移動(dòng)式填充床固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計(jì)及單寧酶中試發(fā)酵

,2,*,2

(1.集美大學(xué)食品與工程學(xué)院,福建廈門 361021; 2.福建省食品微生物與酶工程實(shí)驗(yàn)室,福建廈門 361021)

固態(tài)發(fā)酵(Solid-state fermentation,SSF)是一種原始的傳統(tǒng)發(fā)酵方式,在我國已有數(shù)千年的歷史,在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要有食用菌、酶制劑、紅曲的生產(chǎn)以及醬油的釀造等[1]。固體發(fā)酵由于條件不易控制,難以實(shí)現(xiàn)純種發(fā)酵,因此在很長一段時(shí)間內(nèi)被忽視。然而,固體發(fā)酵更加有利于微生物生長,發(fā)酵產(chǎn)物活性高、培養(yǎng)基成分來源廣且價(jià)格低廉、耗能低、無污染[2]。近年來,新型固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的研制[3]以及數(shù)學(xué)模型的建立[4],推進(jìn)了固態(tài)發(fā)酵的發(fā)展。

填充床式反應(yīng)器是固態(tài)發(fā)酵設(shè)備之一,以靜態(tài)發(fā)酵為基礎(chǔ),將培養(yǎng)基置于打孔的支撐板上,通過強(qiáng)制通風(fēng)為微生物供氧,同時(shí)調(diào)節(jié)基質(zhì)的溫度和濕度[5]。然而,由于空氣通過料層時(shí)帶走熱量,在空氣進(jìn)口和出口之間形成溫度差,使空氣的持水性增加,引起基質(zhì)中水分的散失[6],影響微生物的生長和代謝,故固態(tài)發(fā)酵設(shè)備的設(shè)計(jì)和應(yīng)用,需要評(píng)估固態(tài)發(fā)酵過程中溫度、濕度與微生物生長之間的關(guān)系。

單寧酶在食品、飲料、化工制藥、化妝品、飼料及污水處理等行業(yè)中均有廣泛的應(yīng)用,具有潛在的商業(yè)價(jià)值[7-9]。目前,對(duì)單寧酶還主要局限于基礎(chǔ)研究,已有的發(fā)酵工藝成本居高不下,酶活性不高,阻礙了單寧酶產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，因此,研究單寧酶大規(guī)模的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的意義。本研究結(jié)合傳統(tǒng)厚層通風(fēng)制曲設(shè)備的結(jié)構(gòu),對(duì)移動(dòng)式填充床固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的整體布局和結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì),選購相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的附件,組裝成風(fēng)速可控、料層厚度可調(diào)節(jié)的中試型填充床固態(tài)發(fā)酵設(shè)備并對(duì)單寧酶固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行了中試，以期為后續(xù)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的設(shè)計(jì)改造和大規(guī)模的單寧酶發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種(AspergillusnigerJMU-TS528) 集美大學(xué)食品與生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏;茶梗 福建省泉州市安溪茶園;濃硫酸、NaOH、無水乙醇、乙酰丙酮、對(duì)二氨基苯甲醛 西隴化工股份有限公司;繞丹寧 東京化成工業(yè)株式會(huì)社;沒食子酸、沒食子酸丙酯 國藥集團(tuán)。

MJX智能型霉菌培養(yǎng)箱 寧波萊?？萍加邢薰?SW-CJ-2F雙人雙面潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;WK-1600A高速藥物粉碎機(jī) 山東省青州市精誠機(jī)械優(yōu)先公司;20目國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩 浙江上虞市金鼎標(biāo)準(zhǔn)篩具廠;FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;WNB-10數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Unic7200可見分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 移動(dòng)式填充床固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)的固態(tài)發(fā)酵過程與制曲的過程相類似,均以霉菌為出發(fā)菌株,以固體物質(zhì)為基質(zhì),在一定的溫度和濕度條件下進(jìn)行發(fā)酵。首先,物料接種后攪拌均勻,平鋪在箱體內(nèi)的料槽之上,加蓋密封。發(fā)酵初期為孢子萌發(fā)期,此階段培養(yǎng)箱內(nèi)原有的空氣足夠供應(yīng)微生物生長,可采取靜置培養(yǎng)的方式,微生物依靠自身呼吸作用和代謝產(chǎn)生的熱量會(huì)使培養(yǎng)基溫度上升,達(dá)到最適生長溫度;隨后,菌絲生長逐漸旺盛,溫度繼續(xù)升高,此時(shí),由于料層厚度不同造成的溫度梯度的現(xiàn)象開始出現(xiàn);采取間歇通風(fēng)的方式,使新鮮空氣通過料槽底部的密孔,穿過物料層,經(jīng)鼓風(fēng)機(jī)帶動(dòng)氣體循環(huán),從而保證曲料中溫度的穩(wěn)定,同時(shí)供給生長中所需的氧氣。目前,無論是醬油制曲還是酶的發(fā)酵,所使用的設(shè)備多為固定式設(shè)備,移動(dòng)和清洗困難?；谝陨戏治?設(shè)計(jì)的移動(dòng)式固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器應(yīng)滿足:發(fā)酵物溫度、濕度、供氧均勻,能及時(shí)控制發(fā)酵物溫度、濕度;發(fā)酵量可以根據(jù)需要調(diào)整,反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單;清洗容易,無死角。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,自來水1000 mL,自然pH。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(DM%,W/W):茶梗87.7%、NH4Cl 5%、蔗糖7%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.1%、NaCl 0.1%;配制時(shí)使用自來水溶解無機(jī)鹽,噴灑茶梗基質(zhì)至含水量在65%～80%。

種子培養(yǎng)基:三角瓶種子裝量為5 g干物質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基,接種前經(jīng)1.01 MPa、121 ℃滅菌20 min。

1.2.3 原料處理 茶梗在105 ℃恒溫干燥箱干燥2 h后粉碎,過20目篩備用。

1.2.4 單孢子菌懸液的制備 用新制備的PDA斜面培養(yǎng)基活化保存在4 ℃冰箱內(nèi)的黑曲霉菌株,30 ℃培養(yǎng)96 h至有大量成熟孢子產(chǎn)生。用預(yù)先滅菌的0.01%(V/V)吐溫-80溶液沖洗孢子,沖洗下的孢子液裝入有無菌玻璃珠的三角瓶中,搖床振蕩30 min打散孢子,將孢子懸液的OD600的值調(diào)至2.0,得到濃度約為1.0×108個(gè)/mL的黑曲霉孢子懸液。

1.2.5 種子的制備 種子培養(yǎng)基配制完成后,每瓶接入4 mL單孢子菌懸液(1×108個(gè)/mL)混勻,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72 h。

1.2.6 單寧酶固態(tài)發(fā)酵中試 配制5 kg/批次干物質(zhì)的中試固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基,接入1%(w/w)種子培養(yǎng)基,加入10 L配制的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液,攪拌均勻,以拋灑的方式填入填充床固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)箱中,料層厚度約為10 cm。發(fā)酵過程控制進(jìn)風(fēng)與回風(fēng)比為0∶1,發(fā)酵前24 h靜置培養(yǎng),24 h以后,開啟鼓風(fēng)機(jī),調(diào)節(jié)入風(fēng)口閥門大小,改變通風(fēng)量,并對(duì)單寧酶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。

1.2.7 噴灑增濕 前期對(duì)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶條件優(yōu)化時(shí),發(fā)現(xiàn)物料水分在60%～80%有利于單寧酶的產(chǎn)生[10]。因此,本試驗(yàn)控制整個(gè)發(fā)酵過程的濕度在60%～80%,當(dāng)濕度低于60%時(shí),利用噴灑裝置以0.1 m/min的速度對(duì)物料進(jìn)行增濕,待物料含水率接近80%時(shí),停止增濕。

1.2.8 通風(fēng)量(10、20、30 m3/h)對(duì)單寧酶中試發(fā)酵的影響

12.8.1 10 m3/h通風(fēng)量對(duì)單寧酶發(fā)酵的影響 調(diào)節(jié)入風(fēng)口閥門大小,使進(jìn)入培養(yǎng)箱內(nèi)的空氣流量為10 m3/h,測(cè)定在此通風(fēng)量條件下發(fā)酵過程中不同時(shí)間的酶活、生物量、溫度、含水量。

12.8.2 15 m3/h通風(fēng)量對(duì)單寧酶發(fā)酵的影響 調(diào)節(jié)入風(fēng)口閥門大小,將通風(fēng)量提高至15 m3/h,測(cè)定在此通風(fēng)量條件下發(fā)酵過程中不同時(shí)間、位置的酶活、生物量、溫度、含水量。

12.8.3 20 m3/h通風(fēng)量對(duì)單寧酶發(fā)酵的影響 調(diào)節(jié)入風(fēng)口閥門大小,將通風(fēng)量提高至20 m3/h,測(cè)定在此通風(fēng)量條件下發(fā)酵過程中不同時(shí)間、位置的酶活、生物量、溫度、含水量。

1.2.9 粗酶液的提取 以每5 g培養(yǎng)基干物質(zhì)加入50 mL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液的比例添加緩沖液,攪拌后置于25 ℃、180 r/min的搖床上振蕩0.5 h,定性濾紙過濾,收集到的酶液即粗酶液。

1.2.10 指標(biāo)測(cè)定

1.2.10.1 單寧酶活力的測(cè)定 參考保玉心等[11]測(cè)定單寧酶活力的方法:取3支10 mL的離心管,分別0.25 mL沒食子酸丙酯溶液(0.01 mol/L),將0.25 mL檸檬酸緩沖液加入空白管中,0.25 mL粗酶液加入到測(cè)試管中,3支離心管放于30 ℃溫育5 min后加入0.3 mL甲醇繞丹寧溶液(0.05 mol/L),30 ℃溫育5 min,后在對(duì)照管中加入0.25 mL滅活的粗酶液,然后3支離心管中分別加入0.2 mL的KOH溶液(0.5 mol/L),30 ℃溫育5 min,最后每支試管都用4 mL蒸餾水稀釋,30 ℃溫育5 min,在520 nm處,測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光值。單寧酶的酶活由吸光值的變化來計(jì)算。

酶活定義:30 ℃條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol沒食子酸所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.10.2 生物量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取5 g培養(yǎng)基干物質(zhì),在80 ℃烘干至恒重稱質(zhì)量,統(tǒng)計(jì)單位物料的生物量,即mg/g ds(mg/克干物質(zhì))。

1.2.10.3 水分含量測(cè)定 稱取一定質(zhì)量的培養(yǎng)基干物質(zhì)在80 ℃烘干至恒重稱重,計(jì)算減少的質(zhì)量并用百分比表示水分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Microsoft Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)分析平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,SPSS-IBM 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 固體發(fā)酵工藝與固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

微生物的固態(tài)發(fā)酵需要保證營養(yǎng)物質(zhì)、溫度、水分和氧氣。在通風(fēng)固體發(fā)酵制曲的過程中,風(fēng)依靠風(fēng)機(jī)從曲料底部進(jìn)入,依靠通風(fēng)帶走曲料生長過程中產(chǎn)生的熱量,從而保證曲料中溫度的穩(wěn)定,同時(shí)供給生長中所需的氧氣。其示意圖如圖1所示。

圖1 通風(fēng)發(fā)酵制曲示意圖Fig.1 Schematic diagram of ventilate koji-making注:1:物料箱;2:料槽;3:風(fēng)道;4:供風(fēng)系統(tǒng);5:假底;6:池底。

結(jié)合通風(fēng)發(fā)酵曲池的理念,設(shè)計(jì)適用于實(shí)驗(yàn)室中試規(guī)模的單寧酶的固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)箱。發(fā)酵規(guī)模為5 kg/批次(干物質(zhì)),培養(yǎng)時(shí)間為96～168 h。發(fā)酵期間基質(zhì)內(nèi)部最高溫度大于40 ℃,且培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)明顯的溫度梯度。在控溫的同時(shí)應(yīng)考慮培養(yǎng)基質(zhì)及培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境的濕度變化。因此,移動(dòng)式固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器由曲床、溫濕度控制系統(tǒng)、通風(fēng)系統(tǒng)、風(fēng)量調(diào)節(jié)系統(tǒng)、殼體、移動(dòng)系統(tǒng)幾部分組成,其設(shè)備結(jié)構(gòu)如圖2所示:

圖2 移動(dòng)式發(fā)酵培養(yǎng)箱結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure of removable fermentation incubator注:1:通水管;2:噴霧口;3:物料箱;4:側(cè)門;5:料槽;6:滑道;7:均風(fēng)板;8:假底;9:支架;10:萬向輪;11:排水管;12:入風(fēng)口;13:鼓風(fēng)機(jī);14:空氣入口;15:轉(zhuǎn)子流量計(jì);16:出風(fēng)口。

為了對(duì)發(fā)酵過程中物料的溫度及培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度進(jìn)行監(jiān)控,需安裝相應(yīng)的溫濕度記錄儀。將高100 mm、長1200 mm的發(fā)酵物料分為靠近通風(fēng)口處(A)、培養(yǎng)箱中部(B)和遠(yuǎn)離通風(fēng)口(C)的位置3處,上層(30 mm),中層(35 mm)和下層(35 mm)3層,設(shè)置9個(gè)測(cè)溫點(diǎn),每層3個(gè),分別命名為TA-1、TA-2、TA-3、TB-1、…TC-3。如圖3所示:

圖3 填充床反應(yīng)器各測(cè)溫點(diǎn)位置Fig.3 Temperature measuring point location in packed bed bioreactor

根據(jù)對(duì)移動(dòng)式填充床固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、風(fēng)機(jī)及溫濕度記錄儀的選擇,委托儀器制造廠家制作相應(yīng)的移動(dòng)式固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器,樣機(jī)如圖4所示。

圖4 移動(dòng)式填充床固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器樣機(jī)Fig.4 Mobile able packed-up solid-state incubator注:a:外觀結(jié)構(gòu);b:內(nèi)部形態(tài)及通風(fēng)系統(tǒng)。

2.2 單寧酶固態(tài)發(fā)酵中試

利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的填充床式發(fā)酵培養(yǎng)箱進(jìn)行單寧酶固態(tài)發(fā)酵,并探究不同通風(fēng)量對(duì)單寧酶發(fā)酵效果的影響。

2.2.1 10 m3/h通風(fēng)量條件下的試驗(yàn)結(jié)果 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),10 m3/h通風(fēng)量對(duì)發(fā)酵物料不同部位的酶活、含水量、生物量等影響微小,故后期發(fā)酵時(shí)未對(duì)10 m3/h通風(fēng)量的發(fā)酵物料進(jìn)行不同部位的取樣。采用10 m3/h通風(fēng)量對(duì)單寧酶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,如圖5(a)所示,單寧酶酶活隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增大,96 h時(shí)達(dá)到最大值8.21 U/g ds。此后酶活略有降低,可能是由于培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及有毒物質(zhì)的積累影響了微生物的酶性[12-13]。此外,生物量也隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增長,在72 h達(dá)到最大值225.27 mg/g ds。72 h后較高的發(fā)酵溫度和降低的含水量共同阻礙了菌體的生長,并延緩了代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的過程符合產(chǎn)物形成與菌體生長屬于部分偶聯(lián)型的關(guān)系[14]。

由圖5(b)可知,開始發(fā)酵的前24 h,微生物的生長使品溫上升;通風(fēng)后的降溫效果明顯,但熱量隨風(fēng)的流動(dòng)被帶出培養(yǎng)基質(zhì)時(shí),也帶走一部分水分,表現(xiàn)為培養(yǎng)基內(nèi)部溫度、水分含量下降。同時(shí),通風(fēng)為微生物的生長帶來了充分的氧氣,極大地促進(jìn)了微生物的生長,微生物代謝及產(chǎn)熱旺盛,品溫上升趨勢(shì)明顯,高的溫度影響微生物的生長,表現(xiàn)為代謝減緩。隨后,微生物的生長進(jìn)入平穩(wěn)期,溫度維持在一個(gè)平衡狀態(tài)。微生物的生長、產(chǎn)生的熱量和通風(fēng)使得物料中的水分含量急劇降低,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)96 h時(shí),物料含水率低于60%,為保證發(fā)酵過程中物料的濕度,對(duì)物料進(jìn)行噴灑增濕,使96 h后的水分含量上升。

圖5 10 m3/h通風(fēng)量下單寧酶活力與生物量(a)和發(fā)酵溫度與含水量(b)的變化曲線Fig.5 Changes of tannase activity and biomass(a)，temperature and moisture(b)under the aeration rate of 10 m3/h

2.2.2 15 m3/h通風(fēng)量條件下的試驗(yàn)結(jié)果 采用15 m3/h通風(fēng)量對(duì)單寧酶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,如圖6所示。由圖6(a)可知,在整個(gè)發(fā)酵過程中,單寧酶隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷積累,120 h單寧酶活達(dá)到最大8.08 U/g ds(靠近通風(fēng)口的A處)。可能是由于通風(fēng)對(duì)A點(diǎn)的降溫效果高于B和C點(diǎn),使得A點(diǎn)微生物生長代謝較快,相同時(shí)間內(nèi)積累的單寧酶較多。由圖6(b)可知,A、B、C處微生物的生長具有相似的趨勢(shì),但分別在72 h(A點(diǎn)和C點(diǎn))和96 h(B點(diǎn))達(dá)到最大生物量。在整個(gè)培養(yǎng)箱中微生物生長不同步可能是由于各部分溫度具有差別。

圖6 15 m3/h通風(fēng)量下單寧酶活力(a)、生物量(b)、物料含水量(c)和發(fā)酵溫度(d)變化曲線Fig.6 Changes of tannase activity(a),biomass(b),substrate moisture(c)and temperature(d)under the aeration rate of 15 m3/h注:A、B、C分別表示取樣點(diǎn)在靠近通風(fēng)口處、培養(yǎng)箱中部和遠(yuǎn)離通風(fēng)口的位置;TA-1、TB-1、TC-1分別表示測(cè)溫點(diǎn)在靠近通風(fēng)口處、培養(yǎng)箱中部和遠(yuǎn)離通風(fēng)口的料層上層;TA-2、TB-2、TC-2在靠近通風(fēng)口處、培養(yǎng)箱中部和遠(yuǎn)離通風(fēng)口的料層中層;TA-3、TB-3、TC-3分別表示測(cè)溫點(diǎn)在靠近通風(fēng)口處、培養(yǎng)箱中部和遠(yuǎn)離通風(fēng)口的料層下層;圖7同。

由圖6(c、d)可知,由于風(fēng)在流動(dòng)過程中損失,在到達(dá)C點(diǎn)位置時(shí)風(fēng)量及分壓很小,使通過料層的氣流減小,影響了該點(diǎn)處物料的散熱而導(dǎo)致熱量積累,使C點(diǎn)中部在發(fā)酵36 h時(shí)達(dá)到最高溫度46.5 ℃;同時(shí),也使C點(diǎn)的水分蒸發(fā)量大于靠近風(fēng)口的A處和中部的B處,表現(xiàn)為增濕后在96 h時(shí)的水分含量快速降低。

2.2.3 20 m3/h通風(fēng)量條件下的試驗(yàn)結(jié)果 采用20 m3/h通風(fēng)量對(duì)單寧酶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,如圖7所示。由圖7(a)可知,在整個(gè)發(fā)酵過程中,單寧酶酶活隨發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷增加。在144 h時(shí)單寧酶酶活達(dá)到最大值8.41 U/g ds(最大酶活仍出現(xiàn)在靠近通風(fēng)口的A處),且仍具有上升的趨勢(shì)。但144 h時(shí)C點(diǎn)最大酶活僅為5.45 U/g ds,原因是氣體在穩(wěn)壓層內(nèi)壓力流動(dòng)過程中,由于壓力損失和靜壓的增長會(huì)使在培養(yǎng)箱遠(yuǎn)離出風(fēng)口的C點(diǎn)的出氣流無法正常通過料層,導(dǎo)致無法有效地控制溫度,嚴(yán)重影響微生物的生長,同時(shí)會(huì)引起發(fā)酵過程中水分含量最低(c)和發(fā)酵溫度最高(d)都出現(xiàn)在遠(yuǎn)離通風(fēng)口的C點(diǎn)。

圖7 20 m3/h通風(fēng)量下單寧酶活力(a)、生物量(b)、物料含水量(c)和發(fā)酵溫度(d)變化曲線Fig.7 Changes of tannase activity(a),biomass(b),substrate moisture(c)and temperature(d)under the aeration rate of 20 m3/h

2.2.4 10、15、20 m3/h通風(fēng)量對(duì)單寧酶發(fā)酵效果的對(duì)比 將不同通風(fēng)量條件下的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析,如表1所示。在通風(fēng)量為10、15、20 m3/h的發(fā)酵過程中,發(fā)酵所達(dá)到的最大酶活相近,但達(dá)到最大酶活的時(shí)間具有顯著性差異(P<0.05),表明通風(fēng)量在10～20 m3/h的范圍內(nèi)對(duì)單寧酶發(fā)酵的影響不大,雖然較強(qiáng)的通風(fēng)對(duì)發(fā)酵過程中溫度的調(diào)節(jié)作用更為明顯,但在流經(jīng)料層時(shí)不僅帶出熱量,也使其攜帶更多水分,影響了微生物的生長,使達(dá)到最高生物量和最大酶活的時(shí)間延后。發(fā)酵中最大酶活均在生物量達(dá)到最大值之后達(dá)到,說明隨著菌體數(shù)量的增長,單寧酶在不斷的積累;酶活達(dá)到最大值后開始有所下降,可能是由于隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗,剩余的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足微生物的生長代謝,從而影響了微生物的產(chǎn)酶[15];另外,次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,也可能會(huì)降低單寧酶的活性[16]。

表1 不同通風(fēng)量條件下發(fā)酵效果比較Table 1 Comparisons of fermentation in different ventilation rates

2.3 單寧酶規(guī)?；l(fā)酵工藝的對(duì)比分析

將利用自行設(shè)計(jì)的填充床式固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器產(chǎn)單寧酶的發(fā)酵結(jié)果與已有的規(guī)?；瘑螌幟赴l(fā)酵工藝進(jìn)行對(duì)比分析,如表2所示。

表2 與單寧酶規(guī)模化研究的對(duì)比Table 2 Comparisons with tannase fermentation on a large scale

目前對(duì)單寧酶發(fā)酵的規(guī)?；芯枯^少;Beniwal等[17]以紅木屑為誘導(dǎo)物,從濕度、碳源及培養(yǎng)基pH等方面對(duì)單寧酶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,發(fā)酵后獲得最大單寧酶活力為1.84 U/g ds;Sabu等[12]以羅望子粉末以及棕櫚仁餅為基質(zhì),從濕度、時(shí)間及培養(yǎng)基含水量等方面對(duì)單寧酶發(fā)酵生產(chǎn)能力進(jìn)行優(yōu)化研究,固態(tài)發(fā)酵條件下獲得最大的酶活力為6.44 U/g ds;利用液態(tài)發(fā)酵方式產(chǎn)單寧酶的研究較多,但都限于三角瓶搖瓶發(fā)酵的研究,大罐培養(yǎng)的研究較少,可能是由于液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶所得產(chǎn)物多為胞內(nèi)酶,進(jìn)行大罐研究難度較大[18],本實(shí)驗(yàn)用填充床反應(yīng)器以茶梗為基質(zhì)進(jìn)行單寧酶的中試化發(fā)酵,發(fā)酵后獲得最大單寧酶活力為8.40 U/g ds,高于已有報(bào)道的最大酶活力,為后續(xù)大規(guī)模的單寧酶發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用提供了有利的參考。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)確定該培養(yǎng)箱外形尺寸大小為1200 mm×600 mm×600 mm,由不銹鋼材料制作,由鼓風(fēng)機(jī)帶動(dòng)空氣在箱體內(nèi)部的循環(huán);配置相應(yīng)的噴霧、溫度濕度傳感器,檢測(cè)發(fā)酵原料的溫度和濕度;在通風(fēng)量為10、15、20 m3/h的發(fā)酵過程中,發(fā)酵所達(dá)到的最大酶活分別為8.21、8.08、8.41 U/g ds,表明在該實(shí)驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間內(nèi),通風(fēng)量對(duì)單寧酶發(fā)酵的影響不大。但是采用較高的通風(fēng)量對(duì)發(fā)酵過程中溫度的調(diào)節(jié)作用更為顯著,且在20 m3/h的通風(fēng)量條件下,隨著發(fā)酵時(shí)間增加,酶活繼續(xù)上升。若以酶活為發(fā)酵指標(biāo),建議采用20 m3/h的通風(fēng)量固態(tài)發(fā)酵單寧酶。最大酶活分別在靠近入風(fēng)口的A點(diǎn)(15 m3/h)和B點(diǎn)(20 m3/h),最高溫度均出現(xiàn)先遠(yuǎn)離通風(fēng)口的C點(diǎn)中部,說明供風(fēng)量不均勻,穩(wěn)壓層的設(shè)計(jì)不合理,應(yīng)該進(jìn)一步改進(jìn)設(shè)備。