抗HIV中藥復(fù)方的優(yōu)選及其小分子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建和類藥性分析

肖澤云，李愛秀,2，李 凱,3，康家雄

艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)，是世界十大醫(yī)學難題之一，嚴重威脅人類生命健康和社會穩(wěn)定，當前防治情況仍不容樂觀。其主要病原體是HIV-1，也是一直以來AIDS治療的研究重點。AIDS病理過程復(fù)雜，涉及多個細胞信號分子，且HIV-1突變率高，導(dǎo)致僅作用于單一細胞信號分子的單靶點藥物治療效果差，極易產(chǎn)生耐藥性，而多靶點藥物通過多途徑調(diào)節(jié)，同時作用于多種細胞信號分子，使總效應(yīng)大于各單效應(yīng)之和，達到最佳的治療效果，成為當前抗HIV藥物研究的主要關(guān)注點[1]。多靶點抗HIV藥物可分為兩大部分：西醫(yī)的“高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法”(highly active anti-retroviral therapy, HAART)和中醫(yī)的抗HIV中藥復(fù)方。

AIDS患者需長期服藥，與西藥相比，抗HIV中藥復(fù)方不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小、價格便宜、患者依從性較高等優(yōu)勢日益凸顯，在抗HIV方面具有巨大潛力[2]。但中藥復(fù)方抗HIV活性物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，推廣使用受到限制。目前，已有學者開展“中藥分子復(fù)方”[3]的研究，運用計算機輔助藥物設(shè)計(computer aided drug design, CADD)的方法和技術(shù)，針對中藥復(fù)方某一藥理活性，篩選原方中的有效化學成分，優(yōu)化組方劑量，組成成分皆為明確化學分子的新復(fù)方，其中構(gòu)建包含小分子化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等相關(guān)信息的中藥復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫是研究的前提和基礎(chǔ)。但限于目前的技術(shù)水平，為確保實施的可能性，復(fù)方的藥味一般以3～5味為宜[4]。本研究將此思路應(yīng)用到抗HIV中藥復(fù)方的研究中，通過查閱文獻和國內(nèi)專利，總結(jié)出藥味組成明確的抗HIV中藥復(fù)方，從中優(yōu)選1個復(fù)方作為研究對象，構(gòu)建復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫，并利用Lipinski規(guī)則進行類藥性分析。

1 材料與方法

1.1 中藥化學成分來源 TCMSP[5]包括2010年版《中國藥典》收載的499種中草藥及12 144個化合物，通過輸入單味中藥的名稱，就可以檢索到該味藥已收錄的所有化學成分，以及每個化合物的分子量、吸收、分布、代謝、排泄和毒性等參數(shù)。

1.2 軟件 MOE(molecular operating environment)[6]，加拿大化學計算集團公司(chemical computing group, CCG)開發(fā)的分子模擬與分子設(shè)計軟件包，在化學和生物制藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，是世界領(lǐng)先的CADD綜合平臺。本研究所用版本為MOE2009.10，主要模塊有數(shù)據(jù)庫構(gòu)建模塊(creating and editing molecular databases)和Protonate 3D模塊。

1.3 抗HIV中藥復(fù)方的優(yōu)選 檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(1915—2017年)、中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫(1984—2017年)、中國優(yōu)秀碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫(1984—2017年)、中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫(1953—2017年)、國際會議論文全文數(shù)據(jù)庫(1981—2017年)、中國專利全文數(shù)據(jù)庫(1985—2017年)和德國Springer Link數(shù)據(jù)庫(1840—2017年)，下載所有抗HIV中藥復(fù)方相關(guān)文獻。對抗HIV中藥復(fù)方進行總結(jié)，并整理復(fù)方的藥味組成，通過分析比較復(fù)方單味藥數(shù)量以及研究可行性，從中優(yōu)選出1個復(fù)方作為研究對象。

1.4 復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建 分別以所選復(fù)方中的單味中藥作為檢索詞，在TCMSP中進行檢索，得到化學成分及其理化參數(shù)。刪除重復(fù)的小分子化合物，利用MOE數(shù)據(jù)庫構(gòu)建模塊，構(gòu)建復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫。在Protonate 3D模塊，對所有小分子進行加氫加電荷處理，參數(shù)設(shè)置如下：溫度310.15 K，pH 7.0，離子溶度 0.1 mol/L，其余參數(shù)選擇默認。

1.5 基于“Lipinski規(guī)則”類藥性分析 Lipinski規(guī)則類藥性分析是指基于Lipinski規(guī)則對化合物數(shù)據(jù)庫進行篩選，濾去不符合規(guī)則的化合物。經(jīng)典的Lipinski規(guī)則被稱為“Lipinski五規(guī)則”[7]，包括相對分子量小于500、脂水分配系數(shù)(ClogP)小于5、氫鍵給體數(shù)目(以NH和OH鍵數(shù)目之和計)小于5、氫鍵受體數(shù)目(以N和O數(shù)目之和計)小于10、化合物中可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過10個。符合規(guī)則的化合物一般具有良好的藥動學性質(zhì)和較高的生物利用度，更有可能成為藥物分子，但經(jīng)過長期實踐發(fā)現(xiàn)此規(guī)則具有很大的局限性，“五規(guī)則”逐步被簡化為四規(guī)則和三規(guī)則。為了盡量減少漏篩，本研究基于去掉氫鍵受體和可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)量限制的“Lipinski規(guī)則”對所建復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫進行初篩，從結(jié)構(gòu)和性質(zhì)角度濾去不適合成為藥物分子的化合物，為后續(xù)研究突出重點，提高篩選效率。

2 結(jié) 果

2.1 抗HIV中藥復(fù)方的優(yōu)選 共搜集到48個抗HIV中藥復(fù)方，除本實驗室前期鄧聯(lián)柏等[8]總結(jié)的44個復(fù)方外，還包括楊氏方膠囊[9]、生命泉(FESOL)[10]、高欣908口服液[11]和銀翹散[12]。進一步對復(fù)方組成進行總結(jié)，得到藥味組成完全明確的抗HIV中藥復(fù)方11個(表1)。其中，雙黃連粉針劑僅由3味中藥組成，藥味數(shù)量最少，研究復(fù)方抗HIV活性成分及其分子作用機制的可行性最高，且此藥已獲國家批準上市，價格十分便宜，AIDS臨床試驗中療效比較顯著，無明顯毒副作用，因此選擇雙黃連粉針劑作為本研究的對象[13]。

表1 藥味組成明確的抗HIV中藥復(fù)方

2.2 雙黃連粉針劑復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫 檢索TCMSP，分別得到黃芩、連翹、金銀花化學成分143個、150個和236個，3味中藥共同包含的化學成分有4個，黃芩、連翹中相同的化學成分有7個，黃芩、金銀花中相同的化學成分有16個，連翹、金銀花中相同的化學成分有17個(表2～5)。相同的化合物只保留1個，構(gòu)建雙黃連粉針劑復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫，共包含481個化合物。對所有化合物進行加氫加電荷處理，并將此數(shù)據(jù)庫命名為SHLMD。

表2 黃芩、連翹和金銀花中相同的化學成分

表3 黃芩和連翹中相同的化學成分

表4 黃芩和金銀花中相同的化學成分

表5 連翹和金銀花中相同的化學成分

2.3 “Lipinski規(guī)則”初篩結(jié)果 基于“Lipinski規(guī)則”對SHLMD進行初篩，得到323個化合物，組成的新數(shù)據(jù)庫命名為Lipinski-SHLMD。這323個化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)可以分為11大類，包括萜類(121個)、黃酮類(61個)、苯丙素類(31個)、有機酸及其酯類(23個)、生物堿類(16個)、C6-C2天然醇及其苷類(13個)、其他天然醇類(9個)、苯乙醇苷類(7個)、醛類(11個)、酮類(9個)和其他類(22個)，其中萜類可細分為環(huán)烯醚萜類(45個)、倍半萜類(38個)、單萜類(37個)和三萜類(1個)，苯丙素類可細分為木脂素類(19個)和苯丙酸類(12個)，所有小分子中以萜類和黃酮類化合物居多。此外，Lipinski-SHLMD中包含文獻報道具有抗HIV活性的牛蒡子苷元、黃芩苷、槲皮素類化合物和橄欖脂素[23]。

3 討 論

抗HIV中藥復(fù)方在治療AIDS方面的優(yōu)勢日益凸顯，但與西藥成分皆為結(jié)構(gòu)明確的化學分子不同，中藥復(fù)方成分復(fù)雜，抗HIV活性成分及其作用靶點和作用機制尚不明確，難以形成統(tǒng)一規(guī)范的質(zhì)量控制體系、臨床治療體系和療效評價體系，導(dǎo)致缺乏國際公認度，推廣使用受到限制[24]。因此，中藥復(fù)方抗HIV活性成分的篩選及其分子作用機制的揭示是當前研究的難點。然而，復(fù)方中每一味中藥都是1個天然的化合物分子數(shù)據(jù)庫，數(shù)味中藥化學成分總和數(shù)量較大，傳統(tǒng)的高通量篩選法需要花費大量的時間、人力和物力，造成不必要的浪費[25]。利用CADD的方法和技術(shù)研究“中藥分子復(fù)方”，有助于制劑開發(fā)，利于臨床用藥的質(zhì)量監(jiān)控和精準治療，大大節(jié)省了時間和資源。但限于目前的技術(shù)水平，還需對抗HIV中藥復(fù)方進行優(yōu)選，以確保研究的可行性。

本研究通過查閱文獻，共得到48個抗HIV中藥復(fù)方，并明確了其中11個復(fù)方的中藥組成，從中優(yōu)選雙黃連粉針劑作為研究對象。雙黃連粉針劑具有清熱解毒、消腫止痛、廣譜抗菌、抗病毒等功效，目前已在我國批準上市，藥品供應(yīng)充足，價格十分便宜，一般大眾都可用得起，主要用于上呼吸道感染、支氣管炎、肺炎等疾病，也常見于腮腺炎、帶狀皰疹的治療。此外，在治療AIDS方面已有小范圍試用，并且療效比較顯著[13]。證明了雙黃連粉針劑的抗HIV活性物質(zhì)基礎(chǔ)，進一步優(yōu)化復(fù)方，不僅能夠彌補粉針劑病人自主使用不便、偶見過敏癥狀等不足之處，還將促進雙黃連粉針劑在治療AIDS方面的廣泛應(yīng)用，為AIDS患者的治療帶來新希望。因此，基于雙黃連粉針劑開展抗HIV“中藥分子復(fù)方”的研究具有重要的意義和良好的應(yīng)用前景。

目前，尚沒有關(guān)于雙黃連粉針劑復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫的相關(guān)報道，本研究構(gòu)建的SHLMD，包含481個化合物，為雙黃連粉針劑藥理活性的分子研究奠定了數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)。但由于TCMSP每一種中藥的化學成分可能收錄不全，隨著研究技術(shù)和儀器設(shè)備的發(fā)展，不斷有新的化合物被發(fā)現(xiàn)，并且本論文暫未考慮雙黃連粉針劑制劑過程中，可能損耗的化學成分或新生成的產(chǎn)物，以及體內(nèi)的代謝產(chǎn)物等，因此構(gòu)建的SHLMD仍有擴充和完善的空間。Lipinski規(guī)則類藥性分析已廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)領(lǐng)域化合物數(shù)據(jù)庫的初篩，同時也是小分子藥物設(shè)計的有效指導(dǎo)原則。但通過長期實踐，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的“Lipinski五規(guī)則”有很大的局限性，不是絕對的標準，逐步簡化為去掉可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)量限制的“四規(guī)則”和在此基礎(chǔ)上進一步去掉氫鍵受體數(shù)量限制的“三規(guī)則”。為盡量避免漏篩，本研究基于簡化為3條標準的“Lipinski規(guī)則”對SHLMD進行類藥性分析，篩選得到323個化合物。簡化后的規(guī)則也不能保證絕對不漏篩，濾去的化合物中仍可能存在少量抗HIV活性成分。但鑒于SHLMD中化合物數(shù)量較多，并且研究的最終目的是為制成精簡優(yōu)化的分子復(fù)方奠定理論基礎(chǔ)，應(yīng)優(yōu)先考慮結(jié)構(gòu)和性質(zhì)更適合成為藥物分子的化合物，因此利用“Lipinski規(guī)則”對SHLMDB進行初篩是合理的，能夠突出后續(xù)研究的重點，提高篩選效率。篩選結(jié)果中包含一些已知具有抗HIV活性的化合物，表明雙黃連粉針劑具有抗HIV的分子基礎(chǔ)，同時這些化合物的作用靶點和作用機制還需進一步探究。

綜上所述，本研究從抗HIV中藥復(fù)方中優(yōu)選出雙黃連粉針劑作為研究對象，構(gòu)建了雙黃連粉針劑復(fù)方小分子數(shù)據(jù)庫，為分子水平的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，并基于“Lipinski規(guī)則”對數(shù)據(jù)庫進行初篩，減少了后期實驗的工作量，突出了研究重點。Lipinski-SHLMD中已知具有抗HIV活性的化合物可作為后續(xù)研究的重點和篩選依據(jù)。