傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒外周血B淋巴細(xì)胞中免疫抑制因子的表達(dá)及意義

譚艷芳 黃小平 姜濤 歐陽(yáng)文獻(xiàn) 唐蓮 李雙杰

病毒感染后免疫異常是EB病毒（EB virus，EBV）相關(guān)感染性疾病的重要發(fā)病機(jī)制，免疫細(xì)胞表面表達(dá)的多種免疫抑制因子可抑制免疫細(xì)胞的增殖及活化、下調(diào)免疫反應(yīng)從而達(dá)到免疫抑制的作用[1]。本項(xiàng)目以健康兒童和傳染性單核細(xì)胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）患兒為研究對(duì)象，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)免疫抑制檢測(cè)點(diǎn)〔如程序性死亡受體-1（programmed death 1，PD-1）及其配體（PD-L1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）、含T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白（T cell Ig and ITIM domain，TIGIT）〕在IM發(fā)病機(jī)制中的作用，為臨床治療提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2017年4月—9月湖南省兒童醫(yī)院59例IM住院患者，分別于急性期和恢復(fù)期抽血，并簽署知情同意書。另選本院20例健康體檢兒童作為正常對(duì)照組，無(wú)EBV感染癥狀和體征，肝臟生化指標(biāo)正常，按性別、年齡匹配。

1.1.1 IM診斷標(biāo)準(zhǔn) IM診斷符合《兒童主要非腫瘤性EB病毒感染相關(guān)疾病的診斷和治療原則建議》[2]，既往無(wú) EBV 感染史。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并其他器官基礎(chǔ)疾病者及不合作者。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)室確診病例 符合下列臨床指標(biāo)中任意3項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)中第1～3項(xiàng)中任意一項(xiàng)。

1.1.3.1 臨床指標(biāo) ① 發(fā)熱；② 咽峽炎；③ 頸部淋巴結(jié)腫大；④ 脾臟腫大；⑤ 肝臟腫大；⑥ 眼瞼水腫。

1.1.3.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) ① 抗EBV-衣殼蛋白（viral capsid antigen，VCA）-免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）和抗EBV-VCA-IgG抗體陽(yáng)性，且抗EBV核心抗原（EB nuclear antigen，EBNA）-免疫球蛋白G（IgG）陰性；② 抗EBV-VCA-IgM抗體陰性，但抗EBV-VCA-IgG抗體陽(yáng)性，且為低親和力抗體；③ 雙份血清抗EBV-VCA-IgG抗體滴度升高4倍以上；④ 外周血異型淋巴細(xì)胞比例≥0.10和（或）淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（lymphocyte，Lym）升高（≥5.0×109/L）。

1.1.4 IM表現(xiàn)

1.1.4.1 急性期 有發(fā)熱、咽峽炎、頸部淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大，白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高（＞10×109/L）。

1.1.4.2 恢復(fù)期 體溫正常持續(xù)1周以上和（或）發(fā)病2周以上、無(wú)咽峽炎、肝臟縮小等臨床癥狀緩解。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臨床資料收集 詳細(xì)記錄臨床各項(xiàng)資料，包括基線資料，如姓名、性別、年齡、熱程（患者發(fā)熱以腋溫≥37.5 ℃為標(biāo)準(zhǔn)，從第1天開始計(jì)算，到體溫恢復(fù)正常并穩(wěn)定48 h為止；第2天08：00有發(fā)熱則記為發(fā)熱1 d，無(wú)發(fā)熱則不計(jì)入內(nèi)）以及肝臟腫大（4歲以下為2 cm以上、4歲以上為可觸及）、脾臟腫大（肋下1 cm以上）、轉(zhuǎn)氨酶升高〔丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶＞40 U/L和（或）天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶＞40 U/L〕、EBV-DNA定量（＞400拷貝/mL為升高）等臨床癥狀、體征和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.2 EBV抗體檢測(cè) 抽取靜脈血2 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定EBV的4種抗體，包括早期抗原（early antigen，EA）-IgG、VCA-IgM、VCA-IgG和EBNA-IgG。

1.2.3 EBV-DNA含量 標(biāo)本為血漿或血清，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)（正常參考范圍：＜400拷貝/mL）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）〔M（QR）〕表示；兩變量間相關(guān)性分析，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Pearson相關(guān)分析，符合非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 59例IM患者中男性35例（59.3%）、女性24例（40.7%）；年齡1歲1個(gè)月～10歲10個(gè)月；平均熱程（6.02±3.40）d；59例中有34例于恢復(fù)期抽血復(fù)查（其余25例患兒因檢測(cè)血標(biāo)本不合格或出院時(shí)未抽血），故IM恢復(fù)期組共納入34例。各組年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），說明有可比性。

2.2 3組免疫抑制因子表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，IM患者急性期組PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT在B淋巴細(xì)胞上表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）；在IM恢復(fù)期組上述各指標(biāo)均有所恢復(fù)，其中PD-L1、TIGIT與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）。且恢復(fù)期組 PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT與急性期組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 各組免疫抑制因子在外周血B淋巴細(xì)胞上表達(dá)水平的比較〔M（QR）〕

2.3 免疫抑制因子在IM患者外周血B細(xì)胞上的表達(dá)水平與EBV-DNA定量的相關(guān)性 共59例急性期患兒查EBV-DNA，平均為（8.44±2.04）×105拷貝/mL。相關(guān)性分析顯示，EBV-DNA定量與PD-1、PD-L1和CTLA-4表達(dá)無(wú)相關(guān)性，但與TIGIT表達(dá)呈明顯正相關(guān)。相關(guān)性分析公式如下：Y＝-235 242.276+45 480.922X（r＝0.371，P＝0.006）。見表 2，圖 1。

表2 免疫抑制因子在IM患者外周血B細(xì)胞上表達(dá)水平與EBV-DNA定量的相關(guān)性

圖1 TIGIT在IM患者B細(xì)胞上的表達(dá)水平與EBV-DNA定量的相關(guān)性

3 討論

IM是由EBV原發(fā)感染引起的急性感染性疾病，臨床上以發(fā)熱、咽喉痛、眼瞼浮腫、肝脾和淋巴結(jié)腫大及外周血出現(xiàn)異型淋巴細(xì)胞等為特征，臨床不典型病例逐漸增多，給診斷和治療帶來一定的困難。EBV主要累及B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，受感染的B淋巴細(xì)胞表明抗原發(fā)生變化，生成EBV特異性抗原，引起T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答而轉(zhuǎn)化為CD8+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞能殺傷感染的B細(xì)胞，有效清除EBV，從而導(dǎo)致IM一系列臨床癥狀呈自限性[3]。

以往研究顯示，免疫細(xì)胞表面存在正性刺激因子和免疫抑制因子表達(dá)，其相互維持免疫應(yīng)答和免疫耐受，如果免疫抑制因子過表達(dá)，與相應(yīng)受體結(jié)合后，就會(huì)產(chǎn)生抑制性信號(hào)，從而下調(diào)免疫應(yīng)答[4]。另外，嬰幼兒時(shí)期IM典型病例很少，主要原因是嬰幼兒不能對(duì)EBV產(chǎn)生充分免疫應(yīng)答，因此，宿主的免疫應(yīng)答在病毒清除過程中起著非常重要的作用。

PD-1主要在激活的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞中表達(dá)，功能是抑制細(xì)胞的激活，從而使細(xì)胞呈無(wú)反應(yīng)性。PD-L1是其配體，在病毒感染、腫瘤及某些免疫系統(tǒng)疾病患者中表達(dá)上調(diào)，形成免疫紊亂[5]。研究表明，PD-1與PD-L1結(jié)合在慢性乙型肝炎病毒感染中可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和活化，同時(shí)抑制細(xì)胞因子分泌，為HBV逃避免疫應(yīng)答發(fā)揮重要作用[6]。本研究還顯示，PD-1/PD-L1在IM急性期表達(dá)上調(diào)，形成免疫抑制，而在恢復(fù)期較之前下降，為細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)發(fā)揮正向作用，進(jìn)一步造成病毒清除，這與IM的發(fā)病進(jìn)程相符，由此推測(cè)PD-1/PD-L1可能在EBV復(fù)制和清除中發(fā)揮作用。

CTLA-4是T細(xì)胞上的一種跨膜受體，與B7分子結(jié)合后，能誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)[7]。Kared等[8]報(bào)道CTLA-4在慢性丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）患者外周血特異性CD4+T淋巴細(xì)胞上顯著表達(dá)，從而抑制其活化，在使用相關(guān)阻斷劑后特異性CD4+T淋巴細(xì)胞功能得以恢復(fù)，證實(shí)CTLA-4高表達(dá)參與HCV持續(xù)感染。本研究表明，CTLA-4在IM急性期表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其與配體結(jié)合后產(chǎn)生抑制性信號(hào)，誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，從而促進(jìn)EBV清除。

TIGIT是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族成員，主要表達(dá)于活化的免疫細(xì)胞表面，包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞和NK細(xì)胞等。有研究顯示，TIGIT可直接作用于T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞活化，也可與抗原提呈細(xì)胞上的PVR結(jié)合，增強(qiáng)其分泌抗炎因子白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10），從而抑制 T 細(xì)胞應(yīng)答[9]。Fromentin 等[10]的研究表明，CD4+T細(xì)胞單個(gè)或聯(lián)合表達(dá)PD-1、TIGIT、LAG-3在抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療中導(dǎo)致人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染持續(xù)加重。本研究顯示，IM患者急性期有TIGIT表達(dá)，通過與恢復(fù)期34例IM患者自身對(duì)照比較發(fā)現(xiàn)，急性期TIGIT在B細(xì)胞上的表達(dá)水平高于恢復(fù)期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與前面的研究結(jié)果相符。推測(cè)TIGIT在病毒的急性感染狀態(tài)下過表達(dá)，造成免疫失調(diào)，隨著疾病恢復(fù)和病毒逐漸被清除，機(jī)體免疫功能趨于正常，其表達(dá)量也隨之下降，以上研究表明免疫細(xì)胞表面的TIGIT表達(dá)可能與IM疾病進(jìn)展相關(guān)。

歐陽(yáng)文獻(xiàn)等[11]報(bào)道全血EBV-DNA拷貝數(shù)在疾病恢復(fù)后會(huì)持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間，故不建議判斷IM病情時(shí)檢測(cè)全血標(biāo)本，宜使用血清或血漿標(biāo)本，故本研究亦如此。已有研究顯示，EBV-DNA定量與IM病情的嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性，有助于該病的診斷[12]。免疫反應(yīng)失調(diào)可能造成EBV免于被自動(dòng)清除，從而導(dǎo)致該病毒不斷復(fù)制，甚至出現(xiàn)慢性感染的狀態(tài)，由此估計(jì)細(xì)胞表面的免疫抑制因子過表達(dá)使其免疫應(yīng)答下調(diào)，與EBV-DNA定量升高有關(guān)。因此本研究檢測(cè)TIGIT在B淋巴細(xì)胞上的表達(dá)率并分析其與EBV-DNA定量的相關(guān)性，結(jié)果顯示TIGIT在B細(xì)胞上的表達(dá)水平與EBV-DNA定量呈正相關(guān)，同時(shí)還顯示，TIGIT在IM急性期表達(dá)明顯上調(diào)，形成免疫失調(diào)，最終導(dǎo)致EBV不能被有效清除，使EBV-DNA定量升高。當(dāng)然，由于樣本量有限，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證該結(jié)果。本研究也顯示，IM患者EBV-DNA定量越高，其臨床癥狀越重，與以往研究結(jié)果一致。TIGIT是否可以作為重癥IM的預(yù)測(cè)指標(biāo)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)還將進(jìn)一步深入研究探索。