下種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、株高、根長、根數(shù)變化，比較不同大麥材料間在發(fā)芽期性狀的差異，綜合評價大麥材料在發(fā)芽期的耐鹽性，并篩選出高度耐鹽性、鹽敏感性這兩種極端種質(zhì)類型。

1.2.2 不同耐鹽性大麥發(fā)芽期生理響應(yīng)特征比較 以1.2.1節(jié)所述的方法篩選出的高度耐鹽性和鹽敏感性兩類極端大麥種質(zhì)為材料，采用常規(guī)方法萌發(fā)，待種子萌發(fā)5 d后，選擇長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移到盛有10 L添加200 mmol·L-1NaCl 1/2 Hoagland 營養(yǎng)液(pH 6.5～6.8)塑料盆中進行鹽脅迫處理培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)液，以不添加 NaCl 1/2 Hoagland營養(yǎng)液處理為對照，連續(xù)培養(yǎng)10 d。待培養(yǎng)結(jié)束后，每個處理選擇15株，以5株為一個重復(fù)，測定株高、鮮重、干重，并分離地上部和根系，用根系掃描儀測定根長、根數(shù)、根表面積等形態(tài)學參數(shù)。隨后將根系和地上部105℃殺青，80℃烘干至恒重，研磨成粉末狀，用日本日立U-5100比例光束分光光度計測定Na+、K+含量。

以高度耐鹽性和鹽敏感性這兩種材料在鹽脅迫水培環(huán)境下幼苗株高、鮮重、干重、根系形態(tài)參數(shù)(根長、根數(shù)、根表面積)和地上部、根系Na+、K+含量等指標為依據(jù)，探究不同耐鹽性大麥幼苗對鹽脅迫響應(yīng)的生理特性[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，用Duncan’s法對各數(shù)據(jù)指標進行顯著性檢測，檢測水平為P<0.05，采用隸屬函數(shù)法全面地評價大麥品種(系)的耐鹽性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽期耐鹽性鑒定

2.1.1 鹽脅迫對大麥發(fā)芽及生長特性的影響 鹽脅迫環(huán)境下，大麥發(fā)芽期各個性狀指標的變化在不同程度反映了該材料耐鹽能力的強弱[14]。由表2可知，200 mmol·L-1NaCl 脅迫下，大麥發(fā)芽勢、發(fā)芽率、株高、根長和根數(shù)這些指標與對照相比均有不同程度的下降，且NaCl脅迫下變異系數(shù)較對照相比均增高，說明鹽脅迫對不同材料的影響較大，各材料間差異明顯。鹽處理下的發(fā)芽勢變化范圍在0～0.97%，發(fā)芽率在0～0.90%，株高在0.24～5.67 cm，根長在0.15～3.62 cm，根數(shù)在1.07～2.89個。由此可見，本實驗中各材料發(fā)芽期耐鹽性存在廣泛的遺傳變異。

2.1.2 各材料發(fā)芽期性狀方差分析 由表3和表4統(tǒng)計結(jié)果表明，鹽脅迫處理對發(fā)芽期各性狀影響顯著，與對照相比，鹽脅迫處理后的各材料間種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、株高、根長和根數(shù)均達到了極顯著差異(P<0.01)，基于此，可以確定各材料發(fā)芽期對鹽脅迫響應(yīng)差異明顯，可進一步用于耐鹽材料的篩選和鑒定。

2.1.3 各指標之間相關(guān)性分析 進一步對鹽脅迫下以上各發(fā)芽期指標進行分析，針對每個材料，計算在鹽脅迫處理和對照之間的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、株高、根長和根數(shù)的下降幅度，確定鹽脅迫后的種子相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對株高、相對根長和根數(shù)，并統(tǒng)計指標之間的相關(guān)性。由表5可以看出，各指標之間存在不同程度的相關(guān)性，相對發(fā)芽勢與相對發(fā)芽率、相對株高、相對根長和根數(shù)均存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)；相對發(fā)芽率與相對根長、根數(shù)分別呈顯著正相關(guān)(P<0.05)和極顯著正相關(guān)(P<0.01)；相對株高和根數(shù)、相對根長和根數(shù)分別存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)。鑒于此，可以確定這些指標均可用作材料耐鹽性鑒定的標準[15]。

表2 鹽脅迫各品種發(fā)芽期各指標變化

表3 大麥材料發(fā)芽期發(fā)芽勢、發(fā)芽率、株高性狀方差分析

表4 大麥材料萌發(fā)期根長、根數(shù)方差分析

2.1.4 大麥材料發(fā)芽期耐鹽性綜合評價 在對以上大麥發(fā)芽期鹽脅迫處理單一性狀分析和不同指標之間相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上，進一步利用隸屬函數(shù)分析法，將相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對株高、相對根長和根數(shù)5個指標擴展到 [0，1] 閉區(qū)間上, 將數(shù)據(jù)標準化處理，并分別計算各耐鹽指標的隸屬函數(shù)值，進行綜合聚類分析[16]。結(jié)果如圖1所示，運用Pearson相關(guān)性，以平均距離20為界，將不同大麥材料劃分為4個耐鹽級別類型，其中類別I中包含高度耐鹽材料33份，類別II中包含中度耐鹽材料28份，類別III中包含中度鹽敏感材料16份，類別IV中包含鹽敏感材料49份。

表5 不同指標間相關(guān)性分析

2.2 不同耐鹽性大麥發(fā)芽期生理響應(yīng)特征比較

以上述耐鹽性篩選結(jié)果為依據(jù)，在高度耐鹽材料33份中選擇1份ZDM655(Num185)，在鹽敏感材料49份中選擇1份ZDM222(Num33)，繼續(xù)進行水培法鹽脅迫處理，具體方法如1.2.2所述。

2.2.1 鹽脅迫對不同耐鹽性大麥生物量和含水量的影響 NaCl脅迫下，對不同耐鹽性大麥鮮重、干重、含水量和根冠比進行分析比較，從表6可以看出，無論是高耐鹽性材料，還是鹽敏感性材料，其苗期生物量的分配均不同程度受到鹽脅迫的影響[17]。就幼苗鮮重而言，鹽敏感型材料在鹽脅迫下的降低幅度遠大于高耐鹽性材料，與對照相比，分別下降了11.49% 和55.48%；高耐鹽性材料在鹽脅迫下干重與對照無顯著差異，且要略高于對照，而鹽敏感性材料則顯著下降(P<0.05)；高耐鹽性材料植株含水量在鹽脅迫下略低于對照，但差異不顯著，而鹽敏感性材料則差異顯著(P<0.05)；鹽脅迫下高耐鹽性材料的根冠比顯著提高(P<0.05)，而鹽敏感性材料則與對照差異不顯著。

2.2.2 鹽脅迫對不同耐鹽性大麥形態(tài)特征的影響 由圖2可知，不同耐鹽大麥幼苗株高、根長、根表面積和根體積均受到鹽脅迫的影響，鹽敏感性材料ZDM222在NaCl 處理下，幼苗株高、根長、根表面積和根體積與對照相比急劇下降，受鹽脅迫抑制作用明顯，而高耐鹽性材料ZDM655 的株高與對照相比顯著下降(P<0.05)，根長則略有提高，而根表面積和根體積顯著增大(P<0.05)，分別增加了26.97% 和6.34%，表現(xiàn)出對鹽脅迫更具適應(yīng)性的表型特征[18]。

圖1 不同大麥材料耐鹽性評價綜合聚類Fig.1 Comprehensive cluster analysis of salt tolerance of different barley varieties

表6 NaCl處理下不同耐鹽性大麥鮮重、干重、含水量和根冠比的比較

注：各指標均由平均值±標準誤(SE)表示，每組數(shù)據(jù)3次重復(fù)(n=3)，用 Duncan’s 法統(tǒng)計各指標差異顯著性，同一指標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。Note: The values are presented as means ± standard error (SE); n=3 for all groups. The bars represent the SE. Bars with the same letter are not significantly different at P<0.05 according to Duncan’s multiple range test, the same below.圖2 鹽脅迫下高耐鹽性(ZDM655)、鹽敏感性(ZDM222)大麥形態(tài)學指標比較Fig.2 Comparison of morphological indexes of highly salt tolerant barley (ZDM655) and salt sensitive barley (ZDM222) under salt stress

2.2.3 鹽脅迫對不同耐鹽性大麥Na+、K+積累的影響 在鹽脅迫處理和對照植株中的Na+、K+含量測定結(jié)果如圖3所示，與對照相比，200 mmol·L-1NaCl 培養(yǎng)顯著提高了大麥植株中的Na+含量，但在高耐鹽性材料ZDM655中Na+含量要低于鹽敏感性材料ZDM222，ZDM655鹽脅迫后地上部Na+含量是對照的3.64倍，而ZDM222地上部Na+含量是對照的8.95倍，上升幅度遠高于ZDM655；ZDM655的根系中Na+含量是對照的2.55倍，而ZDM222地上部Na+含量是對照的2.92倍，增加幅度同樣高于ZDM655。鹽脅迫后高耐鹽材料ZDM655對Na+的吸收量較少，從而保持了植株地上部較低的Na+水平[19]。

鹽脅迫后高耐鹽性材料ZDM655地上部K+含量與對照相比呈現(xiàn)出顯著提高的趨勢(P<0.05)，而根系K+含量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)；與對照相比，鹽敏感性材料ZDM222在鹽脅迫處理后地上部K+含量顯著下降(P<0.05)，根系K+含量與對照無顯著差異[20]。由此可見，鹽脅迫下高耐鹽性材料根系吸收培養(yǎng)液K+，進一步運輸?shù)降厣喜浚琄+有效分配的能力要明顯強于鹽敏感性材料，進而促進了植株在鹽脅迫下的正常生長。

圖3 鹽脅迫下高耐鹽性(ZDM655)、鹽敏感性(ZDM222)大麥Na+、K+分配特征比較Fig.3 Comparison of Na+ and K+ distribution between high salt tolerant ZDM655 and salt sensitive ZDM222 under salt stress in barley

3 討論與結(jié)論

3.1 鹽脅迫對大麥材料發(fā)芽期的影響

鹽脅迫是大麥發(fā)芽期的重要影響因素，其結(jié)果通過許多數(shù)量性狀指標來反映。Oyiga[21]、陳新[22]等研究發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫下對植物的根長和苗長有抑制作用，發(fā)芽勢和發(fā)芽率與萌發(fā)期耐鹽性關(guān)系密切；本實驗中，大麥材料發(fā)芽期耐鹽性存在明顯差異，鹽脅迫處理后各材料間種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、株高、根長和根數(shù)較對比均下降并均達到了極顯著差異水平。李先婷等[23]研究發(fā)現(xiàn)大麥耐鹽機制存在很大差異，與對照相比，隨著鹽濃度的增高，地上生物量和株高受到抑制，根系生物量和根冠比增加。同時，高濃度鹽分脅迫對根系的伸長和側(cè)根的發(fā)育產(chǎn)生抑制作用[24]；苗期鹽脅迫處理后，水稻在生長過程中葉片平均死亡率變幅增加，不同的生育期表現(xiàn)出特異性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，除株高和根長、發(fā)芽率無相關(guān)性以外，其它各指標之間均存在顯著或極顯著正相關(guān)。

3.2 大麥材料發(fā)芽期耐鹽性綜合評價

大麥群體材料發(fā)芽期耐鹽性差異的多樣性是耐鹽種質(zhì)材料篩選的重要基礎(chǔ)。范娜等[26]研究高粱種質(zhì)資源耐鹽性，同樣通過綜合評價劃分不同耐鹽等級。本實驗采用模糊隸屬函數(shù)法對材料耐鹽性進行綜合分析，可將不同大麥材料劃分為4個耐鹽級別類型，其中類別I中包含高度耐鹽性材料33份，類別II中包含中度耐鹽性材料28份，類別III中包含中度鹽敏感性材料16份，類別IV中包含鹽敏感性材料49份。依據(jù)發(fā)芽勢、發(fā)芽率、株高、根長和根數(shù)等指標綜合評價大麥發(fā)芽期耐鹽性，可以較為準確地對不同大麥材料的耐鹽性程度劃分等級，為大田生產(chǎn)提供一個參考選擇。

3.3 大麥材料發(fā)芽期耐鹽性生理響應(yīng)特征

植物根系形態(tài)變化是決定根系水分、養(yǎng)分吸收范圍和強度變化的重要參數(shù)。前人研究表明，發(fā)芽期耐鹽性體現(xiàn)了種子吸水膨脹能力，其機理是苗期通過拒Na+來抵御滲透脅迫[27-28],小麥部分通過調(diào)節(jié)根系K+吸收系統(tǒng)而維持葉片較高的 K+/Na+比，從而提高其耐鹽性[29]。在本實驗中，耐鹽性與鹽敏感材料相比植株體內(nèi)含有更少的Na+，說明耐鹽性材料拒絕吸收Na+的作用更強；且耐鹽材料在鹽脅迫下地上部及根系中Na+積累較少，地上部K+積累水平較高，有效維持了植株體內(nèi)離子的平衡，而鹽敏感性材料調(diào)節(jié)植株體內(nèi)離子平衡的能力較弱。岳小紅[30]研究表明，不同類型鹽分脅迫促進了啤酒大麥根表面積和根體積的增加，根冠比也增加。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，高耐鹽性材料根表面積和根體積顯著增大，表現(xiàn)出對鹽脅迫的適應(yīng)性更強；高耐鹽性材料呈現(xiàn)出對鹽脅迫更具適應(yīng)性的表型特征，能夠更有效提高根冠比，向根系分配更多的生物量，保持組織含水量。本實驗不足之處就是未能測定鹽脅迫下幼苗脯氨酸、葉片SOD、葉綠素等生理指標。

在鹽漬化土地生產(chǎn)中，作物發(fā)芽期耐鹽性強弱是生長的關(guān)鍵，大麥作為耐鹽性較強的作物，遺傳基礎(chǔ)存在很大差異，鹽分脅迫對大麥發(fā)芽期的生態(tài)指標均起抑制作用。而在苗期，由于不同種質(zhì)耐鹽性能力的不同，表現(xiàn)出不同的生理特征，高耐鹽性材料通過減少對Na+吸收，增大根表面積和根體積等來提高耐鹽性，具有更好的調(diào)節(jié)體內(nèi)離子濃度平衡的能力；鹽敏感性材料則相反。同時，采取綜合評價可劃分不同的耐鹽等級和篩選高耐鹽種質(zhì)，為鹽漬化土地利用開辟更多途徑。