以小麥粉為基質(zhì)的地衣芽孢桿菌與酵母混酵氨基酸代謝特征

李 欣1,2,3,黃石寬2,陳 雄2,姚 娟3,李志軍3,常 旭3,廖 蓓3,陳向東

(1.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北武漢 430072; 2.教育部發(fā)酵工程重點實驗室,工業(yè)微生物湖北省重點實驗室,湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北工業(yè)大學(xué),湖北武漢 430068; 3.湖北安琪酵母股份有限公司,湖北宜昌 443003)

白酒是中國特有的固態(tài)釀造酒類,是多種多樣的微生物混合發(fā)酵的結(jié)果。白酒釀造微生物呈現(xiàn)出種類多和分布廣(涵蓋原核微生物中的細菌和放線菌,真核微生物中的霉菌和酵母,以及古細菌),并具有相當(dāng)?shù)膹?fù)雜度(多種微生物參與同一過程;同種微生物具有不同生理和代謝特征)[1]。其中,芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌、己酸菌等幾大類群是主要的細菌群落[2-5]。如,地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌是大曲發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌[6-7]。釀酒酵母屬、伊薩酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬和德克酵母屬也是白酒中常見的酵母類微生物[8-9]。

傳統(tǒng)的白酒固態(tài)釀造的時空環(huán)境,為不同性狀和營養(yǎng)特異的微生物構(gòu)建了生存和代謝的時間區(qū)間和微區(qū)域。然而,白酒發(fā)酵傳統(tǒng)工藝周期長,步驟復(fù)雜,轉(zhuǎn)化率低,品質(zhì)穩(wěn)定性不高。利用現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)開發(fā)白酒液態(tài)發(fā)酵技術(shù)是中國白酒工業(yè)的一項重大技術(shù)改革。田梁等人以高粱糖化液為原料,采用序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝,確定固定化生香酵母、乳酸菌、己酸菌的最佳添加量,獲得總酸和總酯含量分別為486.62和258.28 mg/L的白酒[10]。唐取來等人以粉碎大米為原料,純種培養(yǎng)的根霉曲、高產(chǎn)酯適量低產(chǎn)高級醇釀酒酵母和乳酸菌為糖化發(fā)酵劑,結(jié)合液化酶、糖化酶和酸性蛋白酶的使用,通過全液態(tài)法工藝釀造出高總酯含量且風(fēng)味物質(zhì)均衡的米香型白酒[11-13]。相對于傳統(tǒng)固態(tài)法白酒,液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)白酒具有出酒率高、機械化連續(xù)化程度高和勞動效率高等優(yōu)點,但其存在風(fēng)味物質(zhì)豐富程度不足的問題,從而使液態(tài)法白酒口味淡薄、單一,缺乏固態(tài)法發(fā)酵白酒的自然感?？梢?液態(tài)法生產(chǎn)白酒還有大量關(guān)鍵技術(shù)需要突破。闡明不同微生物混合發(fā)酵的發(fā)酵代謝特征就是這些方面之一。風(fēng)味組分的變化受到廣泛的關(guān)注[14-21],實際上,除自身的營養(yǎng)功能外,氨基酸還是滋味的貢獻者,也可作為風(fēng)味前體物參與風(fēng)味的形成[22],而氨基酸代謝卻極少引起重視。本研究以芽孢桿菌與酵母菌的混配發(fā)酵,研究不同搭配條件下的氨基酸代謝特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、釀酒酵母(Saccharomycecerevisiae)、漢遜酵母(Hansenula)、弗比恩畢赤酵母(Pichiafabianii)、魯氏結(jié)合酵母(Zygosaccharomycesrouxii) 湖北宜昌安琪酵母股份有限公司提供;小麥粉 購自武漢市太陽行食品有限責(zé)任公司;酵母粉、蛋白胨(生化試劑) 均購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;乳酸標(biāo)準(zhǔn)品(50 mg/100 mL) 購自山東科學(xué)院生物研究所;氨基酸標(biāo)品[甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、蛋氨酸(Met)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)和組氨酸(His)] 均購買于Sigma公司;3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)(分析純)、氫氧化鈉、無水乙醇、吡啶、氯仿、碳酸氫鈉和無水硫酸鈉 均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;氯甲酸乙酯(Ethyl chloroformate,ECF) 購自成都市科隆化學(xué)品有限公司;葡萄糖(食品級) 購自山東祥瑞藥業(yè)有限公司;體積分數(shù)95%酒精(醫(yī)用級) 購自武漢興和達商貿(mào)有限公司;YEPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)培養(yǎng)基 酵母粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1000 mL,自然pH;LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基 酵母粉5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2～7.4;發(fā)酵培養(yǎng)基 5 g小麥粉中添加100 mL水,攪拌混勻,自然pH。

SBA生物傳感儀 山東省科學(xué)院生物研究所;CJ-2D無菌操作臺 天津泰斯特儀器有限公司;BL-75A高壓滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司;HNY-211B恒溫搖床 天津歐諾儀器儀表有限公司;ZSD-A1160A恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司;CT15RE離心機 日本日立公司;V-1100D可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;5804R型離心機 德國Eppendorf公司;帶有FID檢測器的7890B氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子活化 從微生物保藏斜面分別挑取適量的地衣芽孢桿菌菌落到LB培養(yǎng)基或酵母菌落到Y(jié)EPD培養(yǎng)基中,37 ℃(地衣芽孢桿菌)或30 ℃(酵母菌)、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達到3.0(地衣芽孢桿菌)或20.0(酵母菌)。分別取1 mL酵母和地衣芽孢桿菌培養(yǎng)種子液于無菌離心管中,8000 r/min離心5 min,去除上清,并在沉淀物中加入1 mL無菌水,充分混勻后全部轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2.2 混合發(fā)酵 將接種有地衣芽孢桿菌和酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)基置于恒溫振蕩搖床中,在30 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)216 h,且每隔24 h取樣用于檢測分析。

1.2.3 指標(biāo)測定方法

1.2.3.1 還原糖濃度測定 參照文獻[23],取0.5 mL去離子水適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液離心上清液(4 ℃、8000 r/min下離心10 min得到)中加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS),沸水中水浴10 min,冷卻后加入4.0 mL去離子水,混勻后測定540 nm吸光值。以響應(yīng)值為縱坐標(biāo),葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=1.5031X-0.0509,R2為0.9982。

1.2.3.2 乙醇濃度測定 參照文獻[24],采用SBA生物傳感儀檢測乙醇濃度。發(fā)酵液在4 ℃、8000 r/min下離心10 min,收集上清液,用去離子水適當(dāng)稀釋后用于測定。樣品進樣量為25 μL。用乙醇標(biāo)準(zhǔn)液對生物傳感儀進行定標(biāo)。乙醇標(biāo)準(zhǔn)液的配制(現(xiàn)用現(xiàn)配):將25 μL無水乙醇加入100 mL容量瓶中,并用去離子水定容,所配得乙醇質(zhì)量濃度為20 mg/100 mL。

1.2.3.3 氨基酸濃度測定 參照文獻[25],采用氯甲酸乙酯(ECF)衍生化處理樣品,通過氣相色譜檢測氨基酸濃度。2%乙酸苯乙酯作為氨基酸相對定量的內(nèi)標(biāo)物。色譜柱為HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm,安捷倫,美國)。升溫程序:70 ℃保留5 min,以5 ℃/min升到260 ℃,并保留2 min。進樣量1.0 μL。不分流模式。流速1.0 mL/min;載氣為氮氣。進樣口溫度280 ℃;檢測器溫度280 ℃。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 每組實驗3個平行。運用Excel計算平均值和方差,并運用Origin 8.6軟件對檢測數(shù)據(jù)作圖。

以混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖為對照,依據(jù)保留時間對樣品色譜圖中的色譜峰進行定性分析,篩選出氨基酸色譜峰。以乙酸苯乙酯濃度作為依據(jù),按照內(nèi)標(biāo)法計算各氨基酸組分的相對濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌與酵母菌混酵基本特征

圖1展現(xiàn)了地衣芽孢桿菌與單一酵母共酵過程中的還原糖與乙醇變化過程。當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌與漢遜酵母混酵時,發(fā)酵液中還原糖濃度不超過2 g/L,而乙醇最大積累濃度達到(93.33±4.71) mg/L。然而,當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌分別與另外三種酵母混酵后,發(fā)酵液中的還原糖逐步積累,最大濃度分別為(8.21±0.39) g/L(畢赤酵母,168 h)、(7.62±0.33) g/L(釀酒酵母,192 h)和(9.43±0.46) g/L(魯氏酵母,216 h)。發(fā)酵液中乙醇的變化與還原糖變化相匹配,如圖1B。畢赤酵母、釀酒酵母和魯氏酵母與地衣芽孢桿菌混酵過程均無法高效地積累乙醇,最大乙醇濃度依次為(26.67±4.71) mg/L(96 h)、(13.33±4.71) mg/L(216 h)和(16.67±4.71) mg/L(168 h)。依據(jù)乙醇積累特征,與地衣芽孢桿菌混酵的酵母可明顯分為兩類。一類為適配酵母,即漢遜酵母,即能與地衣芽孢桿菌協(xié)調(diào)生長,也能高效地將碳源轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖?。另一類為低適配酵母,包括畢赤酵母、釀酒酵母和魯氏酵母。低適配酵母無法有效積累乙醇的可能原因是地衣芽孢桿菌對低適配酵母的生長代謝存在抑制效應(yīng)[26],降低了酵母糖醇轉(zhuǎn)化能力。

圖1 地衣芽孢桿菌分別與四種酵母 共酵過程還原糖(A)和乙醇(B)變化Fig.1 Changes of reducing sugar(A)and ethanol(B)during the co-fermentation process of B. licheniformis and yeast注:BL表示地衣芽孢桿菌;H代表漢遜酵母;P表示弗比恩畢赤酵母;S表示釀酒酵母;Z表示魯氏結(jié)合酵母。

2.2 氨基酸代謝分析

當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌分別與漢遜酵母、畢赤酵母、釀酒酵母和魯氏結(jié)合酵母混合發(fā)酵時,依次檢測到16種、17種、11種和11種氨基酸?；旖蜅l件下的最大總氨基酸濃度分別為(6149.79±375.51) μg/mL(漢遜酵母,96 h)、(6333.78±669.45) μg/mL(畢赤酵母,96 h)、(265.02±41.14) μg/mL(釀酒酵母,48 h)和(2061.36±194.76) μg/mL(魯氏結(jié)合酵母,48 h)。甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸&谷氨酰胺、苯丙氨酸、組氨酸和酪氨酸共11種氨基酸在4種混合發(fā)酵條件下均被檢測到,這些氨基酸被歸為共有氨基酸。

當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌和漢遜酵母混合時,除脯氨酸和組氨酸外,其它氨基酸在發(fā)酵前期均不積累,但從第96 h開始,所有氨基酸出現(xiàn)明顯的積累過程。當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌和畢赤酵母共存時,氨基酸的積累主要發(fā)生在發(fā)酵的前期,第120 h后,除脯氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和酪氨酸外,其它氨基酸不再積累或只有個別時間段少量積累。當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌和釀酒酵母共酵時,亮氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸只分別存在發(fā)酵早期、中期和末期的樣品中,纈氨酸、異亮氨酸和酪氨酸表現(xiàn)出振蕩式積累過程。當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌和魯氏結(jié)合酵母混酵時,亮氨酸只在發(fā)酵初期的樣品中被檢測到,蘇氨酸和苯丙氨酸只存在發(fā)酵后期的樣品中,異亮氨酸在發(fā)酵中期缺失。

2.2.1 共有氨基酸分析 圖2用雷達圖的形式顯示了4種混酵條件下的共有氨基酸的差異。漢遜酵母與畢赤酵母均有利于甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的積累,且促積累水平相似,這些氨基酸的最大濃度依次分別為:430.72 μg/mL(甘氨酸,漢遜酵母)和447.41 μg/mL(甘氨酸,畢赤酵母)、593.58 μg/mL(纈氨酸,漢遜酵母)和620.45 μg/mL(纈氨酸,畢赤酵母)、1111.06 μg/mL(亮氨酸,漢遜酵母)和922.99 μg/mL(亮氨酸,畢赤酵母)、903.55 μg/mL(苯丙氨酸,漢遜酵母)和789.77 μg/mL(苯丙氨酸,畢赤酵母)、526.72 μg/mL(酪氨酸,漢遜酵母)和436.82 μg/mL(酪氨酸,畢赤酵母)。此外,漢遜酵母和畢赤酵母還有利于蘇氨酸濃度的增加,但漢遜酵母比畢赤酵母的促積累效果更好,其蘇氨酸的最高濃度為468.49 μg/mL,是畢赤酵母的2倍。除釀酒酵母條件下沒有明顯積累,其它3種酵母均促進了脯氨酸水平的提高,最高水平分別為218.49 μg/mL(漢遜酵母)、312.34 μg/mL(畢赤酵母)和69.66 μg/mL(魯氏酵母)。可見,漢遜酵母和畢赤酵母比釀酒酵母更利于脯氨酸積累。對谷氨酸和谷氨酰胺而言,漢遜酵母(Cmax378.44 μg/mL)、畢赤酵母(Cmax539.05 μg/mL)和魯氏結(jié)合酵母(Cmax485.14 μg/mL)對它們的積累有相似的刺激作用,但最大積累濃度出現(xiàn)的時間不同。只有畢赤酵母能刺激異亮氨酸的積累,在發(fā)酵96 h達到最大濃度411.43 μg/mL,其它3種酵母沒有顯著的促積累效果。對組氨酸而言,只有魯氏結(jié)合酵母能刺激此氨基酸的積累,在發(fā)酵48 h達到最大濃度1320.81 μg/mL。

圖2 地衣芽孢桿菌與酵母共酵過程的共有氨基酸變化Fig.2 The changes of common amino acids during the co-fermentation process of B. licheniformis and yeast注:H表示漢遜酵母;P表示弗比恩畢赤酵母;S表示釀酒酵母;Z表示魯氏結(jié)合酵母;濃度單位均為μg/mL。

2.2.2 非共有氨基酸分析 表1顯示了地衣芽孢桿菌與酵母共酵過程的非共有氨基酸變化。絲氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸和賴氨酸只在漢遜酵母或畢赤酵母存在時才出現(xiàn)。這些氨基酸在漢遜酵母與畢赤酵母之間的差異在于積累時間段顯著不同。畢赤酵母主要在發(fā)酵前半階段積累,而漢遜酵母主要在發(fā)酵后半階段積累。在畢赤酵母中,絲氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸和賴氨酸的最大濃度依次為(226.45±18.54) μg/mL(96 h)、(79.95±5.53) μg/mL(96 h)、(9.68±0.59) μg/mL(24 h)、(10.70±0.86) μg/mL(96 h)和(1027.50±244.97) μg/mL(96 h)。在漢遜酵母中,絲氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸和賴氨酸的最大濃度依次為(222.37±40.02) μg/mL(96 h)、(64.61±4.14) μg/mL(120 h)、(41.65±7.73) μg/mL(216 h)、(14.84±0.77) μg/mL(96 h)和(1105.92±376.51) μg/mL(96 h)?？梢?漢遜酵母比畢赤酵母更容易積累絲氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和賴氨酸,畢竟這些氨基酸在漢遜酵母中的濃度普遍高于畢赤酵母。

表1 地衣芽孢桿菌與酵母共酵過程的非共有氨基酸變化Table 1 The changes of non-common amino acid during the co-fermentation process of B. licheniformis and yeast

丙氨酸是地衣芽孢桿菌與畢赤酵母混合發(fā)酵所特有,只在發(fā)酵中前期積累,最大積累量為(210.76±11.29) μg/mL(96 h)。三種酵母與地衣芽孢桿菌混酵的區(qū)間性分布暗示這樣一種可能性,即通過多酵母與地衣芽孢桿菌混合發(fā)酵有助于在發(fā)酵體系中形成更豐富的氨基酸成分。

3 結(jié)論

4種酵母與地衣芽孢桿菌混酵時對還原糖的利用能力和糖醇轉(zhuǎn)化能力的區(qū)別提示在液態(tài)發(fā)酵白酒的研究中組合使用的微生物之間的適配性對白酒生產(chǎn)基礎(chǔ)參數(shù)乙醇濃度起關(guān)鍵作用。同時,氨基酸代謝分析展現(xiàn)出不同微生物混酵下氨基酸代謝在特征代謝物、代謝強度和代謝時間區(qū)間上的差異,而這些差異很可能與最終風(fēng)味差異存在一定的聯(lián)系。總體而言,不同酵母混酵體系的差異應(yīng)該來自微生物之間的相互作用和體系中各自微生物對環(huán)境的代謝適應(yīng)這兩個方面,而前者應(yīng)該處于主導(dǎo)地位。因此,白酒釀造中的另外一種常見細菌枯草芽孢桿菌與不同酵母混酵的特點以及這兩種芽孢桿菌在與酵母混酵體系的氨基酸代謝共性和差異性也是值得進一步研究的。應(yīng)該看到,同一細菌菌株僅與不同酵母兩兩復(fù)配已經(jīng)展現(xiàn)出一定程度的代謝多樣性,可以預(yù)見當(dāng)更多的微生物參與后,體系的復(fù)雜性和多樣性會大幅提升,因果關(guān)系也越模糊,這也是白酒釀造研究中的主要難點。