毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)研究龍血竭有效單體與核酸適配體及凝血酶之間的相互作用

李玉娟， 孫欣欣， 李盼盼， 歐婉露， 屈鋒

(北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081)

中藥龍血竭作為一種名貴中藥材，是從百合科植物劍葉龍血樹(shù)Dracaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen中提取得到的紅色樹(shù)脂，被譽(yù)為“活血圣藥”,主要分布于我國(guó)的云南省、廣西省等地區(qū). 現(xiàn)代研究顯示龍血竭具有活血、消炎、消腫等多種藥效[1-2], 其有效成分為酚類[3].以7,4′-二羥基黃酮(7,4′-dihydroxyflavanone,DHF)為代表的黃酮類；以白藜蘆醇(Resveratrol,RES)為代表的茋類；還有二氫查耳酮類，如龍血素A(Loureirin A,LA)、龍血素B(Loureirin B,LB)、龍血素C(Loureirin C,LC)等. 其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示. 研究發(fā)現(xiàn)，龍血竭可能通過(guò)影響體內(nèi)的凝血系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮藥效[4]，但其是否直接作用于體內(nèi)凝血酶以及是否作用于凝血酶上的肝素結(jié)合位點(diǎn)等問(wèn)題目前均未見(jiàn)報(bào)道.

圖1 LA、LB、LC、RES和DHF的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of LA、LB、LC、RES and DHF

核酸適配體(aptamer,Apt)是單鏈的DNA或RNA分子，主要通過(guò)體外隨機(jī)的核苷酸文庫(kù)中篩選而獲得[5-7]. 核酸適配體與靶標(biāo)之間的特性，類似于抗原抗體之間的作用，但是又有很多抗體無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì). 由于核酸適配體與靶標(biāo)之間能夠特異性結(jié)合，當(dāng)核酸適配體與龍血竭有效成分也發(fā)生結(jié)合時(shí)，就會(huì)靶向轉(zhuǎn)運(yùn)龍血竭有效成分，增加龍血竭的血藥濃度，從而發(fā)揮增強(qiáng)藥效的作用. 現(xiàn)在已成功篩選到了兩條凝血酶核酸適配體，其中一條由29個(gè)堿基(Apt29)構(gòu)成，與凝血酶上的肝素結(jié)合位點(diǎn)高親和性的結(jié)合，發(fā)揮抑制蛋白活性的作用[8-10].

研究藥物分子與生物大分子間的相互作用對(duì)于深入闡明中藥的作用機(jī)理，在體內(nèi)的代謝過(guò)程以及配伍問(wèn)題具有重要的意義，主要的分析技術(shù)有色譜法、光譜法、表面等離子體共振技術(shù)、毛細(xì)管電泳法等[11-14]，其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)(capillary zone electrophoresis,CZE)被廣泛用于分析生物分子間相互作用. 目前未見(jiàn)有報(bào)道龍血竭有效活性分子與凝血酶及其核酸適配體之間相互作用的研究. 文中采用CZE法考察龍血竭有效單體與牛凝血酶(bovine thrombin,B-Thr)之間的相互作用，并對(duì)有效成分與核酸適配體之間的結(jié)合強(qiáng)弱進(jìn)行研究.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 7100毛細(xì)管電泳儀購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司. 實(shí)驗(yàn)中采用的電泳分離通道是非涂層石英毛細(xì)管(內(nèi)徑75 μm；有效長(zhǎng)度/總長(zhǎng)度40/48.5 cm)購(gòu)自河北鑫諾光纖有限公司.

龍血素A(LA)、龍血素B(LB)、龍血素C(LC)、7,4′-二羥基黃酮(DHF)、白藜蘆醇(RES)的對(duì)照品(純度>99.9%)，購(gòu)自上海友思生物技術(shù)有限公司；29堿基凝血酶核酸適配體(Apt29)，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；牛凝血酶(B-Thr)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

1.2 溶液配制

1.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液

分別稱取LA、LB、LC、DHF、RES對(duì)照品適量，配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的LA、LB、LC、DHF、RES對(duì)照品儲(chǔ)備液. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用超純水稀釋并置于4 ℃冰箱保存.

1.2.2適配體和凝血酶溶液

按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)先將Apt29離心并用規(guī)定量蒸餾水溶解配成母液，用蒸餾水配制成濃度為100 μmol/L的B-Thr母液. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用超純水稀釋并置于4 ℃冰箱保存.

1.2.3樣品溶液

將龍血竭各有效單體分子分別與不同濃度的B-Thr溶液(或Apt29溶液)等體積混合，建立兩者的混合孵育體系，并于25 ℃水浴中孵育30 min 后，利用毛細(xì)管電泳儀對(duì)混合液進(jìn)行進(jìn)樣分析.

1.3 毛細(xì)管電泳條件

電泳運(yùn)行緩沖液為pH8.5的Tris-HCl溶液(0.05 mol/L)，同時(shí)含10 mmol/L KCl；3.45 kPa氣壓進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間5 s，分離溫度15 ℃，分離電壓+15 kV，檢測(cè)龍血竭有效單體與B-Thr相互作用時(shí)，紫外波長(zhǎng)設(shè)為214 nm，檢測(cè)與Apt29相互作用時(shí)，紫外波長(zhǎng)設(shè)為330 nm.

1.4 結(jié)合常數(shù)計(jì)算方法

在研究化合物的相互作用過(guò)程中，通常用結(jié)合常數(shù)Kb來(lái)表示作用強(qiáng)弱. 特異性相互作用的Kb通過(guò)Scatchard方程[15]來(lái)計(jì)算，分子間相互作用較弱時(shí)的Kb以非特異性結(jié)合方程計(jì)算[16-17].

2 結(jié)果與討論

2.1 龍血竭有效單體與凝血酶之間結(jié)合作用的測(cè)定

分別將一定濃度龍血竭中的5種有效活性成分(LA、LB、LC、RES、DHF)溶液與不同濃度(0～25 μmol/L)的B-Thr混合，兩者如果發(fā)生結(jié)合作用，則會(huì)生成復(fù)合物，此時(shí)游離龍血竭單體成分的峰面積會(huì)降低，因此通過(guò)觀察混合樣品中游離龍血竭有效單體峰面積的變化，可以計(jì)算出兩者的結(jié)合常數(shù). 電泳圖如圖2所示.

隨著兩者混合體系中B-Thr濃度(1～25 μmol/L)的逐漸增加，LA峰面積逐漸降低，峰形穩(wěn)定,如圖2(a). 說(shuō)明B-Thr在此濃度范圍內(nèi)，LA結(jié)合到B-Thr的活性位點(diǎn)上，發(fā)生了明顯的相互作用. 同樣考察龍血竭其余幾個(gè)有效單體與B-Thr之間的相互作用. 當(dāng)B-Thr濃度(5～20 μmol/L)增加時(shí)，LB的峰面積幾乎不變，如圖2(b). 即游離LB的濃度幾乎不變，說(shuō)明LB與B-Thr沒(méi)有結(jié)合作用. 不斷增加混合體系中B-Thr的濃度(1～10 μmol/L)，從電泳圖譜中統(tǒng)計(jì)得到化合物L(fēng)C的峰面積數(shù)據(jù)沒(méi)有明顯減小的趨勢(shì)，如圖2(c). 但是峰形出現(xiàn)了微弱的展寬,這些現(xiàn)象說(shuō)明化合物L(fēng)C與B-Thr之間結(jié)合作用非常微弱，推測(cè)當(dāng)藥物進(jìn)入體內(nèi)后，大部分并未結(jié)合到凝血酶的活性位點(diǎn). 化合物RES的峰面積隨著混合體系中B-Thr濃度的增加也沒(méi)有出現(xiàn)下降趨勢(shì),如圖2(d). 說(shuō)明RES跟B-Thr混合后仍以游離態(tài)存在，并未與B-Thr發(fā)生結(jié)合作用. 當(dāng)B-Thr濃度(1.0～7.5 μmol/L)增加時(shí)，DHF的峰面積沒(méi)有明顯變化,如圖2(e). DHF的游離濃度沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明DHF與B-Thr沒(méi)有結(jié)合作用. 通過(guò)用Scatchard方程和非特性結(jié)合方程計(jì)算得到LA和B -Thr之間的結(jié)合常數(shù)Kb為4.73×104L/mol.

圖2 LA、LB、LC、RES及DHF與不同濃度(0～25 μmol/L)B-Thr孵育后化合物的毛細(xì)管電泳圖Fig.2 CE chromatograms of LA、LB、LC、RES and DHF incubated with different concentration B-Thr (0～25 μmol/L)

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，龍血竭中的5種主要活性成分與凝血酶的結(jié)合作用過(guò)程中，同屬于二氫查耳酮類的龍血素A、龍血素B、龍血素C，只有龍血素A表現(xiàn)出了結(jié)合作用，推測(cè)LA進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)與凝血酶上的活性位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮其藥效. 其余的幾種化合物仍然以游離狀態(tài)存在，未結(jié)合到凝血酶分子中. 對(duì)比三者的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以看出，LB、LC分子中B環(huán)上2位和4位上取代基的類型對(duì)化合物與凝血酶的結(jié)合作用可能產(chǎn)生重要影響. LA分子的構(gòu)象更加適應(yīng)與B-Thr結(jié)合位點(diǎn)的嵌合. 可見(jiàn)，化合物苯環(huán)上取代基的類型以及所在苯環(huán)中的位置對(duì)結(jié)合起重要作用.

2.2 龍血竭有效單體與Apt29之間結(jié)合作用的測(cè)定

分別將一定濃度的龍血竭中5種主要活性成分與不同濃度(0～40 μmol/L)的Apt29溶液混合孵育后，利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)測(cè)定混合樣品中游離龍血竭有效單體濃度,如圖3所示.

圖3 LA、LB、LC、RES及DHF與不同濃度(0～40 μmol/L)Apt29孵育后化合物的毛細(xì)管電泳圖Fig.3 CE chromatograms of LA、 LB、LC、RES and DHF incubated with different concentration Apt29 (0～40 μmol/L)

隨著Apt29濃度(10～30 μmol/L)增加，電泳圖中對(duì)LA峰面積進(jìn)行積分，在凝血酶5個(gè)濃度梯度下游離LA峰面積幾乎保持不變,如圖3(a)，說(shuō)明LA與Apt29之間沒(méi)有發(fā)生結(jié)合作用. LB峰面積隨著兩者混合體系中Apt29濃度(5～40 μmol/L)依次增加而出現(xiàn)明顯降低趨勢(shì),如圖3(b)，說(shuō)明LB與Apt29有結(jié)合作用. 隨著體系中Apt29濃度梯度(6～30 μmol/L)依次增加，LC的峰面積沒(méi)有發(fā)生明顯變化,如圖3(c)，說(shuō)明LC與Apt29沒(méi)有結(jié)合作用. 隨著Apt29濃度(10～30 μmol/L)增加，RES峰面積幾乎不變,如圖3(d)，峰形穩(wěn)定，化合物RES與Apt29之間也未發(fā)生結(jié)合現(xiàn)象. 在藥物與核酸適配體的混合體系中，依次增加Apt29濃度(6～30 μmol/L)，DHF峰面積出現(xiàn)降低趨勢(shì)且變成鈍峰,如圖3(e)，說(shuō)明此濃度范圍內(nèi)DHF與Apt29之間產(chǎn)生了明顯相互作用.

用Scatchard方法計(jì)算LB、DHF與Apt29之間的結(jié)合常數(shù)時(shí),所得曲線斜率為正，同樣用非特異性結(jié)合方程計(jì)算各單體與Apt29的結(jié)合常數(shù). 龍血素B、DHF與Apt29之間的結(jié)合常數(shù)Kb分別為1.98×104L/mol和1.83×104L/mol.

龍血竭中幾個(gè)化合物分子與核酸適配體之間同樣也表現(xiàn)出了一定的結(jié)合作用，這對(duì)于揭示核酸適配體攜帶藥物的能力提供一定參考. 比較LA、LB的化學(xué)結(jié)構(gòu)，LB在苯環(huán)B環(huán)6位上增加了一個(gè)—OCH3，使LB與Apt29之間發(fā)生了結(jié)合作用，說(shuō)明苯環(huán)B環(huán)6位上的—OCH3可能與Apt29上的親電子基團(tuán)發(fā)生靜電結(jié)合作用. LA、LC與Apt29均沒(méi)有顯著的結(jié)合，說(shuō)明苯環(huán)B環(huán)上4位的—OH或—OCH3取代對(duì)藥物分子和Apt29之間的結(jié)合沒(méi)有產(chǎn)生影響. DHF與Apt29之間也有結(jié)合作用，說(shuō)明黃酮類的平面共軛結(jié)構(gòu)也是藥物分子與能形成G四鏈體結(jié)構(gòu)的核酸(quadruplexDNA)分子結(jié)合的一個(gè)因素.

3 結(jié) 論

文中采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法研究了龍血竭中的LA、LB、LC、RES、DHF與牛凝血酶以及29堿基凝血酶核酸適配體之間的相互作用. 結(jié)果表明，LA與牛凝血酶之間為非特異性結(jié)合，結(jié)合常數(shù)Kb為4.73×104L/mol. LB、DHF與Apt29之間是非特異性結(jié)合，結(jié)合常數(shù)分別為1.98×104L/mol和1.83×104L/mol. 這種結(jié)合作用大小或與化合物苯環(huán)上取代基團(tuán)的位置、種類、數(shù)量等因素有關(guān). 研究中藥龍血竭與凝血酶及適配體之間的結(jié)合作用，有助于闡明龍血竭在體內(nèi)的藥效學(xué)規(guī)律，從而指導(dǎo)中藥的合理用藥發(fā)揮重要影響. 研究結(jié)果對(duì)于揭示龍血竭有效單體是否直接作用于凝血酶而發(fā)揮藥效，以及凝血酶核酸適配體能否作為龍血竭的轉(zhuǎn)運(yùn)體以實(shí)現(xiàn)定向轉(zhuǎn)運(yùn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考.