響應面法優(yōu)化番茄醬發(fā)酵工藝

,2,*

(1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025; 2.茅臺學院,貴州仁懷 564500; 3.貴州省農業(yè)科學院生物技術研究所,貴州貴陽 550025; 4.麻江明洋食品有限公司,貴州凱里 556000)

番茄(Solanumlycopersicum),屬于我國大宗蔬菜之一,含豐富營養(yǎng)物質[1],在我國大部分地區(qū)均有種植,每年番茄制品產量位居世界前茅,其中90%以上用于出口,我國2016年加工番茄在600萬噸以上[2]。我國番茄醬出口以大包裝為主,缺乏深加工,國內外關于發(fā)酵番茄醬制品的研究微乎甚微,研究發(fā)現(xiàn)番茄經過發(fā)酵后不僅能改善其風味,還能提高有機酸、VC、氨基酸等營養(yǎng)物質[3-7],具有緩解乳糖不耐癥、免疫調節(jié)及抗腫瘤的作用[8-9]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類可發(fā)酵糖類產生乳酸的無芽孢、革蘭氏染色陽性的細菌總稱,具有耐酸、接觸酶陰性及兼性厭氧等特性,果蔬發(fā)酵領域對乳酸菌的營養(yǎng)頗多[10-12]。植物乳桿菌、凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌屬于食品中常用的乳酸菌,日本大制藥公司曾利用植物乳桿菌發(fā)酵開發(fā)出一種具有獨特風味且營養(yǎng)豐富的蔬菜飲品——“蔬菜的戰(zhàn)士”,頗受市場歡迎[13],植物乳桿菌還能產生酯酶,水解復雜的多酚類物質轉化為結構更加簡單的酚類物質[14],小分子物質可以使產品獲得更好風味。嗜酸乳桿菌在酸脅迫時能通過激活谷氨酸脫酸酶的活性來提高其耐酸的能力[15-16]。凝結芽孢桿菌具有乳酸菌產乳酸且產量高的性能,又具有芽孢桿菌豐富的酶系統(tǒng)及抗逆性強、耐高溫高壓的儲存特性,其產酸所需營養(yǎng)要求低,對木糖利用高,代謝產物中具有廣譜抗菌效果的多肽類細菌素物質,通過MTT實驗證明沒有明顯毒性,且能夠被蛋白酶水解[17]。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌桿菌的混合發(fā)酵具有協(xié)同作用[18],可以克服單一菌株發(fā)酵單一的缺陷,如共同降低亞硝胺的產生[19]等。所以本實驗通過探究植物乳桿菌、凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵番茄醬的最佳復配比例,并對發(fā)酵番茄醬的工藝進行響應面優(yōu)化,力求獲得色香味俱全、有機酸含量高且種類豐富的發(fā)酵番茄醬,為發(fā)酵番茄醬的生產提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵原料 選取無蟲害、成熟度高、顏色鮮紅、外觀完整、色澤均一的貴州主栽番茄作為發(fā)酵的原料;食鹽、食糖 市售;老酸湯 凱里市玉夢紅酸湯有限公司;嗜酸乳桿菌1.1878 中國微生物菌種保藏中心;凝結芽孢桿菌1.420、植物乳桿菌6233 廣州微生物菌種保藏中心;乳酸細菌(MRS)培養(yǎng)基 上海博微生物科技有限公司;草酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸(均為色譜純) 北京索萊寶科技有限公司;磷酸二氫銨 為優(yōu)級純;氫氧化鈉 為分析純,成都金山化學試劑有限公司。

SPE-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;LS-B75L-I型立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設備有限公司;NH310便攜式電腦色差儀 深圳市三恩時科技有限公司;Agilent 1260 高效液相色譜配有可變波長紫外檢測器 美國安捷倫公司;WondaSil C18Superb(5 μm 4.6 mm×150 mm) 島津技邇(上海)商貿有限公司;HH恒溫水浴鍋 金壇市中大儀器廠;LRH-250-GS人工氣候箱 廣東省醫(yī)療器械;TG 16-WS離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司;PHS-3C 酸度計 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 菌液制備、活化 在無菌操作臺中分別取三種菌粉(植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、凝結芽孢桿菌)少許于100 mL無菌MRS液體培養(yǎng)基中,搖勻,于(37±0.5) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,再分別吸取2 mL活化菌懸液于100 mL無菌MRS液體培養(yǎng)基中,搖勻,置于(37±0.5) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,備用。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 乳酸菌復配 將三種乳酸菌菌株(植物乳桿菌6233、嗜酸乳桿菌1.1878、凝結芽孢桿菌1.420)進行組合,以番茄醬體積計(mL)按表1接種3%混合乳酸桿菌到番茄醬中置于28 ℃恒溫發(fā)酵20 d,以有機酸和總酸含量為考核指標,篩選出產酸能力較強的菌株組合,以自然發(fā)酵番茄醬為對照,發(fā)酵方法參照1.2.1。

表1 有機酸回歸方程Table 1 Organic acid regression equation

1.2.3.2 發(fā)酵溫度 將乳酸菌組合按照比例接種3%到番茄醬中,置于25、28、31、34、37 ℃條件下恒溫發(fā)酵30 d,色差值、總酸和有機酸含量為考核指標,確定最佳的發(fā)酵溫度。

1.2.3.3 發(fā)酵時間 將乳酸菌按照比例接種3%到番茄醬中,置于28 ℃下恒溫發(fā)酵,分別在第10、20、30、40、50 d進行取樣,以色差值、總酸和有機酸含量為考核指標,確定最佳的發(fā)酵時間。

1.2.3.4 接種量 將篩選出的乳酸菌組合分別按照1%、3%、5%、7%、9%的比例接種到番茄醬中,置于28 ℃恒溫發(fā)酵30 d,以色差值、總酸和有機酸含量為考核指標,確定最佳的乳酸菌接種量。

1.2.3.5 異VC-Na添加量 將乳酸菌按照比例接種3%到番茄醬中,分別添加異VC-Na為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%后置于28 ℃溫度下恒溫發(fā)酵30 d,以色差值、總酸和有機酸含量為考核指標,確定最佳的發(fā)酵時間。

1.2.4 番茄醬發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上,采用Design Expert 8.0.6 根據(jù)Box-bnheken試驗設計原理,以發(fā)酵時間(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)、異VC-Na(D)添加量為4個影響因素,以總酸含量(Y)為響應值,采用響應面法進行中心組合設計試驗,因素水平表見表2。

表2 發(fā)酵番茄醬工藝響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiment for fermentation of tomato sauce

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 色差值測定 用便攜式色差儀測定,依次讀取L*、b*值。其中L*值表示亮度,L*值越大說明顏色越亮越接近白色;a*、b*值反映產品的色度,若a*值越大產品越紅;若b*值越大產品越黃。

1.2.5.2 有機酸含量測定 有機酸標準儲備液的配制:準確稱取乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸、琥珀酸0.0200 g,分別用純凈水定容至10 mL容量瓶中,搖勻,配制成濃度為2 mg/mL的有機酸標準儲備液。

有機酸混合標準曲線的制作:分別吸取各有機酸儲備液0.025、0.05、0.1、0.5 mL定容至10 mL容量瓶中(使各有機酸質量濃度依次為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/mL)搖勻,進樣20 μL,采集數(shù)據(jù)。根據(jù)峰面積與濃度的關系建立線性回歸方程,見圖1及表3。

圖1 有機酸混合標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed organic acids注:1:草酸;2:酒石酸;3:蘋果酸;4:乳酸;5:檸檬酸;6:琥珀酸。

表3 有機酸回歸方程Table 3 Organic acid regression equation

樣品前處理:取發(fā)酵完成的樣品5.000 g,加入0.2 g活性炭,用蒸餾水定容至50 mL容量瓶中,于8000 r/min離心10 min,取上清液用0.22 μm濾膜過濾,待進樣。

液相色譜條件:柱溫30 ℃,檢測波長210 nm;流動相:甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液(pH=2.6)(98∶2);流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL。

1.2.5.3 總酸測定 酸堿中和測定法,參考曹建康改編的《果蔬采后生理生化實驗指導》進行測定[20]。

1.2.5.4 發(fā)酵番茄醬的感官評定 組織10人小組對發(fā)酵番茄醬進行感官評定評分(見表4),用平均值表示不同品種發(fā)酵番茄醬所得感官評定總分。

表4 發(fā)酵番茄醬感官評價標準Table 4 Sensory evaluation criteria for fermented tomato sauce

1.2.6 模型的驗證 利用響應面模型優(yōu)化的最佳條件進行發(fā)酵實驗,比較模型預測值與實驗值,驗證模型的有效性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各指標重復測定3次,色差值重復測定6次,取平均值。使用Origin 8進行數(shù)據(jù)記錄、初步處理和繪制圖表;采用SPSS 17軟件進行單因素方差分析與顯著差異分析,Design Expert 8.0.6進行Box-bnheken實驗設計。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乳酸菌不同比例對發(fā)酵有機酸、乳酸、總酸影響 如表5所示,將三株菌種分別進行組合接種到番茄醬中,由于混合乳酸菌生長代謝占優(yōu)勢,與自然發(fā)酵對比,總酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸含量明顯增加,A、B、C、D組乳酸比自然發(fā)酵組分別增加24.45%、30.45%、27.64%、58.17%,蘋果酸分別增加79.68%、50%、67.96%、128.91%。其中D組乳酸占總酸含量最高為83.257%,乳酸酸味柔和,較高的檸檬酸、蘋果酸能使番茄醬具有爽快溫和酸味,對改善番茄醬酸味具有積極的作用,綜合總酸、蘋果酸以及檸檬酸含量考慮,選擇D組(植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶凝結芽孢桿菌=1∶2∶1)作為發(fā)酵番茄醬的發(fā)酵劑。

表5 菌株復配接種番茄醬發(fā)酵產酸結果 Table 5 Results of acid production by mixed inoculation with tomato sauce

2.1.2 溫度對發(fā)酵過程中色差、總酸、有機酸影響 如表6所示,隨著溫度的升高,色差值逐漸減少,番茄醬黃度、紅度降低,L*值減小。由圖2可知,溫度對乳酸菌產酸速度和產酸量均有所影響,發(fā)酵溫度對有機酸、總酸含量具有明顯影響,當發(fā)酵溫度在25～28 ℃之間時,草酸、酒石酸、蘋果酸增加,乳酸菌產乳酸量可達15.9 g/kg,乳酸占總酸含量在73%～79%之間,當溫度從31 ℃上升至37 ℃時,乳酸菌代謝受阻,乳酸減少,37 ℃時乳酸含量減少到10.59 g/kg,檸檬酸逐漸增加,可能原因是,乳酸減少,檸檬酸作為產乳酸的底物受到阻礙而富集[21]。綜合考慮,選擇28 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

表6 溫度對發(fā)酵番茄醬色差的影響Table 6 Effect of temperature on color difference of fermented tomato sauce

圖2 溫度對發(fā)酵番茄醬產酸的影響Fig.2 Effect of temperature on acid production of fermented tomato sauce

2.1.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵過程中色差、總酸、有機酸影響 如表7所示,發(fā)酵時間對番茄醬色差有明顯影響,發(fā)酵時間越長,酶促褐變產生色素越多,發(fā)酵前30 d,色差值緩慢下降,黃度、紅度降低,發(fā)酵30 d以后L*值顯著下降(P<0.05)。由圖3可知,發(fā)酵番茄醬中的有機酸含量隨著時間的變化明顯的變化,當發(fā)酵10～30 d時,發(fā)酵液中乳酸菌代謝最為旺盛,各種有機酸含量均明顯增大,發(fā)酵第30 d時,乳酸含量增加到12.69 g/kg,占總酸含量最高為71.02%,當發(fā)酵30 d以后,番茄醬發(fā)酵液中底物被乳酸菌逐漸消耗殆盡,蘋果酸、檸檬酸逐漸被消耗,因此,為最大化保留番茄醬中的有機酸含量,選擇最佳發(fā)酵時間為30 d。

表7 發(fā)酵時間對發(fā)酵番茄醬色差的影響Table 7 Effect of fermentation time on color difference of fermented tomato paste

圖3 發(fā)酵時間對發(fā)酵番茄醬產酸的影響Fig.3 Effect of fermentation time on acid production of fermented tomato sauce

2.1.4 接種量的影響 接種量對番茄漿的影響明顯,接種量少,番茄醬總酸增長緩慢,接種量多,有機酸生成速率及產酸量提高,不僅成本增加,還可能會嚴重抑制其它微生物的生長而影響番茄醬的整體風味。如表7所示,接種量小于5%時,色差值變化緩慢,接種量大于5%以后,L*值開始下降。由圖4可知,當接種量在1%～3%之間時,蘋果酸、乳酸、檸檬酸及總酸含量均呈現(xiàn)增加的趨勢,乳酸占總酸含量最高為56.6%;接種量為5%以后,乳酸菌消耗營養(yǎng)物質加快,導致營養(yǎng)物質消耗殆盡,可能乳酸菌部分開始提早消亡[22],有機酸和總酸開始緩慢減少,綜上所述,選擇最佳接種量為3%。

表8 接種量對發(fā)酵番茄醬色差的影響Table 8 Effect of inoculation amount on color aberration of fermented tomato sauce

圖4 接種量對發(fā)酵番茄醬產酸的影響Fig.4 Effect of inoculation on acid production in fermented tomato sauce

2.1.5 異VC-Na添加量的影響 番茄醬顏色在發(fā)酵過程中不僅受到乳酸菌代謝產物的影響,還與本身褐變有關,添加異VC-Na不僅可以克服番茄醬變色、異味和混濁等現(xiàn)象,還可以抑制發(fā)酵番茄醬中亞硝酸鹽的量[23]。如表9所示,不同異VC-Na的添加量對發(fā)酵番茄醬的色差值具有明顯的影響,當添加量小于1.5%時,色差減少緩慢,紅度高,亮度大;異VC-Na能夠抑制微生物繁殖速率[24],由圖5可以看出,隨著異VC-Na添加量增大,乳酸菌產酸的速率逐漸緩慢,有機酸含量變化不明顯,綜合異VC-Na成本及有機酸含量考慮,選擇添加1%異VC-Na較合適。

表9 異VC-Na添加量對發(fā)酵番茄醬色差的影響Table 9 Effect of addition of different VC-Na on color difference of fermented tomato sauce

圖5 異VC-Na添加量對發(fā)酵番茄醬產酸的影響Fig.5 Effect of VC-Na addition on acid production in fermented tomato sauce

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

在單因素實驗結果的基礎上,以發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、接種量(C)、異VC-Na(D)添加量為4個影響因素,以總酸(Y)為響應值,根據(jù)Box-bnhenken試驗設計原理進行優(yōu)化實驗,試驗因素設計與結果見表10,利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表9中數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合,得到二次多項式回歸方程:

表10 Box-behnken試驗設計結果Table 10 Box-behnken experimental design results

總酸含量(Y)=24.73-0.93A-0.74B-0.73C-0.49D-0.96AB+0.30AC-0.92AD-1.39BC+0.015BD+0.74CD-4.82A2-3B2-1.28C2-0.39D2

表11 響應面方差分析結果Table 11 Response surface ANOVA results

兩兩交互作用的響應面圖見圖6。

由圖6的三維空間圖可知,該試驗在所選范圍內存在極值,既是三維曲面的最高點,又是等高線橢圓的中心點。與B方向比較,A方向的響應面曲線較陡,A等高線的密度顯著高于沿B方向的密度,說明發(fā)酵溫度(A)對發(fā)酵番茄醬總酸含量的影響顯著高于發(fā)酵時間(B),等高線呈橢圓形,表明發(fā)酵溫度(A)與發(fā)酵時間(B)交互作用顯著;與D方向比較,A方向的響應面曲線較陡,A等高線的密度顯著高于沿D方向的密度,說明發(fā)酵溫度(A)對發(fā)酵番茄醬總酸含量的影響顯著高于異VC-Na添加量(D),等高線呈橢圓形,表明發(fā)酵溫度(A)與異VC-Na添加量(D)交互作用顯著;與C方向比較,B方向的響應面曲線較陡,B等高線的密度顯著高于沿C方向的密度,說明發(fā)酵時間(B)對發(fā)酵番茄醬總酸含量的影響顯著高于接種量(C),等高線呈橢圓形,表明發(fā)酵時間(B)與接種量(C)交互作用極顯著;與D方向比較,C方向的響應面曲線較陡,C等高線的密度顯著高于沿D方向的密度,說明接種量(C)對發(fā)酵番茄醬總酸含量的影響顯著高于異VC-Na添加量(D),等高線呈橢圓形,表明接種量(C)與異VC-Na添加量(D)交互作用顯著。

圖6 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、乳酸菌接種量、異VC-Na添加量交互的響應面及等高線Fig.6 The interactive response surface and contour of fermentation temperature,fermentation time,inoculation amount of lactic acid bacteria,addition of VC-Na

2.3 驗證實驗

由回歸方程可解出4個因素的最佳條件,分別為發(fā)酵溫度27.93 ℃、發(fā)酵時間30.14 d、接種量1.83%、異VC-Na添加量0.5%,在此條件下發(fā)酵番茄醬的總酸含量預測值為25.25 g/kg。考慮到實際操作的便利性與可行性,將模型條件修正為發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間30 d、接種量為1.8%,異VC-Na添加量0.5%,在此條件下進行3次重復驗證性試驗,得到發(fā)酵番茄醬總酸含量均值為25.16 g/kg,與預測值接近,表明該模型擬合程度較好,具有實用價值,在此條件下發(fā)酵的番茄醬有機酸含量如表12 所示,蘋果酸、檸檬酸分別高出自然發(fā)酵 44.84%、46.7%,草酸比自然發(fā)酵少31.9%。少量的草酸可減少產品刺激味道[21],酒石酸酸感強[25],乳酸使番茄醬酸味柔和,較高的檸檬酸、蘋果酸能使番茄醬具有爽快溫和酸味,單一的有機酸口味比較平淡,多種有機酸可賦予產品更加可口的風味[26],對改善番茄醬酸味具有積極的作用,通過感官評析可知最佳發(fā)酵組合的番茄醬酸爽適口、酸味濃,自然發(fā)酵酸味偏淡、酸味不足,所以通過響應面優(yōu)化得出的最佳發(fā)酵方式比自然發(fā)酵口感佳,符合大眾消費者口味。

表12 最優(yōu)組合發(fā)酵和自然發(fā)酵的番茄醬有機酸含量及感官評價結果Table 12 The organic acid content and sensory evaluation results of tomato sauces by optimal combination fermentation and natural fermentation

3 結論

通過單因素實驗和響應面優(yōu)化試驗,得到最佳的乳酸菌配比為植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶凝結芽孢桿菌=1∶2∶1,確定了影響因素對發(fā)酵番茄醬總酸含量的影響大小為:發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間>乳酸菌接種量>異VC-Na添加量;通過二次多元回歸方程,確定最優(yōu)發(fā)酵條件分別為發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間30 d、接種量1.8%、異VC-Na添加量0.5%,在此條件下進行3次重復驗證性試驗,得到色澤、口感較佳且有機酸含量比自然發(fā)酵高的發(fā)酵番茄醬,得到發(fā)酵番茄醬總酸含量均值為25.16 g/kg,與預測值接近,證明該數(shù)據(jù)模型合理可靠,在此條件下發(fā)酵的番茄醬色澤鮮艷,風味濃郁,口感極佳。