應(yīng)用Illumina Miseq測序分析川西高原傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵酸奶中細菌多樣性

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

牦牛酸奶是高原地區(qū)游牧民族最常食用的乳制品[1],川西的高原地區(qū)空氣稀薄,氣溫較低,含氧量少,太陽轄射強,降水量較少,牦牛奶資源豐富。長期以來,牧民沿用傳統(tǒng)發(fā)酵方法制作牦牛酸奶[2-3],其富含營養(yǎng),風(fēng)味獨特,由于地域、氣候環(huán)境以及生活習(xí)慣不同,形成了特有的微生物菌群,具有廣泛的生物多樣性[4]。研究表明牦牛酸奶含有大量對人體有益的微生物,如乳酸菌、酵母菌和芽孢菌[5],其中以乳酸菌為主。乳酸菌是一種益生菌,可以改善人體內(nèi)部的微生物環(huán)境,改善腸道,加速食物的消化與吸收,有效降低體內(nèi)的膽固醇,抑制腐敗物質(zhì)在腸道中的繁殖等[6-8]。如今,乳酸菌已經(jīng)在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中得到了非常廣泛的應(yīng)用[9-12]。

第二代DNA測序(next-generation DNA sequencing,NGS)技術(shù)就是指能在單次生化反應(yīng)中同時檢測來自數(shù)千(或數(shù)百萬)DNA模板上堿基序列的DNA測序技術(shù),通過讀取多個短DNA 片段,拼接成完整的序列信息,具有高數(shù)據(jù)通量、短序列讀長(read)及低于Sanger測序法準(zhǔn)確度的特點[13]。由Illumina開發(fā)的小型單道測序儀Miseq的誤差率較低,能輸出較長的read[14]。近年來,Miseq測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于測試一些復(fù)雜環(huán)境中的微生物多樣性,包括污泥、土壤、海水和食物等[15-19]。目前Illumina Miseq已運用于牦牛乳制品中,對細菌群落組成進行分析,為開發(fā)優(yōu)良微生物資源提供了重要的依據(jù)[20-21]。這項技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比,既可以產(chǎn)生測序覆蓋深度更大的數(shù)據(jù)量,還可以及時發(fā)現(xiàn)一些低豐度的細菌菌群,保證微生物菌落分析的準(zhǔn)確性,同時直觀反應(yīng)微生物的群落類型。

本研究應(yīng)用Illumina Miseq測序技術(shù),對川西高原傳統(tǒng)發(fā)酵的牦牛酸奶中細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析,以期深入了解川西高原牦牛酸奶中包含的細菌群落類型、結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群,為保護和開發(fā)利用我國寶貴的高原乳酸菌資源、建立我國乳酸菌種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫,以及工業(yè)化生產(chǎn)牦牛酸奶提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛酸奶樣品 采自甘孜藏族自治州和阿壩藏族羌族自治州4個縣不同村落的8份牦牛酸奶樣品,如表1,將牧民家用自然發(fā)酵方式制作的牦牛酸奶,在其發(fā)酵器中充分?jǐn)嚢韬?用干凈的一次性勺裝入已滅菌采樣瓶和離心管中,將采集的樣品放入冰盒內(nèi)冷卻,保持在低溫狀態(tài)下帶回實驗室放于-80 ℃冰箱;DNA抽提試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司;2%Agarose gels 西班牙biowest公司;FastPfuPolymerase 中國TransGen公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen公司;Illumina MiSeq platform 美國Illumina公司;FastDNASPINKitforSoil 美國MP公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen Biosciences公司。

表1 傳統(tǒng)牦牛酸奶來源Table 1 Source of traditional yok yogurt

Eppendorf 5424R高速臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司;NanoDrop2000超微量分光光度計 美國ThermoFisherScientific公司;DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠;Miseq測序儀 美國Illumina公司;PCR儀 ABI GeneAmp?9700型。

1.2 實驗方法

1.2.1 總DNA的提取與檢測 DNA的提取步驟參照試劑盒說明書進行操作。提取的DNA濃度以及純度通過NanoDrop2000進行分析,并通過1%瓊脂糖凝膠電泳對得到的DNA質(zhì)量進行檢驗。

1.2.2 細菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR擴增 以樣本總DNA為模板,用(5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′)引物實現(xiàn)V3～V4[17-18]可變區(qū)的PCR擴增處理。擴增程序為:95 ℃預(yù)變性3 min,27個循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL,4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。

1.2.3 Illumina Miseq測序 反應(yīng)中的PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠進行回收,并通過AxyPrep DNA Gel Extraction Kit對得到的物質(zhì)實施純化處理,用Tris-Hcl清洗,最后將產(chǎn)物通過2%瓊脂糖電泳法進行檢測。產(chǎn)物的具體含量通過QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)法測試得到。利用Illumina Miseq平臺相關(guān)操作規(guī)范來將得到的純化擴增片段建立PE 2×300的文庫。并通過Illumina公司的Miseq PE300平臺來測得其序列。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗中得到的測試數(shù)據(jù)利用Trimmomatic軟件進行質(zhì)控,并應(yīng)用FLASH軟件實現(xiàn)拼接;通過UPARSE軟件按照97%的相似度對序列展開OTU聚類,對其中存在的嵌合體主要是通過UCHIME軟件實現(xiàn)剔除[22]。以RDP classifier來對獲得的每條序列進行物種分類,并根據(jù)Silva數(shù)據(jù)庫進行序列對比分析,本文中的比對閾值設(shè)置為70%。

在經(jīng)過Miseq測序之后,首先通過overlap關(guān)系將得到的PE reads實施拼接,另外針對序列的質(zhì)量展開質(zhì)控和過濾,隨后對樣本展開OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。通過OTU分析得到物種的多樣性指數(shù),同時實現(xiàn)對測序深度的檢測;根據(jù)分類學(xué)信息,能夠?qū)崿F(xiàn)在各個分類水平上的群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析[23-25]。經(jīng)過上述的分析,可以針對群落的組成以及發(fā)育信息進行多元化分析和差異性檢驗,實現(xiàn)更深層次的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵牦牛酸奶測序信息

本試驗測序樣品數(shù)8個,共獲得375236條優(yōu)化序列,平均每個樣品46905條。將所有樣品的優(yōu)化序列進行聚類,在97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析,4個縣8個樣品共有88條不同的OTU。

2.2 發(fā)酵牦牛酸奶稀釋曲線

本研究用隨機抽樣的方法獲取序列數(shù)以及其對應(yīng)的OTU數(shù)目,并繪制相應(yīng)的稀釋性曲線[16]如圖1所示,樣品GC稀釋曲線到10000條序列趨于平緩,樣品BY3、NMJ稀釋曲線到30000條序列趨于平坦,樣品LV、WQ、SZLK、LAN、BY1稀釋曲線到40000條序列時已經(jīng)接近平緩,趨于平坦,意味著繼續(xù)增加測序量對于發(fā)現(xiàn)新的OTU沒有影響,樣品中序列沒有被測出的概率極低,測序深度基本覆蓋樣品中所有細菌。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Sample dilution curve

2.3 發(fā)酵牦牛酸奶alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

如表2所示為不同牧民自制傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中細菌菌群α-多樣性分析。8個樣品共產(chǎn)生88條不同的OTU,通過觀測到的物種數(shù)(Sobs)、趙氏指數(shù)(Chao[26])和物種豐富度指數(shù)(ACE)可知,樣品LV、LAN中物種數(shù)目較多,而樣品BY1、BY3和NMJ中物種數(shù)較少,樣品WQ物種數(shù)雖然只要25種,但其ACE指數(shù)和Chao指數(shù)均較高,說明其菌群豐度較高。香農(nóng)指數(shù)(Shannon[27])和辛普森指數(shù)(Simpson[28])通常用來表征物種多樣性,其中Shannon是估計樣品中微生物多樣性,Shannon值越大,說明群落多樣性越高;Simpson主要是以定量的方式表征某區(qū)域物種的多樣性,其數(shù)值越大,就意味著該區(qū)域物種多樣性越低[29]。據(jù)表2可知,樣品GC的Shannon指數(shù)最高為1.21,Simpson指數(shù)最低為0.38,說明樣品GC細菌群落多樣性最高且分布均勻,而樣品BY1中包含的物種豐富度程度最低。Coverage是反映群落覆蓋度(Community coverage)的指數(shù),其數(shù)值越高,則樣本中序列沒有被檢測出的概率越低,表中Coverage均為1,說明97%的物種類型都能在樣品庫得到,再次說明測序深度基本覆蓋了所有細菌。

表2 alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 2 The alpha diversity index of statistics

2.4 發(fā)酵牦牛酸奶Venn圖分析

Venn圖可用于統(tǒng)計多組或多個樣本中所共有和獨有的物種(如OTU)數(shù)目,可以比較直觀地表現(xiàn)環(huán)境樣本的物種(如OTU)組成相似性及重疊情況[30]。由圖2可知,8個樣品按照不同地區(qū)分組,四個地區(qū)共同擁有10條OTU,占總樣品OTU的11.4%。巴塘縣、紅原縣和阿壩縣共同擁有17條OTU;巴塘縣、阿壩縣和白玉縣共同擁有12條OTU;紅原縣、阿壩縣和白玉縣共同擁有12條OTU;紅原縣、巴塘縣和白玉縣共同擁有10條OTU。巴塘縣和紅原縣共同擁有28條OTU;巴塘和白玉共同擁有19條OTU;紅原縣和阿壩縣共同擁有22條OTU;阿壩縣和巴塘縣共同擁有20條OTU;阿壩縣和白玉縣共同擁有14條OTU;紅原縣和白玉縣共同擁有13條OTU。每個樣品還有其僅有的OTU,巴塘縣獨有31條OTU,數(shù)量最多,白玉縣僅獨有1條OTU,數(shù)量最少,紅原縣獨有9條,阿壩縣獨有3條。因此,從總體看來,四個縣的牦牛酸奶樣品中的微生物群落的結(jié)構(gòu)具有一定的相似性,但由于環(huán)境和地理位置等差異,不同牦牛酸奶樣品中具有其獨有的微生物群落。

圖2 OTU韋恩圖Fig.2 Venn chart of OTU

2.5 發(fā)酵牦牛酸奶中細菌群落組成

為了實現(xiàn)對測試樣品中包含物種的多樣性信息進行表征,需要對所有的有效序列進行聚類,并以97%的序列相似性作為標(biāo)準(zhǔn)將序列聚類成為OTU,然后再深度分析[31]。

從表3細菌在門水平分布來看,8個樣品共檢測出8個細菌門,分別為硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、Saccharibacteria、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。所有樣本均含有厚壁菌門,且含量占比高,占據(jù)總樣本數(shù)量的98.33%～99.96%,這是因為牦牛酸奶中富含大量的乳酸菌,乳酸菌均為厚壁菌門,說明8份牦牛酸奶樣品在屬水平上群落結(jié)構(gòu)多樣性相近,優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門?，斠罉贰ぐＬ岬萚32]應(yīng)用454焦磷酸測序技術(shù)對新疆阿圖什及烏什傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶進行分析;智楠楠等[21]應(yīng)用Illumina Miseq對市場上銷售的酸奶進行分析;呼斯楞等[33]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法對內(nèi)蒙古地區(qū)酸奶進行了分析;以上實驗得出的結(jié)果在門水平上均與本實驗結(jié)果一致。硝化螺旋門主要是污水處理廠中的功能菌群[34],其僅存在于樣品LV中,可能是牧民游牧?xí)r生活在污水處理廠附近,導(dǎo)致所采樣品受到些許污染。放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門和綠灣菌門均是植物土壤中常有的微生物菌門[35],牧民生活環(huán)境惡劣,常常以地為桌,做好的酸奶普遍放在地上,這可能是樣品中均檢測出少量這些微生物的原因。

表3 細菌在門水平群落結(jié)構(gòu)Table 3 Bacterial community structure at phylum level

從圖3細菌在屬水平分布來看,8個樣本共檢測68個已知屬。其中相對豐度占比排名前六的有乳桿菌屬(Lactobacillus,86.99%),鏈球菌屬(Streptococcus,9.90%),厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus,1.75%),巨型球菌屬(Macrococcus,0.31%),魏斯氏菌屬(Weissella,0.25%),乳球菌屬(Lactococcus,0.10%)。在所有樣品中乳桿菌屬占主導(dǎo)地位,相對豐度占比69.31%～99.92%,為優(yōu)勢菌屬,其所占比例高低依次是BY1、SZLK、LAN、NMJ、LV、BY3、WQ、GC;在樣品GC、BY3和NMJ中鏈球菌屬相對豐度也較高,占比分別為26.39%、17.06%和11.12%,說明鏈球菌屬在這三份牦牛酸奶發(fā)酵過程中可能起著較為重要的作用;在樣品LV中厭氧芽孢桿菌屬相對豐度也較高,占比為12.21%;在樣品LAN巨型球菌屬相對豐度也較高,占比為2.47%。8份牦牛酸奶的優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬,說明其在種水平群落結(jié)構(gòu)相近。

圖3 細菌在屬水平群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure at genus level

2.6 發(fā)酵牦牛酸奶樣品多樣性種類異同分析

Heatmap圖通過顏色梯度來表征二維矩陣中的數(shù)據(jù)大小,并呈現(xiàn)群落物種組成信息,通過顏色變化與相似程度來反映不同分組(或樣本)在各分類水平上群落組成的相似性和差異性[36]。根據(jù)所有樣品在屬水平上的信息,挑選豐度前35的屬,通過其在每個樣品中的豐度信息從物種和樣品兩個方面進行聚類,得到heatmap圖,如圖4所示。由圖4可知,乳桿菌屬在所有樣品中含量均為最高,鏈球菌屬在樣品GC、WQ、SZLK、BY3和NMJ中含量較高。除此之外,樣品GC中相對于其他樣品含量更高的菌屬有魏斯氏菌屬、乳球菌屬(Lactococcus)、Escherichia-Shigella、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、Subdoligranulum、奇異球菌屬(Deinococcus);樣品LAN中相對于其他樣品含量更高的有巨型球菌屬、Tepidiphilus、Paraclostridium和芽孢桿菌屬(Bacillus);樣品BY3中相對于其他樣品含量更高的菌屬有醋酸桿菌屬(Acetobacter);樣品BY1中相對于其他樣品含量更高的菌屬有明串珠菌屬(Leuconostoc);樣品LV中相對于其他樣品含量更高的菌屬有厭氧芽孢桿菌屬。其中金黃桿菌屬某些細菌是條件致病菌,在動物機體處于應(yīng)激或免疫力低下時容易引起感染[37],并且金黃桿菌屬均具有較高的耐藥性[38]。樣品GC中含有的金黃桿菌屬,可能是母牛產(chǎn)奶時正處于免疫力低下的時候引起的感染。

圖4 屬水平物種豐富度聚類熱圖Fig.4 Heatmap at genus level

2.7 PCoA分析

PCoA分析主要是分析樣本中菌落相似性或差異性,主成分以縱坐標(biāo)表示,百分比表示該成分對樣品差異的貢獻值[32]。圖中各點代表不同地區(qū)牦牛酸奶中菌群組成,當(dāng)樣品距離比較接近時表示兩種物種的結(jié)構(gòu)更加相似,所以一般將相似度較高的樣品聚集在一起,兩種菌落差異較大的樣品則會存在很大的間距。由圖5可知,樣品BY1、NMJ、SZLK和BY3距離較近,其群落結(jié)構(gòu)較為相似;樣品SZLK、WQ、GC和LAN距離較近,其群落結(jié)構(gòu)相似;樣品GC、LAN和LV距離較近,其群落結(jié)構(gòu)相似。樣品BY1、NMJ、SZLK和BY3距離樣品LV較遠,說明其群落結(jié)構(gòu)差異較大。樣品之間群落結(jié)構(gòu)存在交叉,表示不同地區(qū)的牦牛酸奶中的菌群結(jié)構(gòu)不僅存在差異性,同時也具有相似性。

圖5 牦牛酸奶樣PCoA主坐標(biāo)分析Fig.5 Yak yoghurt sample PCoA analysis

3 討論

本研究利用Illumina Miseq測序技術(shù)對川西高原阿壩藏族羌族自治州和甘孜藏族自治州4個縣8戶牧民家經(jīng)傳統(tǒng)自然發(fā)酵的牦牛酸奶細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明,在門水平上,細菌的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes),在屬水平上,相對豐度占比排名前六的有乳桿菌屬、鏈球菌屬、厭氧芽孢桿菌屬、巨型球菌屬、魏斯氏菌屬、乳球菌屬,乳桿菌屬相對豐度占86.99%,占主導(dǎo)地位。據(jù)包秋華[2]、呼斯楞等[33]、扎木蘇[5]、丁武蓉[39]和孫志宏等[40]通過不同方法對牦牛酸奶中細菌多樣性的分析,牦牛酸奶中主要菌門均為菌群均為厚壁菌門,主要菌屬均為乳桿菌屬,本研究中的優(yōu)勢菌屬和其他學(xué)者研究的牦牛乳中乳酸菌的優(yōu)勢菌屬一致,其他主要菌屬也大致相似,但出現(xiàn)了其他研究中少有的厭氧芽孢桿菌屬和巨型球菌屬。厭氧芽孢桿菌在土壤以及人體腸胃中大量存在,絕大部分病菌屬于腐物寄生菌,部分致病菌能分泌出外毒素和侵襲性酶類,可以治愈一些常規(guī)的疾病,例如肉毒梭菌(Clostridiumdifficile)等[41]。本試驗中樣品出現(xiàn)厭氧芽孢桿菌屬,可能是牧民在擠牛奶的時候不慎沾染到少許牛糞等腐敗物,而在后續(xù)殺菌處理中未將其完全消除,而殘留至最后酸奶成品中。巨型球菌屬是革蘭氏陰性球菌,其特性與果膠桿菌類似,常見于麥汁和啤酒當(dāng)中產(chǎn)生醋酸、丙酸和硫化氫,使啤酒出現(xiàn)渾濁和臭雞蛋味[42]。埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)是牛瘤胃正常的優(yōu)勢菌,經(jīng)丙烯酰輔酶A生成丙酸,是瘤胃丙酸特殊生成途徑之一[43]。本試驗牦牛酸奶出現(xiàn)的巨型球菌屬可能是來源自牛瘤胃中。

在所有樣品中乳桿菌屬占主導(dǎo)地位,相對豐度占比69.31%～99.92%,為優(yōu)勢菌屬,說明8份樣品在屬水平上的細菌結(jié)構(gòu)非常的相似。根據(jù)同期運用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法對樣品中乳酸菌進行分離鑒定的結(jié)果發(fā)現(xiàn),乳桿菌屬和乳球菌屬為主要菌屬,其中89%是乳桿菌屬,說明Illumina Miseq測序技術(shù)能較全面地分析出樣品中細菌的菌落結(jié)構(gòu),為實際運用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究利用Illumina Miseq測序技術(shù)對川西高原阿壩藏族羌族自治州和甘孜藏族自治州四個縣8戶牧民家經(jīng)傳統(tǒng)自然發(fā)酵的牦牛酸奶細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明,測序樣品數(shù)8個,共獲得375236條優(yōu)化序列,平均每個樣品46905條,共有88條不同的OTU;樣品GC的α-多樣性指數(shù)最佳,細菌群落多樣性最高且分布均勻;巴塘縣的兩個樣品相對其它縣占僅有的OTU數(shù)最多,為31;8個樣品在門水平上,細菌的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes);在屬水平上,主要細菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、巨型球菌屬(Macrococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella),乳桿菌屬(Lactobacillus)是所有樣品的優(yōu)勢菌屬;根據(jù)樣品的Heatmap和PCoA分析可知,8份樣品在屬水平和種水平上的群落結(jié)構(gòu)相似,具有細微的差異,說明不同地區(qū)的牦牛酸奶中的群落結(jié)構(gòu)具有差異性和相似性。