人參全草免疫調(diào)節(jié)作用研究△

任國慶，鄒曉峰，韓亞男，竇德強(qiáng)*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.遼寧萬嘉醫(yī)藥科技有限公司，遼寧 本溪 117000

人參應(yīng)用歷史悠久，功能作用廣泛，早在西漢時期，就在治療和防御疾病等方面被廣泛應(yīng)用。人參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，書中描述其“味甘，微寒。主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智”?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參具有益智[1]、免疫調(diào)節(jié)[2-3]、改善心血管系統(tǒng)[4-5]、抗衰老[6]和抗腫瘤[7]等多種藥理作用。自古野生人參資源稀少，園參的栽種雖解決了人參藥用資源不足的問題，但園參的毀林種植方式嚴(yán)重破壞了生態(tài)資源。近年來，林下山參發(fā)展迅速。林下山參是人為地把人參種子撒播到山林野生狀態(tài)下，任其自然生長而長成，因林下山參的生態(tài)環(huán)境與野山參相似，其品質(zhì)及藥用價值又接近野山參的水平，且能保護(hù)生態(tài)平衡。2008年國家標(biāo)準(zhǔn)委頒布的《野山參鑒定及分等質(zhì)量》中，將林下山參納入野山參的范疇?，F(xiàn)如今林下山參已成為高品質(zhì)商品人參的主要來源。人參根和地上部分都有較好的藥用價值，目前人參方面的研究主要是單獨對人參根或人參莖葉進(jìn)行研究，本研究擬對林下山參全草的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究，從細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性4個方面對林下山參全草在免疫功能方面的作用進(jìn)行研究，以期為林下山參全草的綜合利用奠定基礎(chǔ)，為林下山參全草調(diào)節(jié)免疫作用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實驗材料

林下山參全草由參仙源生物工程有限公司提供，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.。將樣品粉碎，以林下山參根∶林下山參莖葉=1∶2的比例混合(因十五年生林下山參的干燥品根與莖葉比重約為1∶2，故以此比例混合林下山參根和莖葉粉末)。參考2015版《中華人民共和國藥典》人參日攝入量，將林下山參全草日攝入量設(shè)計為1.5 g/60 kg，以生藥粉作為受試物，蒸餾水做溶劑。

1.2 實驗動物

選用遼寧長生生物技術(shù)有限公司繁殖的SPF級18～22 g雄性昆明種小鼠(SCXK 2010-0001)。動物實驗室，恒溫恒濕，溫度(22±1.5)℃，濕度50%±10%，人工照明12 h，黑夜12 h。

1.3 儀器與試劑

電子分析天平(上海光正醫(yī)療器械有限公司)；KC-100酶標(biāo)分析儀(深圳凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；UV2100型紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)；奧林巴斯BX51TRF顯微鏡；TD24-WS臺式低速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

豚鼠血清、小牛血清(杭州四季青生物工程公司)；硝基氯化四氮唑(INT)、乳酸鋰、刀豆蛋白A(Con A)、噻唑藍(lán)(MTT)、Hank’s液(pH 7.2-7.4)(美國Sigma公司)；水楊酸緩沖液(SA緩沖液)、PBS緩沖液(pH7.2～7.4)(北京索萊寶科技有限公司)；瓊脂糖(上海耐今實業(yè)有限公司)；印度墨汁(北京篤信精細(xì)制劑廠)；Na2CO3(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、雞紅細(xì)胞、YAC-1細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)(Biochemika公司)；Tris base(Amresco公司)；2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；丙酮、鹽酸、異丙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；氧化型輔酶Ⅰ(NAD)(Roche公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞免疫功能實驗

2.1.1 Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗

2.1.1.1 實驗動物分組及給藥 雄性昆明種小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為4組，分別為溶劑對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只小鼠。分別給予林下山參全草生藥粉低劑量(0.25 g·kg-1)、中劑量(0.50 g·kg-1)、高劑量(0.75 g·kg-1)(相當(dāng)于人體日攝入量的10倍、20倍、30倍)，溶劑對照組給予等量的蒸餾水。每天灌胃1次，連續(xù)30 d，按體重調(diào)整灌胃量(灌胃量按20 mL·kg-1計算)。

2.1.1.2 脾細(xì)胞懸液制備 末次給藥12 h后，取脾放入盛有Hank’s液的平皿中，將脾磨碎制成單細(xì)胞懸液，1000 r·min-1離心10 min，用Hank’s液洗2遍，最后將細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)液中，計數(shù)活細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度。

2.1.1.3 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)與測定 參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行測定。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加75 μL Con A液，另一孔作為對照，置5%CO2、37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時加入MTT50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，混勻使結(jié)晶完全溶解。使用分光光度計在570 nm波長下測定吸光度。

2.1.2 二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)實驗 實驗動物分組及給藥同2.1.1.1。

2.1.2.1 致敏 給藥24 d后，大鼠腹部脫毛，用DNFB溶液50 μL均勻涂抹進(jìn)行致敏處理。

2.1.2.2 DTH的產(chǎn)生與測定 5 d后，用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳。于涂抹后24 h處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下耳片，稱重。

2.2 體液免疫功能實驗

2.2.1 抗體生成細(xì)胞檢測 參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行測定，實驗動物分組及給藥同2.1.1.1。

2.2.1.1 SRBC免疫 取新鮮綿羊血，用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次，每次離心(2000 r·min-1)10 min，將壓積SRBC用0.9%氯化鈉溶液配成2%(v/v)的細(xì)胞懸液，在第24天給藥結(jié)束后，每只鼠腹腔注射0.2 mL。

2.2.1.2 制備補(bǔ)體 將1 mL壓積SRBC加入到5 mL豚鼠血清中，4 ℃冰箱放置30 min，經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝，-70 ℃保存。用時以SA液按1∶8稀釋。

2.2.1.3 片架的制作 取潔凈的載玻片，粘兩條透明膠帶，中間留有約15 mm的間隔，在膠帶上薄涂一層凡士林。

2.2.1.4 脾細(xì)胞懸液制備 將SRBC免疫5 d后的小鼠處死，取脾臟，放入盛有Hank’s液的平皿內(nèi)，將脾磨碎制成細(xì)胞懸液，1000 r·min-1離心10 min，用Hank’s液洗2遍，將細(xì)胞懸浮在RPMI1640培養(yǎng)液中，計數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度。

2.2.1.5 空斑的測定 將表層培養(yǎng)基(1 g瓊脂糖加雙蒸水至100 mL)加熱溶解后，放45 ℃水浴保溫，與等量pH7.4、2倍濃度的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內(nèi)加50 μL 10%SRBC(v/v，用SA液配制)，20 μL脾細(xì)胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的20 mm×20 mm蓋玻片上，待瓊脂凝固后，將蓋玻片水平扣放在自制片架上，用鑷子尾端將蓋玻片壓平貼牢。放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。用凡士林將蓋玻片一端封住，然后將用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1∶8)加入到凹槽內(nèi)，繼續(xù)孵育1.5 h后，觀察凹槽內(nèi)空斑，低倍鏡下檢查并計數(shù)出現(xiàn)的溶血空斑。真正的溶血空斑必須中心有一個淋巴細(xì)胞，周圍為透明區(qū)。

樣本出現(xiàn)的空斑數(shù)

(1)

2.2.2 血清溶血素的測定 實驗動物分組及給藥同2.1.1.1。SRBC免疫同2.2.1.1。末次給藥12 h后，小鼠眼眶取血，制備血清，用0.9%氯化鈉溶液將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi)，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%(v/v)的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37 ℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度。血球凝集程度一般分為5級(0～Ⅳ)記錄，按下式計算抗體積數(shù)。

抗體積數(shù)=(S1+2S2+3S3……nSn)

(2)

式中1、2、3……n代表對倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0級：紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清晰；Ⅰ級：紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成圓點狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞；Ⅱ級：凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點；Ⅲ級：凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點；Ⅳ級：凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。

2.3 單核-巨噬細(xì)胞功能實驗

2.3.1 小鼠碳廓清實驗 實驗動物分組及給藥同2.1.1.1。末次給藥12 h后，從小鼠尾靜脈注入稀釋5倍的印度墨汁，按每10 g體質(zhì)量0.1 mL計算。待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加到2 mL Na2CO3溶液中。以600 nm波長測定吸光度A，以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)α。

(3)

t1：注入墨汁后第一次從內(nèi)眥靜脈叢取血的時間；t2：注入墨汁后第二次從內(nèi)眥靜脈叢取血的時間；A1：第一次取血測得的吸光度；A2：第二次取血測得的吸光度。

(4)

2.3.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗 實驗動物分組及給藥同2.1.1.1。參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行測定。末次給藥12 h后，每鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，間隔30 min，頸椎脫臼處死動物，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入0.9%氯化鈉溶液2 mL，轉(zhuǎn)動鼠板1 min。然后吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕沙布的搪瓷盒內(nèi)，移置37 ℃孵箱溫育30 min。孵畢，于0.9%氯化鈉溶液中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4%(v/v)Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min，再用大豆色拉油漂洗晾干。油鏡下計數(shù)巨噬細(xì)胞，每張片計數(shù)100個，以吞噬百分率表示小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。按下式計算吞噬百分率。

(5)

2.4 NK細(xì)胞活性實驗

實驗動物分組及給藥同2.1.1.1[10]。

2.4.1 LDH基質(zhì)液的配制 乳酸鋰5×10-2、INT 6.6×10-4、PMS 2.8×10-4、NAD 1.3×10-3mol·L-1，將上述試劑溶于0.2mol·L-1的Tris-HCl緩沖液中(pH8.2)。

2.4.2 靶細(xì)胞的傳代(YAC-1細(xì)胞) 實驗前24 h將靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以Hank’s液洗3次，用RPMI 1640憲全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/mL。

2.4.3 脾細(xì)胞懸液的制備(效應(yīng)細(xì)胞) 末次給藥12 h后，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，用200目濾網(wǎng)將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液。用Hank’s液洗2次，每次離心(1000 r·min-1)10 min。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0.5 mL滅菌水20 s，裂解紅細(xì)胞后再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及8 mL Hank’s液，1000 r·min-1離心10 min，用1 mL含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸，用臺酚蘭染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)，最后用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個/mL。

2.4.4 LDH活性檢測 取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和2.5%Triton各100 μL；上述各項均設(shè)3個平行孔，于5%CO2、37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500 r·min-1離心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)3 min，每孔加入1 mol·L-1的HC1 30 μL，在酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度A。按下式計算NK細(xì)胞活性。

(6)

2.5 臟器指數(shù)測定

實驗動物分組及給藥同2.1.1.1。末次給藥12 h后，小鼠稱重，眼眶取血，制備血清，備用；小鼠脫頸椎處死后，取其胸腺和脾臟，稱重，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

(7)

2.6 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 結(jié)果

3.1 臟器指數(shù)測定結(jié)果

由圖1知，各實驗組胸腺及脾臟指數(shù)與樣品溶劑對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果

3.2 DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH實驗結(jié)果

由圖2知，各實驗組的左右耳質(zhì)量差值與樣品溶劑對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH實驗左右耳質(zhì)量差測量結(jié)果

3.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗

由圖3知，中、高劑量實驗組的波光度差值顯著高于樣品溶劑對照組(P<0.01)，而低劑量實驗組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示林下山參全草對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化有增強(qiáng)作用且與其劑量呈正相關(guān)。

注：與溶劑對照組比較，**P<0.01。

3.4 小鼠抗體生成細(xì)胞檢測和小鼠血清溶血素測定結(jié)果

由圖4(A)知，低、中劑量實驗組中溶血空斑數(shù)顯著高于樣品溶劑對照組(P<0.01)；由圖4(B)知，低、中劑量實驗組中血清溶血素抗體積數(shù)顯著高于樣品溶劑對照組(P<0.01)，表明林下山參全草對血清溶血素和抗體生成細(xì)胞的產(chǎn)生有增強(qiáng)作用。

注：A.抗體生成細(xì)胞檢測空斑數(shù)；B.血清溶血素實驗抗體積數(shù)測定結(jié)果；與溶劑對照組比較，**P<0.01。

3.5 小鼠碳廓清實驗結(jié)果

由圖5知，只有低劑量實驗組的吞噬指數(shù)α顯著高于樣品溶劑對照組(P<0.01)，表明林下山參全草對調(diào)節(jié)小鼠碳廓清能力作用較緩和。

注：與溶劑對照組比較，**P<0.01。

3.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗結(jié)果

由圖6知，各實驗組的吞噬百分率與樣品溶劑對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明林下山參全草對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)節(jié)作用不顯著。圖7中，藍(lán)紫色為被染色劑染為藍(lán)紫色的未吞噬的巨噬細(xì)胞，紫黑色為吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。

注：A.未吞噬的巨噬細(xì)胞；B.吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。

圖7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗吞噬細(xì)胞顯微圖片

3.7 小鼠NK細(xì)胞活性測定實驗結(jié)果

由圖8知，各實驗組小鼠NK細(xì)胞活性與樣品溶劑對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明林下山參全草對NK細(xì)胞活性無顯著性調(diào)節(jié)作用。

圖8 小鼠NK細(xì)胞活性測定結(jié)果

4 討論

人參歷為大補(bǔ)元氣之圣藥，全草均可入藥，其自上而下以葉補(bǔ)肺氣、根莖補(bǔ)脾胃之氣、果填補(bǔ)腎精，猶若人體之有肺、脾胃及腎三臟，渾然一體，不僅切合取象比類思維，同時“全人參”作為一個整體，入藥補(bǔ)氣亦是中醫(yī)整體觀的具體體現(xiàn)[11]。目前主要針對人參根或人參莖葉免疫作用研究，而未見對人參全草免疫作用相關(guān)報道，本文以林下山參全草為對象，從細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性4個方面，探討其對小鼠免疫功能的影響。

細(xì)胞免疫主要是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的一種特異性免疫反應(yīng)。正常機(jī)體的T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中受到特異性抗原或有絲分裂原刺激，可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低表示細(xì)胞免疫水平低下。Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗，其轉(zhuǎn)化率常被用來衡量機(jī)體細(xì)胞免疫水平；T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低，意味著在外來因子的刺激下淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)降低，機(jī)體的免疫力下降[8]。DHT是T細(xì)胞功能的測定方法，其反應(yīng)主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷，DNFB是常用的誘生接觸型超敏反應(yīng)致敏原[12]。有研究表明，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗可對DTH實驗的結(jié)果進(jìn)行驗證[13]，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以對小鼠進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗和DTH實驗，以確定林下山參全草對小鼠細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，林下山參全草中、高劑量組與對照組相比均極顯著提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但林下山參全草對小鼠DTH無顯著性影響。DNFB誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)則是反應(yīng)細(xì)胞免疫的經(jīng)典實驗，且淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果多用來佐證DTH，該結(jié)果陰性，表明林下山參全草對促進(jìn)細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)無顯著性作用，但可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

體液免疫是由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)。B細(xì)胞可以識別相應(yīng)的抗原，通過抗原-抗體反應(yīng)清除病原體，維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[10]?？贵w生成細(xì)胞檢測實驗中每個釋放溶血性抗體的B淋巴細(xì)胞在補(bǔ)體的參與下可溶解周圍的綿羊紅細(xì)胞，在周圍形成一個可見的空斑。一個空斑代表一個抗體生成細(xì)胞，空斑的數(shù)量反映機(jī)體的體液免疫功能。血清溶血素的水平是機(jī)體免疫功能的主要指標(biāo)，反映了B細(xì)胞的增殖分化以及與補(bǔ)體結(jié)合后向體液中分泌溶血素的能力，用以檢測藥物對機(jī)體防御能力的影響[14]。本實驗結(jié)果顯示，林下山參全草低、中劑量組與對照組相比能顯著提高血清溶血素和抗體生成細(xì)胞的水平，表明林下山參全草能促進(jìn)小鼠產(chǎn)生血清溶血素和抗體生成細(xì)胞，從而增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，并且其藥理作用有最適劑量。

固有免疫也稱為非特異性免疫，其中單核巨噬細(xì)胞的作用是在激活免疫應(yīng)答前發(fā)揮吞噬功能清除外來病原體。巨噬細(xì)胞是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的主要成員，它的主要作用是吞噬病原體，促進(jìn)活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞殺傷感染的細(xì)胞[15]。評價單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能常采用碳廓清實驗，當(dāng)碳顆粒進(jìn)入血液后，血液中的吞噬細(xì)胞便開始吞噬異物顆粒。NK細(xì)胞是一種對靶細(xì)胞的殺傷不具有特異性的細(xì)胞，可以直接清除感染病原的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，在抵抗病原感染和清除腫瘤細(xì)胞過程中發(fā)揮著非常重要的作用[16]。由于吞噬細(xì)胞強(qiáng)大的吞噬和殺傷作用，它們的功能強(qiáng)弱常用來反映了藥物對機(jī)體非特異性免疫功能調(diào)節(jié)作用的強(qiáng)弱。免疫器官可分為中樞免疫器官(胸腺、骨髓)和外周免疫器官(脾臟、淋巴結(jié)等)，是機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生和寄宿的地方，對維持機(jī)體免疫性能起重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，各實驗組中脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、NK細(xì)胞活性差異不顯著，只有低劑量組的碳廓清吞噬指數(shù)α有顯著性升高。表明林下山參全草對小鼠免疫器官發(fā)育和固有免疫的作用不顯著。

周婭紅[17]研究發(fā)現(xiàn)，人參總皂苷可提高免疫低下小鼠的臟器指數(shù)、碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)；提高免疫低下小鼠血清IgM和IgG的生成；促進(jìn)免疫低下小鼠DTH。趙蕭蕭[18]從人參葉中提取水溶性多糖，并觀察其對小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)給予小鼠人參葉多糖，可以顯著增加小鼠脾臟、胸腺器官指數(shù)，明顯提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力及脾細(xì)胞增殖能力。曾祥云等[19]研究人參片對小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)其對小鼠脾臟、胸腺器官指數(shù)、脾細(xì)胞增殖能力、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力及抗體生成細(xì)胞數(shù)均無顯著性影響，但顯著性提高DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH形成能力及NK細(xì)胞活性。結(jié)合已有報道，林下山參全草與之相比對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的差異較大。首先免疫器官方面，胸腺和脾臟的臟器指數(shù)常作為評價藥物對機(jī)體免疫器官發(fā)育的變化的調(diào)節(jié)指標(biāo)。已有研究表明，人參及其總皂苷均能促進(jìn)免疫器官發(fā)育，這與本文結(jié)果不同，推測未能促進(jìn)免疫器官發(fā)育可能和人參地上部分的藥理作用有關(guān)聯(lián)。但人參葉多糖也具有促進(jìn)免疫器官發(fā)育的作用，所以推測可能與人參葉中非多糖成分有關(guān)，而人參葉中含有較多的人參皂苷Re和Rd，其是否對免疫器官發(fā)育有影響，有待進(jìn)一步研究。其次細(xì)胞免疫功能方面，Cho等[20]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1和Re能顯著地促進(jìn)Con A誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖，Rb2能強(qiáng)烈地抑制Con A、植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)的誘導(dǎo)作用。本文中林下山參全草能顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力，推測林下山參全草因含地上部分較多，故含有較多的人參皂苷Re，且人參皂苷Re的促進(jìn)作用強(qiáng)于人參皂苷Rb2抑制作用，促進(jìn)了淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。而對促進(jìn)DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH形成能力無顯著性影響，推測可能是某單體皂苷抑制了DNFB的誘導(dǎo)作用，具體有效成分有待進(jìn)一步研究；然后體液免疫功能方面，Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh1體外對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖無明顯作用。楊秀偉等[22]對近些年人參及其皂苷的藥理學(xué)作用的總結(jié)中表明，在LPS刺激的巨噬細(xì)胞模型中，Rg1能抑制轉(zhuǎn)移生長因子的表達(dá)且能顯著提高小鼠腫瘤模型的免疫功能。丁艷芳[23]總結(jié)近些年對人參皂苷Rh1的藥理作用，認(rèn)為其與Rg1有相似的藥理作用。本文林下山參全草能提高小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)和血清抗體積數(shù)，而人參只能提高小鼠的血清抗體積數(shù)，故推測人參皂苷Rd對小鼠的體液免疫有調(diào)節(jié)作用。

綜上，林下山參全草與人參對小鼠免疫功能的影響差異主要在于細(xì)胞免疫及NK細(xì)胞活性；人參葉多糖對小鼠免疫功能的影響差異主要在于固有免疫和免疫器官；與人參總皂苷對小鼠免疫功能的影響差異主要在于細(xì)胞免疫和固有免疫。以上研究說明對小鼠免疫調(diào)節(jié)的不同作用可能與人參皂苷的種類及其含量有關(guān)，且各組分間相互影響。林下山參全草能夠調(diào)節(jié)小鼠免疫功能，主要體現(xiàn)在體液免疫功能方面，對于其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理及各單體皂苷對免疫調(diào)節(jié)的影響，還有待于進(jìn)一步研究。