固氮微生物對(duì)鰻草植株生長(zhǎng)及其根際土壤酶活性的影響?

張雪梅， 張秀梅, 2， 張沛東， 王 琦， 李文濤??

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266072)

隨著海草床生境退化的加劇及人們對(duì)其生態(tài)功能認(rèn)識(shí)的加強(qiáng)，世界沿海國(guó)家相繼開展了海草床退化生境的修復(fù)工作，其中植株移植法是主要修復(fù)方法之一[1]，與此相關(guān)的研究報(bào)道多集中在移植方法[2-3]、移植時(shí)間[4]及環(huán)境因子對(duì)移植效果的影響[5-6]等方面，對(duì)于移植鰻草幼苗人工促繁策略的研究較少。而研究表明，合適的人工促繁手段能有效促進(jìn)移植植株的繁殖、存活及生長(zhǎng)[7]，這對(duì)于減少天然供體使用量、促進(jìn)移植修復(fù)效果等具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

生物固氮在氮素的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。固氮微生物不僅能夠通過生物固氮作用將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為含氮化合物，從而在一定程度上緩解氮缺乏對(duì)植物初級(jí)生產(chǎn)力的限制，其代謝產(chǎn)物在促進(jìn)植物生長(zhǎng)[8-9]、生物病害防治[10]等方面也具有顯著作用，目前已被廣泛應(yīng)用于主要經(jīng)濟(jì)及生態(tài)物種。Anjali等[8]研究證實(shí)，Aneurinibacillusaneurinilyticus具有除固氮功能外的多種植物促生特性且能顯著增加番茄(Solanumlycopersicum)營(yíng)養(yǎng)吸收速率，促進(jìn)番茄生長(zhǎng)。姚拓等[11]利用穩(wěn)定同位素稀釋法研究發(fā)現(xiàn)，固氮菌能顯著增加燕麥(Avenasativa)固氮量，促進(jìn)燕麥生長(zhǎng)。也有研究表明，海草葉片表面及根莖周圍同樣附著大量微生物，是海草床生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[12]。但目前對(duì)海草床固氮微生物的研究多集中在群落組成和結(jié)構(gòu)多樣性[13-14]、固氮量貢獻(xiàn)[15-16]及影響因素[17-18]等方面，而將固氮微生物應(yīng)用于海草床退化生境修復(fù)的研究實(shí)例極少。

鰻草(ZosteramarinaL.)屬鰻草科(Zosteraceae)鰻草屬(Zostera)，主要分布在溫帶海域淺海區(qū)[19]。近年來由于自然環(huán)境變化和人類活動(dòng)影響，全球范圍內(nèi)鰻草資源嚴(yán)重衰退。本研究針對(duì)鰻草移植修復(fù)過程中的人工促繁問題，通過外源固氮菌接種實(shí)驗(yàn)，探究其對(duì)鰻草植株存活、生長(zhǎng)、生理及根際土壤酶活力的影響，為深入研究高效固氮菌株功能與代謝調(diào)控及其在鰻草植株人工促繁中的作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 實(shí)驗(yàn)用固氮菌菌株分離自山東省威海市天鵝湖鰻草根際土壤，其中Bacilusfirmus3A與Thalassospirasp. 4G為王琦等[12]分離保存于中國(guó)海洋大學(xué)資源增殖生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的2株固氮菌株，菌株S3-2Y和菌株S3-4R經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化、nifH及16S rDNA測(cè)序確定分別為Bacillushemicentroti、Bacillusjeotgali，其具體指標(biāo)見表1。

表1 4種固氮菌株的基礎(chǔ)指標(biāo)

注：菌株Bacilusfirmus3A及Thalassospirasp. 4G固氮酶活性、最適生長(zhǎng)溫度及最適生長(zhǎng)鹽度數(shù)據(jù)引用自王琦等[12]。The nitrogen fixation rate, optimum growth temperature and salinity ofBacilusfirmus3A andThalassospirasp. 4G are quoted from Wang Qi et al[12].

1.1.2 培養(yǎng)基 選擇性無(wú)氮培養(yǎng)基參考Smith等[20]的配方并稍作調(diào)整，用于固氮菌株的活化和擴(kuò)繁：七水硫酸亞鐵0.001 g，氯化鉀0.56 g，六水氯化鎂4.00 g，氯化鈉25.00 g，七水硫酸鎂4.80 g，磷酸氫二鉀0.01 g，三羥甲基氨基甲烷0.48 g，蛋白胨4.00 g，酵母粉2.00 g，甘油2.00 mL，超純水1 000 mL，pH=8.2。

1.1.3 鰻草植株 實(shí)驗(yàn)用鰻草植株于4月25日采自山東省榮成市天鵝湖海域(36.43°N，122.26°E)。采集時(shí)，將植株從底部連根挖出，確保鰻草植株完整。植株經(jīng)海水浸洗，去除底質(zhì)、貝類及其他附生生物，移入盛有海水的泡沫箱中，24 h內(nèi)移送回實(shí)驗(yàn)室，于室外水槽中暫養(yǎng)3 d，暫養(yǎng)期間采用自然海水，平均鹽度為30.79，每日14：00時(shí)的平均水溫為19.85 ℃。

1.2 接種劑的制備

參考Ridvan等[21]的方法并稍作改進(jìn)。將低溫保藏法保存的菌株快速置于35～40 ℃的溫水中，使其迅速融化。接種環(huán)蘸取少量菌液，用平板劃線的方法接種到固體無(wú)氮培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)18～24 h。挑取單菌落接種到含有50 mL液體無(wú)氮培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，然后用含有0.025%吐溫20的無(wú)菌水稀釋至109cfu/mL備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 菌株間的拮抗反應(yīng)測(cè)定 將4株菌株兩兩相交劃線接種于選擇性固體無(wú)氮培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，每天觀察交叉點(diǎn)出細(xì)菌生長(zhǎng)情況。若交叉點(diǎn)處細(xì)菌生長(zhǎng)狀況良好，表明2株固氮菌株可以混合培養(yǎng)；反之則表明菌株間有抑制作用，不能混合培養(yǎng)。

1.3.2 固氮菌接種實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)于2017年5—6月進(jìn)行，共設(shè)6個(gè)處理(見表2)，每個(gè)處理設(shè)置8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)良好且具有相似形態(tài)學(xué)特征(株高15～20 cm，葉片數(shù)3～4，根狀莖4 cm)的10株鰻草植株，植于滅菌處理的聚乙烯塑料盒中，接種劑只于實(shí)驗(yàn)初接種一次。鰻草盆栽實(shí)驗(yàn)所需土壤取自于樣品采集地(威海市天鵝湖)，土壤及海水均經(jīng)過滅菌處理。實(shí)驗(yàn)在室外的玻璃水槽中進(jìn)行，相同處理的每4個(gè)重復(fù)置于同一個(gè)玻璃水槽中且各組及重復(fù)每天隨機(jī)變換水槽擺放位置以減少光照誤差。實(shí)驗(yàn)時(shí)，所有鰻草植株采用針孔法標(biāo)記。針孔位置位于葉分生組織上方1 cm處。

表2 各處理組的接種方式

1.4 樣品的采集和測(cè)定

實(shí)驗(yàn)持續(xù)30 d，期間每3 d換一次滅菌處理的海水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察記錄鰻草植株的存活情況，計(jì)算各組存活率；各處理組隨機(jī)選取5株測(cè)定光合色素含量，鰻草葉片光合色素含量的測(cè)定采用萃取法[22]，即取每株植株1 cm2健康新鮮的新生葉片用二甲基甲酰胺(DMF)提取光合色素，然后用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定；另隨機(jī)選取5株測(cè)定可溶性糖含量，即取待測(cè)鰻草植株的新生葉片于105 ℃烘箱中殺青后稱至恒重，加入乙醇、蒽酮試劑提取顯色后，測(cè)定625 nm波長(zhǎng)下的吸光值[23]；余下植株測(cè)定新生葉長(zhǎng)、葉寬、莖節(jié)長(zhǎng)及地上和地下組織干重等生長(zhǎng)指標(biāo)，并計(jì)算單株新葉面積及地上和地下生產(chǎn)力，測(cè)定及計(jì)算方法參考Zhao等[24]。根系中土壤脫氫酶活力的測(cè)定采用氯化三苯基氮唑(TTC)還原法，用Solarbio土壤脫氫酶試劑盒(BC0395)進(jìn)行；即每組隨機(jī)選取8份新鮮土壤，37 ℃，暗培養(yǎng)12 h；隨后冰浴5 min終止反應(yīng)，加入丙酮提取后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液于485 nm處比色，以吸光值計(jì)算脫氫酶活力。根系土壤中脲酶和堿性磷酸酶活力的測(cè)定分別采用靛酚藍(lán)比色法和磷酸苯二鈉比色法，用Solarbio土壤脲酶試劑盒(BC0125)和土壤堿性磷酸酶試劑盒(BC0285)進(jìn)行；即每組隨機(jī)取8份自然風(fēng)干土樣經(jīng)催化反應(yīng)后，10 000 r/min常溫離心10 min，取上清液分別于630和660 nm處比色，以吸光值計(jì)算脲酶、堿性磷酸酶活力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),若差異顯著則進(jìn)行Tukey多重比較分析組間差異。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性或方差齊性，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行單因素方差分析；若轉(zhuǎn)換后仍不滿足，則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。分析結(jié)果使用origin 8.5軟件繪圖。使用Canoco 4.5軟件對(duì)植株各指標(biāo)數(shù)據(jù)集進(jìn)行去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis, DCA)，4個(gè)排序軸的梯度長(zhǎng)度均小于3時(shí)選用基于線性模型的主成分分析(Principal components analysis, PCA)以識(shí)別不同菌株類型中植株生長(zhǎng)及生理指標(biāo)數(shù)據(jù)間的相似性和差異性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌株間的拮抗測(cè)定

拮抗測(cè)定是鑒別菌株間能否共生的傳統(tǒng)方法，4株菌株間的拮抗反應(yīng)結(jié)果表明，4株固氮菌兩兩之間均不產(chǎn)生拮抗作用，可以混合培養(yǎng)。

2.2 固氮微生物對(duì)鰻草存活率的影響

鰻草植株存活率變化如圖1所示。與對(duì)照組相比，接種不同種類固氮微生物均能提高植株的存活率，增長(zhǎng)范圍在30.00%～57.50%之間。除菌株S3-4R組外，其余處理組的存活率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但各處理組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

(誤差線上不同字母表示不同組間存在顯著差異(P<0.05) ，橫坐標(biāo)中Control表示不接種菌株的對(duì)照組。Different letters on the error bars indicate significant differences between the different groups (P<0.05)， The control group had no strain inoculated.)

圖1 不同固氮菌株對(duì)鰻草植株存活率的影響

Fig.1 Effect of different nitrogen-fixing bacteria on the survival ofZosteramarinaL. plants

2.3 固氮微生物對(duì)鰻草生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

鰻草單株新葉面積的變化如圖2A所示。與對(duì)照組相比，接菌處理組能夠有效促進(jìn)鰻草葉片生長(zhǎng)，增長(zhǎng)范圍在11.87%～66.56%之間。最高值出現(xiàn)在菌株4G處理組，單株新葉面積高達(dá)(63.26±3.21) cm2·shoot-1，是對(duì)照組((37.98±3.76) cm2·shoot-1)的1.67倍。另外菌株3A、4G和Mix處理組的單株新葉面積顯著高于對(duì)照組和菌株S3-2Y處理組(P<0.05)，且菌株4G處理組的單株新葉面積顯著高于菌株S3-4R處理組(P<0.05)，而與菌株3A和Mix處理組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

鰻草新莖節(jié)長(zhǎng)的結(jié)果如圖2B所示。與對(duì)照組相比，接菌處理組能夠促進(jìn)鰻草莖節(jié)的生長(zhǎng)，但不同種類菌株作用效果不同。菌株3A、4G和Mix處理組的增長(zhǎng)效果最明顯，新莖節(jié)長(zhǎng)分別為11.95±0.96、13.79±0.58和(11.22±0.68) mm，顯著高于對(duì)照組的(8.26±0.76) mm (P<0.05)。鰻草新根長(zhǎng)的結(jié)果如圖2C所示。接種固氮微生物能夠在一定程度上促進(jìn)鰻草根的生長(zhǎng)，增長(zhǎng)范圍在8.84%～15.81%之間，但與對(duì)照組間并無(wú)顯著差異(P>0.05)。

鰻草植株生產(chǎn)力的結(jié)果如圖2D所示。菌株3A和4G處理組植株地上生產(chǎn)力高達(dá)4.72±0.29和(4.77±0.24) mg·shoot-1·d-1，與對(duì)照組相比分別增加了29.37%和30.30%，顯著高于對(duì)照組和其余各組(P<0.05)。地下生產(chǎn)力結(jié)果顯示，各處理組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中菌株4G處理組在各處理組中的地下生產(chǎn)力最高，達(dá)(0.74±0.04) mg·shoot-1·d-1，菌株S3-2Y處理組最低，為(0.55±0.04) mg·shoot-1·d-1，而對(duì)照組僅為(0.38±0.06) mg·shoot-1·d-1。

(A: 單株新葉面積New leaf area per shoot; B: 新莖節(jié)長(zhǎng)New internode length; C: 新根長(zhǎng)New root length; D: 生產(chǎn)力Productivity。 誤差線上不同字母表示不同組間存在顯著差異(P<0.05)，橫坐標(biāo)中Control表示不接種菌株的對(duì)照組。 Different letters on the error bars indicate significant differences between the different groups (P<0.05)， The control group had no strain inoculated.)

圖2 不同固氮菌株對(duì)鰻草植株生長(zhǎng)指標(biāo)的影響。

Fig.2 Effect of different nitrogen-fixing bacteria on growth status ofZosteramarinaL. plants

2.4 固氮微生物對(duì)鰻草生理指標(biāo)的影響

鰻草葉片光合色素及可溶性糖含量的結(jié)果如圖3所示。固氮微生物對(duì)植株葉片葉綠素a和b含量的影響不顯著(P>0.05，見圖3A和3B)，但均顯著增加鰻草植株葉片中總?cè)~綠素含量(P<0.05，見圖3C)，其中最大值出現(xiàn)在菌株3A處理組，為(67.94±4.99) μg·cm-2。固氮微生物對(duì)植株葉片中類胡蘿卜素含量的影響最顯著，各處理組葉片中類胡蘿卜素含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05，見圖3D)，其中最高值仍出現(xiàn)在菌株3A處理組((9.90±0.54)μg·cm-2)，是對(duì)照組((5.34±0.98) μg·cm-2)的1.85倍。所有處理組的可溶性糖含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。其中，菌株3A和4G處理組植株葉片中可溶性糖的含量也顯著高于其余處理組，最高值出現(xiàn)在菌株3A處理組((103.72±4.22) mg·g-1)，為對(duì)照組((54.06±2.61) mg·g-1)的1.92倍。

2.5 固氮微生物對(duì)土壤脫氫酶、土壤脲酶和土壤堿性磷酸酶活力的影響

4種固氮菌及其組合接種后鰻草根際土壤中脫氫酶活力如圖4A所示。各處理組的脫氫酶活力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中最高值出現(xiàn)在菌株3A處理組((5.58±0.24) U·g-1·h-1)，為對(duì)照組((1.74±0.09) U·g-1·h-1)的3.21倍。同時(shí)菌株3A和4G處理組的脫氫酶活力也顯著高于其余3個(gè)處理組(P<0.05)。各處理組脲酶活力也有顯著提高(P<0.05，見圖4B)，其中最高值仍出現(xiàn)在菌株3A處理組((155.06±1.21) U·g-1)，為對(duì)照組的1.62倍，也顯著高于菌株上S3-2Y處理組，但菌株S3-2Y處理組與其余3個(gè)處理組間無(wú)顯著差異。4種固氮菌及其組合接種后，堿性磷酸酶活力與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05，見圖4C)。

(A: 葉綠素a含量Chlorophyllacontent; B: 葉綠素b含量Chlorophyllbcontent; C: 總?cè)~綠素含量Total chlorophyll content; D: 類胡蘿卜素含量Carotenoid content; E: 可溶性糖含量 Soluble sugar content。 誤差線上不同字母表示不同組間存在顯著差異(P<0.05)，橫坐標(biāo)中Control表示不接種菌株的對(duì)照組。 Different letters on the error bars indicate significant differences between the different groups (P<0.05)， The control group had no strain inoculated.)

圖3 不同固氮菌株對(duì)鰻草葉片光合色素和可溶性糖含量的影響

Fig.3 Effect of different nitrogen-fixing bacteria on photosynthetic pigments and soluble sugar content ofZosteramarinaL. leaves

2.6 菌株類型與鰻草植株生長(zhǎng)生理指標(biāo)的關(guān)系

運(yùn)用去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(DCA)，將菌株類型與鰻草10個(gè)生長(zhǎng)生理指標(biāo)相結(jié)合進(jìn)行分析(見表3)，第一、第二排序軸對(duì)植株各指標(biāo)的累計(jì)解釋量為63.30%，4個(gè)排序軸中梯度長(zhǎng)度最大值為0.07。因此采用主成分分析(PCA)方法進(jìn)行下一步分析，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化和標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，第一、二、三、四排序軸的解釋量分別為63.79%、19.82%、10.14%和3.40%，其中第一、第二排序軸的累計(jì)解釋量為83.61%(見表4)。在PCA分析圖中，選取的10個(gè)生長(zhǎng)生理指標(biāo)用箭頭表示，以菌株間的距離表示菌株作用效果的差異性，以指標(biāo)間夾角的余弦值表示指標(biāo)間的相關(guān)性強(qiáng)弱，以菌株類型在射線投影點(diǎn)到實(shí)心箭頭處的相對(duì)距離為準(zhǔn)，進(jìn)行排序。分析結(jié)果說明，5個(gè)處理組的植株促生效果大體呈現(xiàn)4G>3A>Mix>S3-2Y>S3-4R。菌株3A對(duì)鰻草光合色素的影響最為顯著，而菌株4G對(duì)鰻草生長(zhǎng)指標(biāo)的影響最為顯著。從各指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系中可以看出，地上組織與地下組織各指標(biāo)間的相關(guān)性較強(qiáng)，而光合色素與地下組織間的相關(guān)性較弱。此外，存活率與地上、地下組織及光合色素間均呈現(xiàn)較強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系。

(A: 土壤脫氫酶Soil dehydrogenase; B: 土壤脲酶Soil urease; C: 堿性磷酸酶活力Soil alkaline phosphatase; 誤差線上不同字母表示不同組間存在顯著差異(P<0.05)，橫坐標(biāo)中Control表示不接種菌株的對(duì)照組。 Different letters on the error bars indicate significant differences between the different groups (P<0.05)， The control group had no strain inoculated.)

圖4 不同固氮菌株對(duì)鰻草根際土壤酶活力的影響

表4 鰻草植株生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的PCA結(jié)果

3 討論

3.1 固氮微生物對(duì)鰻草的促生長(zhǎng)作用

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的重要元素，與氨基酸等細(xì)胞物質(zhì)合成及其他重要生理過程密切相關(guān)[25]。研究表明，在植物種苗階段接種固氮菌能顯著增加植株存活率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，促生效果與固氮菌的固氮酶活性、生理代謝過程、環(huán)境條件等因素有關(guān)[8,26-27]。本實(shí)驗(yàn)研究了4種固氮菌及其組合對(duì)鰻草的促生長(zhǎng)作用，結(jié)果顯示，所有菌株及組合均能在一定程度上提高鰻草植株的存活率、單株新葉面積、莖節(jié)長(zhǎng)及地上和地下生產(chǎn)力，但不同種類菌株的作用效果不同。菌株3A、4G、S2-2Y和Mix處理組能夠顯著提高鰻草植株存活率。在單株新葉面積、新莖節(jié)長(zhǎng)、地上生產(chǎn)力等生長(zhǎng)指標(biāo)方面，菌株3A、4G和Mix表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。而接種后增長(zhǎng)效果最明顯的是植株地下生產(chǎn)力，所有處理組均顯著高于對(duì)照組。綜合所有生長(zhǎng)指標(biāo)，菌株4G的作用效果最為顯著，存活率、單株新葉面積、新莖節(jié)長(zhǎng)、地上及地下生物量與對(duì)照組相比分別增加57.5%、66.6%、66.9%、42.2%和97.7%。通常固氮酶活性強(qiáng)弱是表征固氮微生物作用效果的主要依據(jù)。但本研究結(jié)果表明，菌株固氮酶活性的強(qiáng)弱與其作用效果并不總呈正相關(guān)。菌株3A、4G、S3-2Y和S3-4R的固氮酶活性分別為252.21、196.31、156.47和132.21 nmol C2H4·mL-1·h-1。但菌株3A的促生效果卻略低于菌株4G，這與Banik等[28]在野生水稻中的研究結(jié)果相一致。說明固氮作用受多種因素的影響，不能單一以固氮酶活性強(qiáng)弱衡量。由于實(shí)驗(yàn)在室外開展，分析認(rèn)為除固氮酶活性外，環(huán)境因素是影響固氮菌作用效果的重要原因。另外，混合接種處理組并未表現(xiàn)出協(xié)同作用效果。王錢崧等[29]研究了3種固氮菌株及其組合對(duì)甘蔗的促生長(zhǎng)作用，發(fā)現(xiàn)接種效果會(huì)因組合方式不同而有所差異；而Ravikumar等[30]研究表明，同種組合對(duì)不同物種的促生效果也不盡相同。由于微生物間的競(jìng)爭(zhēng)等原因，混合接種仍需通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以確定菌株的最優(yōu)組合及配比。

圖5 菌株類型與鰻草生長(zhǎng)生理指標(biāo)的PCA排序圖

3.2 鰻草植株對(duì)接種固氮菌的生理響應(yīng)

光合色素是植物光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中葉綠素a和葉綠素b廣泛存在于高等植物中，具有捕獲光能、驅(qū)動(dòng)電子轉(zhuǎn)移的功能[31]；類胡蘿卜素作為光合作用中的輔助色素，能夠吸收、傳遞電子、清除光合作用產(chǎn)生的自由基[32]。已有研究證實(shí)可溶性氮含量能夠影響植物的光合特性[33]。本研究結(jié)果顯示，所有處理組均能顯著增加葉片中總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量，其中菌株3A處理組的總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量提升至對(duì)照組的1.58和1.84倍。董俊德等[34]亦發(fā)現(xiàn)深海海旋菌(ThalassospiraprofundimarisQ25-2)能夠提高泰來藻(Thalassiahemperichii)葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量。但菌株4G處理組的光合色素含量略低于其余處理組，結(jié)合其生長(zhǎng)指標(biāo)數(shù)據(jù)分析認(rèn)為，菌株4G的促生速率可能較其余處理組更快，該結(jié)果是本實(shí)驗(yàn)采樣節(jié)點(diǎn)超過其最佳生長(zhǎng)期所致。因此，在鰻草植株人工促繁過程中除明確不同菌種的促生效果、確定最適應(yīng)用菌株外，還需確定菌株最佳作用時(shí)間。另外，接種固氮微生物能顯著增加鰻草葉片中可溶性糖的含量。在高等植物中，可溶性糖不僅是能源物質(zhì)，其在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[35]、參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)和傳導(dǎo)[36]等過程中也發(fā)揮重要作用。李紅梅等[37]研究發(fā)現(xiàn)，春季施加氮肥能夠增加小麥(TriticumaestivumL.)葉片中可溶性糖含量，從而改善其碳代謝能力，提高產(chǎn)量。袁淑珍等[38]通過低溫脅迫實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可溶性糖能夠提高螺旋藻(Spirulina)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，拓寬其溫度適應(yīng)范圍。分析認(rèn)為，接種固氮微生物可能通過調(diào)節(jié)鰻草葉片中可溶性糖含量促進(jìn)鰻草植株生長(zhǎng)，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

3.3 固氮微生物對(duì)鰻草根際土壤酶活力的影響

土壤酶主要由植物根系分泌物、動(dòng)植物殘?bào)w分解釋放的酶和土壤微生物酶類構(gòu)成，是分析根際微生物對(duì)土壤生態(tài)過程影響機(jī)制的重要指標(biāo)[39-40]。本研究結(jié)果表明，接種固氮微生物能夠增加土壤脫氫酶、脲酶、堿性磷酸酶活力，但不同菌株的作用效果不同。脫氫酶可以反映土壤體系內(nèi)活性微生物量，是微生物氧化活性能力的精確指標(biāo)[41]。本研究中發(fā)現(xiàn)，菌株3A和4G處理組的脫氫酶活力高達(dá)5.58和5.44 U·g-1·h-1顯著高于對(duì)照組和其余各組(P<0.05)。這與Chen等[42]的研究結(jié)果一致，表明實(shí)驗(yàn)接種的固氮菌已成功定植于鰻草根際周圍，并進(jìn)行了一系列生物化學(xué)反應(yīng)，與生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的提高與改善相對(duì)應(yīng)。脲酶、堿性磷酸酶等水解酶類活力的高低直接影響土壤中氮、磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是表征土壤氮、磷等養(yǎng)分循環(huán)的指標(biāo)之一[43-44]。但Sinsabaugh等[45]研究表明，不同類型生境對(duì)外源氮元素輸入的響應(yīng)不同；而張藝等[46]通過模擬氮沉降實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同施氮類型及水平對(duì)土壤酶活性的影響也有差異。本文結(jié)果證實(shí)，4株固氮菌及其組合能有效提高鰻草與根際土壤間的氮素循環(huán)，促進(jìn)鰻草植株生長(zhǎng)，但對(duì)磷素分解轉(zhuǎn)化效果不顯著。陳勝男等[47]通過盆栽實(shí)驗(yàn)同樣得出，接種自生固氮菌并不能顯著提高玉米根際土壤堿性磷酸酶活性。由此可見，土壤酶活力對(duì)外源物質(zhì)輸入的響應(yīng)不同，需根據(jù)不同類型及水平具體分析。

生物固氮作用受環(huán)境中微生物的競(jìng)爭(zhēng)、結(jié)合態(tài)氮氧、植物基因型和環(huán)境條件變化等諸多影響會(huì)產(chǎn)生不同接種效果[47]。通過在鰻草根際固氮菌接種實(shí)驗(yàn)也表明，4株固氮菌及其組合菌劑對(duì)鰻草存活、生長(zhǎng)、生理及土壤酶活性的作用效果不同，與固氮酶活性并不直接相關(guān)。本研究采用原生沉積物滅菌環(huán)境開展實(shí)驗(yàn)，以為減少環(huán)境中其他微生物影響同時(shí)保證土壤中其他元素含量與海區(qū)環(huán)境相同。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，環(huán)境復(fù)雜多變，為確保固氮菌在自然環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)能力，篩選最佳接種方式，確保接種穩(wěn)定性等仍是今后需深入研究的課題。

4 結(jié)語(yǔ)

通過室外盆栽實(shí)驗(yàn)，探究了4株固氮菌及其組合菌劑對(duì)鰻草植株生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，5個(gè)接菌處理組鰻草植株的存活、生長(zhǎng)、生理及根際土壤酶活力等指標(biāo)均有不同程度提高或改善。植株促生效果表現(xiàn)為4G>3A>Mix>S3-2Y>S3-4R，其中菌株3A、4G在海草床生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，具備進(jìn)一步研制固氮微生物肥料的潛力。