紫錐菊提取物對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能影響研究

宋紅衛(wèi)，張惠喜，朱麗君，魏戎蓉，姜祎頔，郭靈玲

（1.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東 菏澤 274000；2.菏澤信息工程學(xué)校，山東 菏澤 274000）

長期以來，中小規(guī)模養(yǎng)殖場的生產(chǎn)設(shè)施相對(duì)落后及缺乏畜禽養(yǎng)殖專業(yè)知識(shí)，養(yǎng)殖場為了預(yù)防生產(chǎn)中動(dòng)物疾病的發(fā)生，長期和大量的使用動(dòng)物保健藥物，造成畜禽機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)甚至免疫抑制情況的發(fā)生。因此，科研人員研發(fā)了各種免疫調(diào)節(jié)劑，以應(yīng)對(duì)生產(chǎn)中出現(xiàn)的這些問題。隨著農(nóng)產(chǎn)品中殘留化合物監(jiān)管的日益廣泛和嚴(yán)格，天然的植物藥物成為理想的選擇。紫錐菊（Echinacea）是原產(chǎn)于美洲的一類菊科野生花卉，作為免疫調(diào)節(jié)劑在國際上受到普遍重視，在美洲作為免疫促進(jìn)劑和調(diào)節(jié)劑用于流行感冒的治療[1]。對(duì)免疫力低下的生理狀態(tài)有比較理想的免疫作用效果。本試驗(yàn)通過研究紫錐菊提取物對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)作用，為開發(fā)新型、安全、低毒的畜禽免疫調(diào)節(jié)劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠150只，雄性，體重18～22 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.1.2 藥材與試劑

紫錐菊提取物，HPLC檢查，指紋圖譜與紫錐菊提取物對(duì)照品圖譜吻合。含量測定：菊苣酸≥2.0%，多酚≥4.0%。印度墨汁、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、Hank's平衡鹽溶液、胎牛血清、刀豆蛋白A（ConA）、MTT、補(bǔ)體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑，綿羊紅細(xì)胞（SRBC）。

1.1.3 儀器設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱（德國BINDER，C170）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司，UV-2700）；高壓蒸汽滅菌器（濟(jì)南德強(qiáng)儀器有限公司，MJ-3780D）；酶標(biāo)儀（瑞士Tecan，Infinite 200 Pro）；離心機(jī)（sigma公司，3K15）；顯微鏡（日本Olympus，CX31）；恒溫水浴鍋（上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；電子天平（UX820S，日本島津公司；XS-105，梅特勒公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥

試驗(yàn)小鼠50只，分為正常對(duì)照組、免疫抑制對(duì)照組、紫錐菊提取物高、中、低劑量組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。除正常對(duì)照組外，各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺（100 mg·kg-1BW），1次·d-1，連續(xù)3 d，建立免疫抑制模型小鼠[2]。建模后高、中、低劑量組分別按240、120、60 mg·kg-1BW水平添加紫錐菊提取物，正常對(duì)照組、免疫抑制對(duì)照組給予等量的純化水，以20 mL·kg-1BW灌胃體積，1次·d-1，連續(xù)30 d后測定各項(xiàng)免疫指標(biāo)。分別進(jìn)行免疫器官指數(shù)及碳廓清試驗(yàn)、血清溶血素值的測定、脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 碳廓清試驗(yàn)及免疫器官指數(shù)測定

印度墨汁原液用生理鹽水稀釋4倍，各組小鼠尾靜脈注射10 mL·kg-1BW，注射墨汁后2、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，立即加入2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。以0.1%Na2CO3溶液作溶劑對(duì)照，600 nm波長處測定各試驗(yàn)組光密度值（OD）。采血結(jié)束，稱重后頸椎脫臼處死小鼠，取出胸腺、肝臟和脾臟，去掉筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)（a），同時(shí)計(jì)算胸腺/體重比值與脾臟/體重比值。

1.2.3 半數(shù)血清溶血素值（HC50）測定

每只小鼠腹腔注射2%（V/V）SRBC 0.2 mL，致敏后5 d，摘除眼球取血，2 000 r·min-1離心10 min，收集血清。將血清用SA緩沖液稀釋200倍，測定半數(shù)溶血值（HC50）。

1.2.4 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

無菌取脾，置于盛有Hank's液平皿中，用鑷子將脾磨碎，經(jīng)過200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，1 000 r·min-1離心10 min。將細(xì)胞懸浮于1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)·mL-1。將每1份脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，1孔加入ConA液75 μL，另1孔作為對(duì)照，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入5.0 mg·mL-1的MTT溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每孔作3個(gè)平行孔，570 nm波長測定光密度值（OD值）。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 紫錐菊提取物對(duì)小鼠碳廓清能力的影響

紫錐菊提取物對(duì)小鼠碳廓清能力的影響見表1。

表1 紫錐菊提取物對(duì)小鼠碳廓清能力的影響

由表1可見，免疫抑制對(duì)照組的碳廓清能力顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。給予環(huán)磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同劑量紫錐菊提取物30 d后，各劑量組均能恢復(fù)免疫抑制小鼠下降的碳廓清能力，低劑量組恢復(fù)能力與免疫抑制組比較差異不大（P＞0.05），中、高劑量組恢復(fù)能力與免疫抑制組比較有顯著性增高（P＜0.05），而且中劑量組能夠恢復(fù)到正常的水平。

2.2 紫錐菊提取物對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

紫錐菊提取物對(duì)免疫器官指數(shù)結(jié)果的影響見表2。

表2 對(duì)免疫器官指數(shù)結(jié)果的影響mg·g-1

由表2可見，免疫抑制對(duì)照組的胸腺和脾臟指數(shù)顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。給予環(huán)磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同劑量紫錐菊提取物30 d后，低，中、高各劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 紫錐菊提取物對(duì)小鼠血清溶血素值的影響

紫錐菊提取物對(duì)小鼠血清溶血素值的影響見表3。

表3 對(duì)小鼠血清溶血素值的影響

由表3可見，免疫抑制對(duì)照組的血清溶血素值顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。給予環(huán)磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同劑量紫錐菊提取物30 d后，低劑量組血清溶血素值與免疫抑制組比較差異不顯著（P＞0.05），中、高劑量組血清溶血素值與免疫抑制組相比較顯著提高（P＜0.05）。

2.4 紫錐菊提取物對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化結(jié)果的影響

紫錐菊提取物對(duì)對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果的影響見表4。

表4 對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果的影響

由表4可見，免疫抑制對(duì)照組的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。給予環(huán)磷酰胺免疫抑制模型小鼠不同劑量紫錐菊提取物30 d后，低、中劑量組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果與免疫抑制組比較差異不顯著（P＞0.05），高劑量組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果與免疫抑制組相比顯著提高（P＜0.05）。

3 討論

紫錐菊別名紫松果菊，花托為圓錐形，因其頭狀花序形似松果而得名，其主要功能成分為多糖、烷基酰胺類化合物和咖啡酸類衍生物[2]。吳江濤等研究顯示，紫錐菊提取物可以增強(qiáng)氫化可的松免疫抑制小鼠的單核巨噬細(xì)胞吞噬功能[3]。王樹琴等研究表明，紫錐菊提取物對(duì)肉雞體液免疫和細(xì)胞免疫均具有促進(jìn)作用[4]。巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，其吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一，小鼠碳廓清試驗(yàn)中所測得的吞噬指數(shù)可反映單核-巨噬細(xì)胞的吞噬能力[5-6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，各劑量組均能恢復(fù)免疫抑制小鼠下降的碳廓清能力，中、高劑量組恢復(fù)水平與免疫抑制組比較顯著提高（P＜0.05），而且中劑量組能夠恢復(fù)到正常的水平，其原因可能與中草藥免疫調(diào)節(jié)作用的雙向性有關(guān)。

免疫器官按其功能可分為中樞免疫器官和外周免疫器官，胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其臟器系數(shù)在一定程度上可以反映機(jī)體的免疫功能[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紫錐菊提取物低，中、高各劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)。血清溶血素試驗(yàn)和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是評(píng)價(jià)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫功能的經(jīng)典試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，中、高劑量組血清溶血素值與免疫抑制組比較有顯著性提高，高劑量組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果與免疫抑制組比較有顯著性提高。表明紫錐菊提取物可增強(qiáng)免疫抑制小鼠的體液和細(xì)胞免疫水平，其免疫調(diào)節(jié)作用可能與紫錐菊提取物能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞功能，刺激細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生有密切關(guān)系，其相應(yīng)的復(fù)雜藥理機(jī)制還需進(jìn)一步研究[7]。

4 結(jié)論

紫錐菊提取物具有調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠非特異性和特異性免疫的作用，是一種效果極好的免疫調(diào)節(jié)劑，如果能夠在生產(chǎn)中合理使用，可以很好地增加疾病的預(yù)防效果。