尿路微生物與泌尿系統(tǒng)腫瘤相關性的研究進展

丁 煜,王 寧,王 晨,段黃琪,沈海波,齊 雋

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院泌尿外科,上海 200092)

我們體內的微生物通常被稱為“被遺忘的機關”,擁有超過我們自己的基因組100多倍的元基因組,并對人體健康起到重要作用。認識到微生物在人類健康中的重要性,美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)啟動了人類微生物組織計劃(human microbiome project,HMP)。HMP研究已經(jīng)清楚表明,各解剖部位的微生物群體與多種多樣的人類健康和疾病狀態(tài)相關。然而,最初的HMP研究中沒有納入人類尿路,與其他人類黏膜表面細菌物種的多樣性相反,尿路通常被認為是“無菌”的,這可能是由于常規(guī)尿液細菌培養(yǎng)技術局限所致。隨著下一代測序技術的應用,最近的研究表明,泌尿道存在獨特的尿液微生物群,對泌尿系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展起關鍵作用[1]。在這篇綜述中,我們討論了尿路細菌微生物可能導致癌變的作用,同時通過相關基礎臨床研究回顧尿液微生物與泌尿系統(tǒng)腫瘤相互作用的研究進展,特別專注于微生物與宿主相互作用的效應機制和治療前景。

1 16S rRNA基因測序及尿液微生物

微生物由細菌、古細菌、病毒和真菌組成,主要發(fā)現(xiàn)于胃腸道,也存在于皮膚,上呼吸道和泌尿生殖道等。然而曾經(jīng)被認為是無菌的其他組織,如腦,乳腺,胎盤和尿道,也具有獨特的細菌群落[2-5]。傳統(tǒng)上,尿細菌培養(yǎng)用于分離和鑒定參與泌尿道感染發(fā)展的病原體,例如需氧、快速生長的細菌微生物,如大腸桿菌和糞腸球菌[6]。相反,慢生長的、厭氧的或在合成培養(yǎng)基上不易生長的微生物,如棒狀桿菌、乳桿菌和解脲支原體很少從尿道中分離,因為常規(guī)培養(yǎng)技術不是為了支持這些微生物屬的生長而設計的。然而,使用先進的檢測技術之后,這些細菌微生物在多個研究中已被確定為尿微生物群的成員[7-9]。

16S rRNA基因序列由于其關鍵細胞作用的結果,是高度保守的。然而在基因內,一些延伸可以演化,成為可以測量進化距離的超可變區(qū)域,從而有了系統(tǒng)進化相關性。16S rRNA基因的所有九個已知的高變區(qū)(V1～V9)含有足夠的多態(tài)性,因此對一個V區(qū)進行測序通常足以實現(xiàn)準確的分型分類[10]。16S rRNA基因測序的一個限制是它不能區(qū)分活細菌和死細菌或細菌DNA片段。HILT等[11]通過擴大培養(yǎng)條件超越常規(guī)使用細菌分離尿液的方法來解決這個問題。用這種培養(yǎng)方法,使用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術的65個樣品中有80%的培養(yǎng)物(其中92%為培養(yǎng)陰性，即<103CFU/mL)生長細菌。這些發(fā)現(xiàn)與其高通量測序結果的比較表明,通過16S rRNA基因測序在尿微生物群中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)細菌確實存活。

超深度焦磷酸測序揭示了健康個體尿液中(相對)最豐富的細菌分類群：乳桿菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬、普羅前科菌屬、加德納菌屬和鏈球菌屬,健康的尿液微生物群的特征在于乳酸桿菌在女性和棒狀桿菌在男性中的優(yōu)勢[9,12]。同時女性樣本比男性更多樣化,一項尿液調查數(shù)據(jù)(用作膀胱微生物的代表)顯示,相比于男性的樣品(1至8屬),來自女性(6至36屬)的樣品中存在更多的非均質的細菌屬混合物[13]。雖然中期尿液分析證實了核心微生物細菌的存在,但核心細菌數(shù)量,以及其他細菌的占有率,在不同年齡組中都是多變的,這一觀察結果在泌尿道中比在腸道微生物中更顯著。例如,Jonquetella屬、微單胞菌屬、紫單胞菌科Proteiniphilum屬和Saccharofermentans屬主要存在于70歲以上的老年人[13]。

2 尿路微生物與前列腺癌

前列腺癌(prostatecancer,PCa),是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,是全世界范圍內的一個重要的公共問題。相關數(shù)據(jù)表明,2010年以來,前列腺癌成為美國男性發(fā)病率第一的腫瘤,死亡率僅次于肺癌,2017年美國估計有161 360例新病例[14]。中國前列腺癌的發(fā)病率雖低于西方國家,但近年來其發(fā)病率和死亡率均上升明顯,已經(jīng)成為嚴重影響我國男性生命健康的腫瘤之一,估計前列腺癌的終生風險為16%[15],飲食、生活方式和遺傳因素都是既定的風險因素。

2.1 前列腺癌相關的微生物組改變

2.1.1尿液微生物組 尿路微生物組的發(fā)現(xiàn)對于前列腺病理生理學具有重要意義,因為它們在解剖學上接近。在一項13個前列腺癌患者與21個前列腺增生患者的尿液、前列腺液檢查(examination of prostatic secretion,EPS)、精液中微生物細菌的對照研究中表明,與BPH組相比,前列腺癌組尿液中的擬桿菌綱,α變形菌綱,厚壁菌門細菌,毛螺旋菌科,丙酸桿菌亞目Propionicimonas,鞘脂單胞菌屬和蒼白桿菌屬的數(shù)量顯著增加,并且優(yōu)桿菌屬和紅螺菌科Defluviicoccus的數(shù)量減少。同時前列腺癌組中大腸埃希菌的數(shù)量在尿液中顯著降低,在EPS和精液中增加；腸球菌在精液中數(shù)量顯著增加,而尿液和EPS幾乎沒有變化[16]。在這些菌群中,α變形菌綱的增加可能與前列腺癌患者中所見的前列腺的感染和炎癥有關；厚壁菌門細菌參與能量再吸收和肥胖[17]；Propionicimonas屬于丙酸桿菌亞目,它是前列腺炎患者EPS中主要的厭氧菌；蒼白桿菌屬是一種機會性病原體,其數(shù)量越多代表患者的免疫功能障礙越嚴重。另一項包括66名前列腺癌患者和63名活檢良性的患者尿液分析研究發(fā)現(xiàn)了一組聚集的細菌物種,它們比群集外的細菌更多比例的存在于癌癥樣本中,該簇包含物種鏈球菌屬Anginosus,消化鏈球菌科Anaerococcuslactolyticus和Anaerococcusobesiensis,放線棒菌屬Schaalii,放線菌科Varibaculumcambriense以及丙酸桿菌科Propionimicrobiumlymphophilum。幾乎所有這些物種都被認為是泌尿生殖系統(tǒng)感染的致病因素,包括前列腺炎,細菌性陰道炎和尿路感染[18]。

2.1.2胃腸微生物組 以往研究非常多的胃腸微生物也可能通過代謝影響從而在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮潛在作用。一項前瞻性病例對照試點研究比較了8名良性前列腺疾病患者與12名局限性前列腺癌患者的糞便,結果顯示在PCa病例中觀察到較高的相對豐度的芽孢桿菌,在良性對照中觀察到梭菌科Faecalibacteriumprausnitzii和優(yōu)桿菌屬Eubacteriumrectale具有較高的相對豐度。在遺傳、酶和途徑豐度方面,組間也觀察到顯著差異[19]。F.prausnitzii和E.rectale都是丁酸鹽的生產(chǎn)者,丁酸鹽抗腫瘤發(fā)生特性的研究已經(jīng)通過誘導細胞凋亡和抑制增殖,以及體外模型中增加的細胞分化來證明其效果。相應地,體內研究已經(jīng)證明丁酸鹽能通過降低纖溶酶原活性水平以及促使血管內皮生長因子表達減少來發(fā)揮其抗腫瘤作用[20-21]。

2.1.3前列腺組織中微生物組 在組織中主要由痤瘡丙酸桿菌組成的丙酸桿菌屬也因其促炎癥性、與PCa密切的相關性而成為近期熱點。一項在16例根治性前列腺切除術標本上評估腫瘤、癌旁組織和非腫瘤組織的微生物組學特征的研究顯示在腫瘤/腫瘤周圍和非腫瘤前列腺標本中特定微生物群體存在顯著差異：乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬在非腫瘤組織上表現(xiàn)更多而葡萄球菌科、葡萄球菌屬在腫瘤/腫瘤周圍組織中表現(xiàn)更多；最重要的是同時在3種組織的所有屬中,丙酸菌屬都是最豐富的[22]。在另1項100例前列腺癌患者及50例前列腺活檢良性的患者對比研究中發(fā)現(xiàn),痤瘡丙酸桿菌在男性前列腺癌中較之對照組更常見。在多變量分析中,調整年齡、手術日歷年和吸煙狀況后,痤瘡丙酸桿菌數(shù)量多的男性患前列腺癌的幾率增加4倍。研究人員已經(jīng)從前列腺組織標本中培養(yǎng)出與人類皮膚痤瘡丙酸桿菌相關的促炎微生物,并且已經(jīng)顯示其在人類和動物模型中與前列腺炎有關。基于細胞的實驗里,痤瘡丙酸桿菌分離株與前列腺細胞系PNT1A共培養(yǎng),觀察到感染細胞中細胞增殖和細胞因子/趨化因子分泌增加[23]。最近,KASIMATIS等[24]報道,與尋常痤瘡相關的痤瘡丙酸桿菌菌株含有質粒,而質粒含有幾個毒力相關基因。這些研究都進一步支持痤瘡丙酸桿菌感染作為前列腺癌發(fā)展的促成因素的生物合理性。

2.2 促炎癥微生物及微生物菌群失調的促前列腺癌作用SIMONS等[25]模仿典型的人類前列腺感染,逆行尿道滴注一種從患有慢性前列腺炎的患者的前列腺液中分離的B1克隆組大腸桿菌菌株(anE.colistrain of the B1 clonal group isolated from the expressed prostatic secretion of a patient with chronic prostatitis,CP1),在前列腺癌Hi-Myc小鼠模型中的CP1感染加劇了侵襲性前列腺腺癌的發(fā)展,其中70%以上的小鼠在4.5個月齡時患有癌癥,此項研究證明了前列腺炎癥能促進前列腺癌進展。抗生素的使用也會改變人體內的微生物細菌微環(huán)境,從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,一項研究表明對于尿路腫瘤,使用青霉素、喹諾酮類、磺胺類藥物和四環(huán)素類藥物對前列腺癌的風險略有增加,對于>5個療程的青霉素,OR為1.2(95%CI為1.1～1.3)[26]。此外,研究人員已經(jīng)證明胃腸道微生物群的生態(tài)失調會增加前列腺癌的風險[27]。同時一項美國東南部的研究中40名前列腺癌患者被隨機分配,并予以不同飲食,其結果表明不同的攝入食物與不同腸道微生物菌群正相關,并且在基線時,變形菌門(中位數(shù)0.06,四分距范圍0.01～0.16)豐富,其中四目與Gleason評分(Gleason score,GS)總和正相關。GS總和與梭菌屬(r=0.579;P=0.005)以及Blautia(r=0.425,P=0.049)有關[28]。

2.3 免疫學上的冷腫瘤及微生物在前列腺癌免疫治療中的作用迄今為止,盡管在其他實體瘤(如黑色素瘤)中取得了有希望的進展,但免疫療法在前列腺癌患者中顯示出很小的治療益處。在前列腺癌中,基于免疫接種和基于免疫檢查點阻斷的免疫治療策略都觀察到有限的治療效果[29-31]。對前列腺癌免疫治療缺乏臨床反應的最主要原因可能是低突變負荷和/或低腫瘤新抗原負荷導致前列腺癌的低免疫原性以及存在替代檢查點或免疫逃逸途徑。前列腺癌的治療如去勢、盆腔放療等可能改變腸道微生物菌群[32]從而影響免疫治療。目前來說,與免疫學上的“熱”癌癥如黑素瘤和膀胱癌相比,前列腺癌中由于抗腫瘤浸潤免疫細胞的缺乏(可能由于低突變負擔)被認為是“冷”癌癥。另外在病理上由于前列腺癌傾向于在良性腺體之間滲透,因此定義前列腺癌中的腫瘤邊緣或腫瘤周圍區(qū)域通常是困難的[33]。

近年來的一些研究已經(jīng)證明腸道微生物群對于諸如環(huán)磷酰胺、奧沙利鉑化療以及CTLA4阻斷和抗PDL1免疫療法的治療功效是必不可少的。通過抗生素治療或衍生無特定病原體和/或無菌動物根除共生腸道菌群消除了這些藥物的治療功效[34-36]。因此人為地改變腸道微生物群能提升一些抗腫瘤免疫治療的療效,例如在小鼠黑色素瘤模型中抗PDL1免疫治療的效果可以通過在開始治療前給動物喂養(yǎng)雙歧桿菌特定菌株得到加強[37]；另一項研究中,將富集擬桿菌屬微生物細菌的小鼠糞便移植到無菌小鼠中,與對照組相比,其糞便中脆弱擬桿菌的糞便豐度更多并在CTLA4阻斷后減小了腫瘤大小[34]。雖然目前在前列腺癌中還沒有關于胃腸道微生物群與免疫療法反應之間相互作用的數(shù)據(jù),但是隨著未來的研究的深入,胃腸道微生物對前列腺癌的免疫治療的影響及機制肯定能被挖掘發(fā)現(xiàn)。

3 尿路微生物與膀胱癌

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤,在我國近年來膀胱癌的發(fā)病率和病死率逐漸上升,且中國男性膀胱癌死亡率(3.89/105)是女性(1.34/105)的2.9倍[38]。其中尿路上皮癌(urothelial bladder cancer,UBC)是最多見的病理類型,其已知的最重要的危險因素是吸煙和各種職業(yè)暴露,血吸蟲感染與慢性炎癥與膀胱鱗狀細胞癌的發(fā)生有關。根據(jù)腫瘤的分期標準,可把膀胱癌分為肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)和非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC),初診患者中約70%為NMIBC,約30%為MIBC。男性的膀胱癌發(fā)病率是女性的2～5倍,其差異長期以來被解釋是男性吸煙率更高,但是相較于肺癌,女性吸煙的增加并沒有導致膀胱癌的顯著增加。隨著近年來對微生物與癌變機制的不斷深入認識、發(fā)現(xiàn)尿微生物群的存在,以及男性和女性尿微生物群之間存在顯著差異使我們重新考慮膀胱癌的預防和危險因素。

3.1 膀胱癌相關的微生物改變細菌微生物能夠與許多環(huán)境毒素相互作用,如重金屬、多環(huán)芳烴、農藥、赭曲霉毒素、塑料單體和有機化合物。在通過腎臟過濾從血液中除去某些毒素之后,它們在膀胱內的儲存提供了足夠的時間使尿微生物群與這些化合物相互作用和改變,這種“代謝”可以增加或減少可能由這些毒素引起的疾病的風險,包括認知功能障礙,腎臟病理甚至是尿路系統(tǒng)癌癥[39]。一項研究使用454測序技術對來自健康個體(n=6)和尿路上皮癌患者(n=8)的尿標本進行了微生物研究,大多數(shù)正常樣本中鏈球菌豐度接近零(0～0.017),但在8個癌癥樣本中的5個(0.12～0.31)顯著升高。在鏈球菌豐度低的2個癌癥樣品中(2/3)假單胞菌屬或嗜球菌屬是最豐富的屬[40]。2017年POPOVIC等[41]對比了12名膀胱癌男性患者與11名健康男性的尿液微生物分析,在膀胱癌組中鑒定了一種顯著豐富的屬于梭桿菌屬的操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),而韋榮氏菌屬,鏈球菌屬和棒狀桿菌屬的3種OTU在健康的尿液中更豐富。2017年的另一項抗生素使用對癌癥形成風險的研究表明,在沒有膀胱過度感染的患者中,當青霉素和磺胺類藥物的處方數(shù)分別達到1.3(95%CI:1.1～1.5)和2.0(95%CI:1.1～3.4)時,癌癥風險增加。在曾接受過膀胱感染的患者中,接觸>5個療程的青霉素和大環(huán)內酯類患者的風險仍然較高,其中校正比值比(adjusted odds ratio,AOR)分別為1.4(95%CI:0.7～2.6)和2.1(95%CI:0.5～8.1)[26]。這些結果表明尿路上皮癌可能與尿路改變的微生物群有關。

3.2 血吸蟲相關膀胱癌血吸蟲病屬于由血吸蟲屬寄生蟲引起的被忽視的熱帶病,在貧困地區(qū)普遍存在,且針對血吸蟲病的治療選擇僅限于吡喹酮。在血吸蟲中,比起曼氏血吸蟲和日本血吸蟲,埃及血吸蟲更容易引起膀胱病理改變[42-43]。泌尿生殖系統(tǒng)血吸蟲感染有助于膀胱癌的發(fā)生,但其具體機制還未完全清楚,通常我們認為血吸蟲感染導致卵子在膀胱壁中沉積從而引起的損傷以及尿路上皮慢性炎癥對膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有很大影響[44-45],血吸蟲感染相關的微生物組生態(tài)失調近年來也被認為是一個可能的危險因素。JENKINS等[46]發(fā)現(xiàn)與未感染的小鼠相比,曼氏血吸蟲感染的小鼠腸道微生物群中疣微菌(Verrucomicrobia)門中的Akkermansiamuciniphila和乳酸桿菌明顯增加。最近的一項對泌尿生殖系血吸蟲病患者尿液微生物組的研究則表明,埃及血吸蟲感染組和未感染組之間的微生物群落存在差異[47]。未來還需要更多的數(shù)據(jù)及樣本來確定血吸蟲感染相關的微生物變化與膀胱癌發(fā)生之間的詳細關聯(lián)。

3.3 卡介苗在膀胱癌治療中的應用卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)是正式的一種預防結核病的疫苗,在膀胱中它是一種分枝桿菌,也可以看做是一種放線菌。雖然BCG灌注仍然被認為是膀胱腫瘤經(jīng)尿道切除術后最有效的無創(chuàng)治療方法,但相當一部分患者確實出現(xiàn)復發(fā),因此許多工作集中在改善BCG治療尿路上皮癌療效的策略上。一些研究者單獨使用免疫刺激/細胞因子(CpG寡脫氧核苷酸、BAMLET、IFNa2b等)或與BCG共同施用,來比較二者治療效果差別,但是其結果不一[48-50],之后轉基因及重組BCG作為替代方法被廣泛開發(fā)[51-52]。2016年的一項研究則從免疫記憶的角度發(fā)現(xiàn),動物試驗中在開始原位腫瘤攻擊之前用BCG進行疫苗接種改善了膀胱內BCG治療的反應；更重要的是,對臨床資料的分析顯示預先存在BCG免疫的患者在BCG免疫治療后具有更大的獲得無復發(fā)存活的可能性[53]。有趣的是,STEDMAN等[54]最新的研究發(fā)現(xiàn)歐洲獾糞便中分離的12個乳酸菌對BCG具有顯著的抑制活性,并在人巨噬細胞分析中影響B(tài)CG介導的免疫激活,由此我們可以假設,BCG灌注的療效也可能與腸道以及尿路菌群有緊密的關聯(lián),而這也有待進一步的研究來證明。

3.4 微生物組織可能在預防復發(fā)性淺層膀胱癌中發(fā)揮作用雖然罕見,BCG治療還是會有危及生命的不良反應,例如,0.4%的患者發(fā)展為BCG膿毒癥,因此研究成為替代方案治療是有必要的[55]。在其他暴露的黏膜部位,例如腸道或口腔活動中,共生細菌在維持宿主體內平衡方面是必不可少的,有趣的是在2013年,一個研究小組表明乳酸桿菌L.iners比來自陰道樣品或益生菌的其他乳桿菌擁有對纖連蛋白更強的親和力[56],并且在小鼠中干酪乳桿菌減少了可移植膀胱腫瘤和肺轉移的生長[57]。在體內研究中一項138例原發(fā)性膀胱腫瘤患者的多中心、雙盲、安慰劑對照、隨機試驗報道,每日口服給予冷凍干燥的干酪乳桿菌Shirota1年可以有效降低膀胱癌在經(jīng)尿道電切除腫瘤后復發(fā)[58]。另外一項多中心,前瞻性,隨機對照試驗納入207例患者,表明患者口服1年干酪乳桿菌聯(lián)合經(jīng)尿道表柔比星灌注(3個月)治療和僅僅表柔比星灌注組相比,3年時的膀胱癌復發(fā)率顯著降低,盡管組間總生存率沒有差異[59]。除了降低膀胱癌復發(fā)的幾率,一項180例患者和445例基于健康人群對照組的病例對照研究顯示,常規(guī)(每周1～2次)益生菌攝入降低了健康人群的UBC風險[60]。不僅是干酪乳桿菌對膀胱癌有療效,我們還知道共生細菌可以很容易地結合幾種被認為與膀胱癌有關的化合物,如鎘,其他重金屬和殺蟲劑[61]。合理有選擇性地使用益生菌、促進或消耗本地膀胱微生物組合的策略在未來可能會用于改善UBC治療的療效。

3.5 微生物組作為膀胱癌生物標志物及靶向治療選擇微生物除了與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有密切關聯(lián),特定的微生物組還能作為診斷和預后的生物標志物。在最近的一項31名膀胱癌男性患者與18名健康男性的尿液對比研究中,復發(fā)和進展風險高的患者的微生物群組成與復發(fā)和進展風險低的患者有顯著差異,且復發(fā)風險高以及進展風險高組別中各有6個特異性屬[62]。同時微生物組在調節(jié)對癌癥治療的反應中起著至關重要的作用,包括免疫療法[63]。ZITVOGEL等[64]報道微生物組可能影響PD-L1阻斷的治療效果,因此特定的微生物組還具備著免疫藥劑靶向治療的潛在選擇。

4 其他泌尿系統(tǒng)腫瘤

目前尿路微生物與其他泌尿系統(tǒng)腫瘤例如腎癌、腎盂癌、輸尿管癌、陰莖癌等的相關性研究還沒有開展很多,還有待更多的基礎及臨床研究來確定其關聯(lián)性是否如前列腺癌及膀胱癌一樣密切。

5 總結與展望

即使在一度被認為是無菌的泌尿系統(tǒng),細菌微生物也無處不在。大量研究已經(jīng)證實了泌尿系統(tǒng)腫瘤,特別是前列腺癌及膀胱癌,與尿路細菌微生物之間存在關聯(lián)。然而,就目前而言,泌尿系統(tǒng)腫瘤及尿路細菌微生物之間的具體相關性機制尚未完全清楚,我們仍需要進一步的基礎和臨床研究來確定這些特定細菌微生物的作用及其作為新生物標志物開發(fā)的潛力,為泌尿系統(tǒng)腫瘤的預防及治療提供新的方向及手段。