減壓內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮黃酮的工藝優(yōu)化

汪建紅

(1.內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,四川內(nèi)江 641119; 2.四川省高等學(xué)?！肮悘U棄物資源化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川內(nèi)江 641110)

荸薺是一種美味多汁的水果,具有抗腫瘤、清肺化痰、通腸利便等保健作用[1-2]。我國(guó)是荸薺的原產(chǎn)地,荸薺的生產(chǎn)和消費(fèi)量較大,每年可產(chǎn)出百萬(wàn)噸以上的鮮荸薺,按照26%的含皮量來(lái)計(jì)算，每年可產(chǎn)生26萬(wàn)噸左右的荸薺皮。這些荸薺皮要么被直接丟棄,要么被當(dāng)做飼料直接使用,其價(jià)值沒(méi)得到充分發(fā)揮[3-6]。荸薺皮富含黃酮,黃酮是一種重要的生物活性成分,可消炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤等,廣泛應(yīng)用于食品藥物等領(lǐng)域[7-10]。因此研究荸薺皮中黃酮的提取可大大提高其經(jīng)濟(jì)和實(shí)用價(jià)值,意義重大。

天然產(chǎn)物中有效成分的常用提取方法中,傳統(tǒng)的乙醇浸提法[11-14]得率較低,且提取時(shí)間較長(zhǎng);酶法[12,15-17]提取時(shí)間較長(zhǎng),且后處理較復(fù)雜,酶易失活;超聲波法[18-21]和微波法[22-25]得率較高,提取時(shí)間較短,但超聲波對(duì)人體存在潛在風(fēng)險(xiǎn),是潛在的致畸形因素,微波會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼部帶來(lái)?yè)p傷,并會(huì)使免疫功能下降,也會(huì)影響生殖機(jī)能。減壓內(nèi)部沸騰法是一種利用預(yù)先滲透入細(xì)胞組織內(nèi)部的有機(jī)物在一定真空度下發(fā)生內(nèi)部沸騰,從而加快活性成分解吸的方法[26-27]。內(nèi)部沸騰法高效省時(shí),得率較高,且操作簡(jiǎn)便，特別適用于熱敏性、不穩(wěn)定、易氧化等有效成分的提取[26-27]。內(nèi)部沸騰法是目前的研究熱點(diǎn),但尚無(wú)使用此法提取荸薺皮黃酮的記載。

因此,本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇溶液為提取溶劑,采用減壓內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮中的黃酮,并利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取條件,以期為荸薺皮以后的開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荸薺 內(nèi)江東興區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品(UC≥98%) 上海紀(jì)寧試劑有限公司;乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(分析純) 成都金山化學(xué)試劑有限公司。

DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DFT-100手提式萬(wàn)能高速粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;BSA822賽多利斯電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州英峪予華儀器有限公司;TDL-5-A低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SHA-B恒溫水浴振蕩器 金壇市漢康電子有限公司;T-6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SHB-B95水循環(huán)多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照汪建紅等[28]的方法,稱取20.00 g蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品,利用30%乙醇配制成0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,再將此標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋配制成0.008、0.016、0.024、0.032、0.040、0.048 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后先后利用5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液和1 mol/L的氫氧化鈉溶液對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行顯色,顯色后再在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得出其在8.000～48.000 μg/mL之間的線性回歸方程為A=0.0146C-0.0053,R2=0.9992。

1.2.2 荸薺皮中黃酮的提取和測(cè)定 將市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的荸薺取皮,然后洗凈荸薺皮,低溫烘干,并粉碎成粉。參考文獻(xiàn)蔡錦源等[26]、樂(lè)薇等[27]的方法,稱取1.00 g荸薺皮粉末置于100 mL圓底燒瓶中,加入5 mL 95%乙醇,常溫下浸泡30 min,然后迅速加入一定量已經(jīng)加熱到一定溫度的一定濃度的乙醇水溶液,裝上裝置,啟動(dòng)真空泵抽真空,水浴下在38 kPa左右壓力下真空回流一定時(shí)間,然后停止加熱,移去真空。待冷卻后,在1500 r/min的速度下離心10 min獲取上清液。將上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中,用30%乙醇溶液定容,得到荸薺皮黃酮提取液。

準(zhǔn)確移取1.00 mL上述提取液轉(zhuǎn)入25 mL比色管中,依次向其中加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液、1 mL 10%硝酸鋁溶液和6 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液,每加入一種試劑后需搖勻,并靜置6 min后再加入下一種試劑。再向其中加入30%乙醇溶液稀釋到10 mL,搖勻,靜置15 min。然后利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得其黃酮濃度,然后利用公式(1)計(jì)算荸薺皮中黃酮的得率。

黃酮得率(%)=(稀釋后黃酮濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積/荸薺皮粉質(zhì)量)×100

式(1)

1.2.3 乙醇濃度的影響 固定乙醇和荸薺皮粉末的液料比、提取溫度和提取時(shí)間分別為15∶1 mL/g、50 ℃和20 min,研究乙醇體積濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)對(duì)黃酮得率的影響。

1.2.4 液料比的影響 在將乙醇濃度固定為上一步實(shí)驗(yàn)確定的值,提取溫度、提取時(shí)間分別固定為50 ℃和20 min的條件下,研究液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g)對(duì)黃酮得率的影響。

1.2.5 提取溫度的影響 在將乙醇濃度、液料比分別固定為前面步驟確定的值,提取時(shí)間固定為20 min的條件下,研究提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對(duì)黃酮得率的影響。

1.2.6 提取時(shí)間的影響 在將乙醇濃度、液料比和提取溫度分別固定為前面步驟確定的值的條件下,研究提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對(duì)黃酮得率的影響。

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選擇三個(gè)影響顯著的因素為自變量,分別記為A、B、C,每個(gè)因素3個(gè)水平,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。該響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)每組實(shí)驗(yàn)條件做三次平行實(shí)驗(yàn),并取其平均值。對(duì)每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Origin 75繪圖軟件繪制曲線,并以此曲線研究并分析各單因素對(duì)黃酮得率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面模型,采用Design Expert 8.0 軟件分析并處理響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果,得出最佳提取工藝條件和因素影響大小順序。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)荸薺皮黃酮提取效果的影響 乙醇濃度對(duì)荸薺皮黃酮得率的影響如圖1所示。從圖1中可看到,隨乙醇濃度增大,黃酮得率的變化趨勢(shì)為先逐漸增大后逐漸減小,在乙醇體積濃度為60%時(shí)出現(xiàn)最大值1.340%。這是由于乙醇濃度過(guò)小時(shí),會(huì)使預(yù)先浸泡時(shí)滲透入荸薺皮內(nèi)部的乙醇被稀釋,導(dǎo)致內(nèi)部沸騰不夠劇烈,甚至不發(fā)生內(nèi)部沸騰,對(duì)黃酮從細(xì)胞壁上的解吸造成不利;乙醇濃度過(guò)大時(shí),內(nèi)部沸騰較為劇烈,會(huì)導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)有大量的提取物及乙醇溶解的大量脂溶性雜質(zhì)通過(guò)內(nèi)外對(duì)流的孔隙進(jìn)入溶液中,易造成孔隙的堵塞,影響黃酮提取[26-27]。因此,最佳乙醇體積濃度為60%。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Influence of ethanol concentration on the yield of flavonoid

2.1.2 液料比對(duì)荸薺皮黃酮提取效果的影響 液料比對(duì)荸薺皮黃酮得率的影響如圖2所示。從圖2可看到,隨溶劑用量增加,黃酮得率逐漸增大,在35∶1 mL/g時(shí)達(dá)最大值1.768%;當(dāng)液料比大于35∶1 mL/g后黃酮得率沒(méi)出現(xiàn)明顯變化,甚至略有下降。這是由于溶劑越多,能溶解的黃酮越多;但由于選做溶劑的乙醇濃度小于預(yù)先進(jìn)入荸薺皮內(nèi)部的乙醇濃度,溶劑增多會(huì)導(dǎo)致已預(yù)先進(jìn)入荸薺皮組織內(nèi)部的乙醇被逐漸稀釋,使內(nèi)部沸騰引起的對(duì)流被削弱,影響黃酮解吸[26-28]。因此,選擇最佳液料比為35∶1 mL/g。

圖2 液料比對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Influence of liquid-solid on the yield of flavonoid

2.1.3 提取溫度對(duì)荸薺皮黃酮提取效果的影響 提取溫度對(duì)荸薺皮黃酮得率的影響如圖3所示。從圖3可看到,提取溫度的上升導(dǎo)致黃酮得率先逐漸上升后逐漸下降,且在70 ℃時(shí)達(dá)最大值2.022%。這是由于提取溫度越高內(nèi)部沸騰越劇烈,有利于黃酮從荸薺皮上解吸;但內(nèi)部沸騰過(guò)于劇烈時(shí),也會(huì)造成短時(shí)間內(nèi)大量提取物和溶解的脂溶性雜質(zhì)通過(guò)對(duì)流孔隙,易堵塞荸薺皮內(nèi)外對(duì)流的孔隙,影響黃酮的溶解析出[26-27]。因此,最佳提取溫度為70 ℃。

圖3 溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Influence of temperature on the yield of flavonoid

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)荸薺皮黃酮提取效果的影響 提取時(shí)間對(duì)荸薺皮黃酮得率的影響如圖4所示。從圖4可看到,隨時(shí)間的延長(zhǎng),黃酮得率先逐漸增大,在20 min達(dá)到最高點(diǎn)2.022%后,又逐漸下降。這是由于荸薺皮內(nèi)外黃酮濃度差異較大,時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)使更多的黃酮從荸薺皮解吸轉(zhuǎn)移到溶液中,但時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致更多的溶劑乙醇在減壓下被真空泵帶走,使部分已溶解析出黃酮重新固化,另外,時(shí)間的增加也會(huì)導(dǎo)致更多的進(jìn)入溶液中的黃酮在加熱下分解變質(zhì)[26-27]。因此,最佳提取時(shí)間為20 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Influence of extraction time on the yield of flavonoid

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,考慮到各因素對(duì)荸薺皮多糖得率影響的顯著情況,選擇固定液料比在35∶1 mL/g的條件下,以乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素為自變量,分別記為A、B、C,以黃酮得率(R)為響應(yīng)值,響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

根據(jù)表2中數(shù)據(jù),利用Design Expert 8.0軟件擬合的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

R=1.97+0.023A+0.042B+0.024C+0.017AB-0.098AC+0.019BC-0.037A2-0.060B2-0.031C2

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2.3 交互作用分析 各因素間交互作用的響應(yīng)面圖及等高線如圖5～圖7所示。從圖5～圖7也可看到,等高線均不是圓形,而是近似于橢圓形和非規(guī)整形狀,且與圖形兩柱之間形成一定角度,說(shuō)明乙醇濃度和溫度、乙醇濃度和時(shí)間及溫度和時(shí)間之間的交互作用均顯著,與方差分析結(jié)果一致。

圖5 乙醇濃度、溫度交互作用的等高線和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour plot and response surface plot of interaction between ethanol concentration and temperature

圖6 乙醇濃度、時(shí)間交互作用的等高線和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour plot and response surface plot of interaction between ethanol concentration and time

圖7 溫度、時(shí)間交互作用的等高線和響應(yīng)面圖Fig.7 Contour plot and response surface plot of interaction between temperature and time

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)Design Expert 8.0軟件對(duì)所得到的模型的優(yōu)化分析,得出黃酮提取的最優(yōu)提取條件為:乙醇濃度50.77%,溫度73.71 ℃,時(shí)間30 min,此時(shí)黃酮得率理論上為2.011%?？紤]到實(shí)驗(yàn)室的具體條件,將該最佳提取條件修正為:乙醇濃度50%,溫度70 ℃,時(shí)間30 min,在此最佳條件下進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn),黃酮得率為1.996%±0.010%,與理論預(yù)測(cè)值2.001%的相對(duì)誤差為0.25%。此結(jié)果接近于預(yù)測(cè)值,說(shuō)明該模型是可靠的,適合于荸薺皮黃酮的提取工藝優(yōu)化。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以乙醇溶液為溶劑,采用減壓內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮中黃酮,并利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件,得出最佳提取條件為:液料比35∶1 mL/g,乙醇濃度50%,溫度70 ℃,時(shí)間30 min,此條件下平行實(shí)驗(yàn)的黃酮得率為1.996%±0.010%,與理論預(yù)測(cè)值2.001%的相對(duì)誤差為0.25%,說(shuō)明結(jié)果是準(zhǔn)確的,模型是可靠的。溫度、時(shí)間、乙醇濃度三因素影響的先后順序?yàn)?溫度>時(shí)間>乙醇濃度。減壓內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮黃酮高效省時(shí),對(duì)荸薺皮黃酮的提取研究有一定的實(shí)際意義。