DPP4抑制劑高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵特性

(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200436)

糖尿病(DM)是一種以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝疾病,其中90%以上患者罹患2型糖尿病(T2DM)。2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)稱,中國(guó)糖尿病人數(shù)達(dá)到1.14億人,約占中國(guó)成年人總數(shù)的1/10,已嚴(yán)重危害人民群眾的健康和生命[1]。隨著對(duì)T2DM發(fā)病機(jī)制的深入研究,二肽基肽酶-4(DPP-4)逐漸成為治療糖尿病的新靶點(diǎn)[2]。DPP-4抑制劑通過(guò)抑制體內(nèi)DPP-4活性,提高體內(nèi)胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和葡萄糖依賴性胰島素釋放多肽(GIP)的濃度,進(jìn)而促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素的分泌而發(fā)揮降血糖作用,并且能改善胰島α及β細(xì)胞功能[3]。目前臨床上使用的DPP-4抑制劑屬于列汀類(lèi)藥物,在使用過(guò)程中會(huì)有胃腸道和皮膚不適、過(guò)敏和肌骨失常等不良反應(yīng)[4-8]。因此,篩選和設(shè)計(jì)新型的DPP-4抑制劑,仍是當(dāng)前口服降糖藥的開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)之一。

天然來(lái)源的DPP-4抑制劑與化學(xué)合成的列汀類(lèi)藥物相比,具有作用溫和、安全性高以及副作用小等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。目前,海洋魚(yú)類(lèi)[9]、乳蛋白(包括牛、馬、牦牛和駱駝)[10-13]、豆類(lèi)植物[14,15]以及各種發(fā)酵食品(包括納豆、酸奶和干酪等)[16-19],是天然DPP-4抑制劑的重要來(lái)源,其中有大量研究是通過(guò)各種蛋白水解酶,水解酪蛋白或乳清蛋白而生成的多種乳源性DPP-4抑制肽[20]。Lacroix等[21]利用胃蛋白酶(Pepsin)水解牛乳清蛋白中的β-乳球蛋白,發(fā)現(xiàn)酶解得到的LKPTPEGDL和LKPTPEGDLEIL小肽,對(duì)DPP-4的IC50值分別為45和57 μmol/L。Nongonierma等[22]將胰蛋白酶(Trypsin)水解駱駝奶,發(fā)現(xiàn)源自駱駝奶中的β-酪蛋白的LPVP和MPVQA小肽,對(duì)DPP-4的IC50值分別為(87.0±3.2) μmol/L和(93.3±8.0) μmol/L。

當(dāng)前通過(guò)微生物發(fā)酵制備DPP-4抑制劑的研究還處于起步階段。在DPP-4抑制劑體外篩選模型中的陽(yáng)性對(duì)照物Diprotin A,是來(lái)自蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)BMF673-RF1在以馬鈴薯淀粉為主要培養(yǎng)基經(jīng)發(fā)酵、分離和純化得到三肽(Ile-Pro-Ile)[23]。Sato等[24]從納豆中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)二肽,KL和LR均具有強(qiáng)烈的DPP-4抑制活性,其IC50值分別為(41.40±2.68) μg/mL和(598.02±18.35) μg/mL。此類(lèi)研究開(kāi)辟了通過(guò)微生物發(fā)酵,制備DPP-4抑制劑的新方法。但是,目前相關(guān)報(bào)道還相對(duì)較少,還需尋找新的菌株和發(fā)酵方法。

本研究從江南傳統(tǒng)酸豆角汁中分離并篩選出,具有強(qiáng)烈乳蛋白水解能力的菌株,并以脫脂乳為培養(yǎng)基,進(jìn)行具有抑制DPP-4活性菌株的篩選以及相關(guān)發(fā)酵特性的研究,以期為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)乳源性DPP-4抑制劑奠定理論基礎(chǔ)和技術(shù)指引。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

江南傳統(tǒng)酸豆角汁 共3份均來(lái)自江蘇蘇州地區(qū);瑞士乳桿菌(L.helveticus)BD3909 由光明乳業(yè)股份有限公司提供;干酪乳桿菌(L.casei)ATCC334和鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)ATCC53103 購(gòu)自美國(guó)ATCC公司;嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)NCFM、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)LB340和動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis)BL-04 均由美國(guó)杜邦公司提供;嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3 丹麥科-漢森公司提供;M17培養(yǎng)基 英國(guó)OXOID公司;MRS培養(yǎng)基 德國(guó)Merck公司;NB培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基和TYC培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;小麥麩皮(Wheat bran,WB) 陜西西安斯諾特生物技術(shù)有限公司;脫脂乳粉(skimmed milk,SKM) 新西蘭恒天然集團(tuán);DPP-4(EC3.4.14.5,from human recombinant,≥10 U/mg protein)、甘氨酰-脯氨酰-對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽(H-Gly-Pro-pNA·HCl)和Diprotin A 美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;KOD One PCR試劑盒 日本TOYOBO生物試劑公司;其他化學(xué)試劑 均是分析純,來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HVE-50型高壓滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司;GNP-9270型隔水恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;SG-402TX型超凈工作臺(tái) 美國(guó)BAKER公司;PB-100型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司;HZQ-X500C大型恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;65518型CELLSTAR 96孔微孔板 奧地利Greiner Bio-One公司;Pellicon超濾系統(tǒng)、Millipore-Q超純水儀 德國(guó)默克-密理博公司;Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Heraeus 公司;Micro 17R微量臺(tái)式離心機(jī)、11-500-108H型電爐 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;FreeZone凍干機(jī) 美國(guó)LABCONCO公司;Proflex 3x32梯度PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

1.2.1.1 分離培養(yǎng)基 稱取M17瓊脂培養(yǎng)基4.8 g溶解于100 mL蒸餾水中,121 ℃滅菌15 min,冷卻備用。

1.2.1.2 2%(W/V)脫脂乳(SKM)瓊脂平板 配制20 mL 10%(W/V)脫脂乳,再取1.4 g瓊脂粉溶于80 mL水中,分別于115 ℃滅菌15 min后,在65 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min,兩者混勻后,倒入無(wú)菌平板中,配成2%(W/V)SKM瓊脂平板。

1.2.1.3 LB液體培養(yǎng)基 分別稱取10 g胰蛋白胨、5 g酵母抽提物和10 g NaCl,溶解于1 L去離子水中,121 ℃滅菌15 min,冷卻備用。

1.2.2 菌株分離和純化 采用逐級(jí)稀釋法將江南傳統(tǒng)酸豆角汁,用無(wú)菌生理鹽水稀釋至原濃度10-4,分別取原液以及各級(jí)稀釋液(10-1、10-2、10-3和10-4)0.1 mL均勻涂布于M17瓊脂培養(yǎng)基上,于37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d后,觀察并挑取菌落形態(tài)(形狀、大小和色澤等)有顯著差異的單菌落,并劃線于2%(W/V)SKM固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d進(jìn)行二次純化后,置于4 ℃冰箱中,予以備用。

1.2.3 發(fā)酵種子液的制備 挑取1.2.2中在2%(W/V)SKM固體培養(yǎng)基上,有明顯蛋白水解圈的單菌落,共計(jì)11株,接種于10 mL 10%(W/V)SKM液體培養(yǎng)基中,于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,10000×g離心15 min,取沉淀(菌餅),以相同體積的無(wú)菌蒸餾水反復(fù)洗滌三次后重懸,即得發(fā)酵種子液,予以備用。

1.2.4 具有DPP-4抑制活性菌株的篩選 將這11株菌的發(fā)酵種子液以2%(V/V)接種量,接種于10%(W/V)SKM液體培養(yǎng)基中(裝量為100 mL/250 mL錐形瓶),37 ℃靜置培養(yǎng)48 h,得發(fā)酵乳。再將各個(gè)株菌的發(fā)酵乳,分別置于沸水浴中加熱10 min滅活菌體,10000×g離心15 min,棄沉淀,得上清液。上清液用5.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0,再次10000×g離心15 min,取上清,并冷凍保存,用于DPP-4抑制活性測(cè)定。

1.2.5 菌株鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)分析 純化后的菌株BD3736在2%(W/V)SKM固體培養(yǎng)基平板上,在30 ℃好氧培養(yǎng)4 d后觀察菌落形態(tài)和色澤。通過(guò)革蘭氏染色法對(duì)菌體染色,在光學(xué)顯微鏡(10×100)下觀察,并根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[25]進(jìn)行鑒定。

1.2.5.2 生理生化特征分析 通過(guò)Biology微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)與化學(xué)敏感實(shí)驗(yàn)[26];部分生理生化鑒定參見(jiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[27]。

1.2.5.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 菌株接種至LB液體培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后,采用細(xì)菌DNA提取試劑盒,抽提菌株BD3736的DNA。采用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物:27F(5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′),擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1500 bp。PCR反應(yīng)體系為20 μL:Buffer 2.0 μL,dNTPs 1.6 μL,EXTaq酶0.2 μL,引物各0.5 μL(濃度10 μmol/Lol/L),模板50 ng。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性1.5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃充分延伸5 min,10 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后,移取10.0 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.0%(W/V)瓊脂糖凝膠,90 V電壓,30 min電泳后,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物(上海)有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST分析,利用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[28]。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果,最終確定菌株BD3736的種屬關(guān)系。

1.2.6P.polymyxaBD3736的發(fā)酵特性

1.2.6.1 不同乳酸菌的發(fā)酵乳對(duì)DPP-4的抑制活性 取不同乳酸菌的凍干粉少量,分別劃線于對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基上(BD3909、ATCC334、NCFM和LB34于MRS培養(yǎng)基,ST-BODY-3于M17培養(yǎng)基,BL-04于TPY培養(yǎng)基),以37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d形成菌落,隨后參照“1.2.3”和“1.2.4”方法制備各個(gè)乳酸菌的種子液和發(fā)酵乳,測(cè)定不同乳酸菌的發(fā)酵乳上清對(duì)DPP-4的抑制率(n=3)。

1.2.6.2P.polymyxaBD3736在不同培養(yǎng)介質(zhì)中對(duì)DPP-4的抑制活性P.polymyxaBD3736種子液按2%(V/V)接種量,分別接種于MRS、M17、TYC、NB、TPY、4%(W/V)小麥麩皮(WB)和10%(W/V)SKM的液體培養(yǎng)基中,(裝量為100 mL/250 mL錐形瓶),37 ℃靜置培養(yǎng)2 d后,發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)定各個(gè)P.polymyxaBD3736發(fā)酵液對(duì)DPP-4的抑制率(n=3)。

1.2.6.3 不同發(fā)酵條件對(duì)P.polymyxaBD3736產(chǎn)DPP-4抑制活性影響 先將P.polymyxaBD3736種子液按2%(V/V)接種量,接種于10%(W/V)SKM液體培養(yǎng)基中,分別置于30 和37 ℃條件下,進(jìn)行厭氧(靜置)和好氧(180 r/min搖床振蕩)培養(yǎng)2 d得發(fā)酵乳,發(fā)酵結(jié)束后,比較各個(gè)樣品對(duì)DPP-4的抑制率和IC50值(n=3)。

1.2.6.4P.polymyxaBD3736在SKM培養(yǎng)基中pH和活菌數(shù)的變化 將P.polymyxaBD3736發(fā)酵種子液以2%(V/V)接種量,接種于10%(W/V)SKM液體培養(yǎng)基中(裝量為100 mL/250 mL錐形瓶),30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng),于0、3、6、9、12、24和36 h取樣,分別測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵體系的pH和活菌數(shù)(n=3)。

1.2.7 DPP-4抑制活性及IC50值測(cè)定 DPP-4抑制活性的測(cè)定參考Li-Chan等[9]試驗(yàn)方法,并稍作修改。用0.1 mol/L的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸緩沖液(Tris-HCl Buffer,pH=8.0,)溶解或稀釋待測(cè)樣品,并取25 μL待測(cè)樣品于96孔微孔板中,加入25 μL 1.6 mmol/L H-Gly-Pro-pNA·HCl溶液(0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液為溶劑),混勻,37 ℃孵育15 min,再加入50 μL 5 U/L DPP-4溶液(0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液為溶劑),混勻,37 ℃反應(yīng)60 min,最后加入100 μL 1.0 mol/L 醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH=4.0)終止反應(yīng)。通過(guò)酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下,測(cè)定吸光度值(A)。同時(shí),為了避免SKM自身對(duì)DPP-4活性的影響,而導(dǎo)致假陽(yáng)性產(chǎn)生。本研究以SKM溶液作為陰性對(duì)照,其制備方法如下:用乳酸將已滅菌的10%(W/V)SKM液體培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)至待測(cè)發(fā)酵樣品相同pH,水浴煮沸10 min,10000×g離心15 min后取上清,以5.0 mol/L NaOH回調(diào)pH至8.0,再次10000×g離心15 min,取上清,即得陰性對(duì)照組。取三次平行試驗(yàn)的平均值,代入以下公式計(jì)算對(duì)DPP-4的抑制率(%),并以Diprotin A為陽(yáng)性對(duì)照。

式中,陰性對(duì)照:為空白脫脂乳替代待測(cè)樣品;陰性空白:為T(mén)ris-HCl緩沖液替代陰性對(duì)照組中的DPP-4溶液;樣品空白:為T(mén)ris-HCl緩沖液替代待測(cè)樣品組中的DPP-4溶液。

IC50值測(cè)定:通過(guò)倍半稀釋的方法將待測(cè)樣品進(jìn)行稀釋,獲得不同濃度的待測(cè)樣品組,利用上述測(cè)試方法,測(cè)定不同濃度的待測(cè)樣品對(duì)DPP-4的抑制率。根據(jù)待測(cè)樣品的濃度與DPP-4抑制率所構(gòu)成的線性關(guān)系,計(jì)算得出待測(cè)樣品對(duì)DPP-4的IC50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)至少重復(fù)3次,所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件處理。試驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 7.0軟件作圖,測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(Mean±SD)(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有DPP-4抑制活性菌株的篩選

利用逐級(jí)稀釋法從3份酸豆角汁中,通過(guò)M17固體培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng),共分離純化獲得59株菌株,其中11株菌在2%(W/V)SKM固體培養(yǎng)基上,有明顯乳蛋白水解能力(形成水解圈),并依次編號(hào)為BD3736、BD3738、BD3739、BD3740、BD3808、BD3809、BD3817、BD3818、BD3819、BD3842和BD3844。對(duì)這11株菌以10%(W/V)SKM為發(fā)酵培養(yǎng)基,所制備的發(fā)酵乳,進(jìn)行DPP-4抑制活性的測(cè)定。結(jié)果如圖1所示,發(fā)現(xiàn)菌株BD3736發(fā)酵48 h所得的發(fā)酵乳,對(duì)DPP-4具有強(qiáng)烈的抑制活性,其抑制率為66.4%±2.9%,顯著高于其他菌株,因此,菌株BD3736被選擇作為潛在具有抑制DPP-4活性的菌株來(lái)進(jìn)一步研究。

圖1 不同菌株的發(fā)酵乳對(duì)DPP-4的抑制活性Fig.1 Effect of skim milk fermented by different strains on DPP-4 inhibition activity注：對(duì)于同一測(cè)定指標(biāo)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05);圖5～圖8同。

2.2 菌株BD3736鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 從圖2(A)可知,菌株BD3736在2%(W/V)SKM固體培養(yǎng)基上,單菌落呈現(xiàn)圓形凸起,顏色為乳白色,有褶皺,直徑為4～6 mm,并具有明顯的粘稠特征。同時(shí),菌株BD3736具有很強(qiáng)的乳蛋白水解能力。從圖2(B)可知,菌株BD3736的微觀形態(tài)呈桿狀,革蘭氏染色為陽(yáng)性菌,菌株BD3736的芽孢大小為0.2～0.3 μm,見(jiàn)圖2(C)。

圖2 菌株BD3736的菌落形態(tài)(A)、革蘭氏染色(B)和芽孢狀態(tài)(C)Fig.2 The colony morphology(A),gram staining(B)and spore state(C)results of strain BD3736

2.2.2 生理生化特征 按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(第8版)對(duì)菌株BD3736進(jìn)行生理生化試驗(yàn),結(jié)果如表1所示。菌株BD3736的耐鹽性為5%,在10%含鹽培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng);在糖發(fā)酵反應(yīng)中,可以利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、甘露糖和半乳糖等多種碳源。厭氧生長(zhǎng),硝酸還原反應(yīng)和水解酪蛋白均為陽(yáng)性;檸檬酸鈉利用和H2S產(chǎn)生為陰性;并且能在10～45 ℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)。根據(jù)菌株BD3736的生化反應(yīng)及形態(tài)學(xué)特征,初步判斷其為類(lèi)芽孢桿菌屬或芽孢桿菌屬。

表1 菌株BD3736的生理生化特征Table 1 Physiology and biotechnical charateristics of BD3736

2.2.3 菌株BD3736基因序列分析結(jié)果 以16S rRNA基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在1000～2000 bp之間獲得一條特異性的擴(kuò)增條帶,且條帶清晰明亮(圖3)。該條帶經(jīng)切膠、純化等操作,測(cè)序得到16S rRNA基因長(zhǎng)度為1447 bp。通過(guò)16S rRNA的測(cè)序結(jié)果,與已公布的序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)菌株BD3736與類(lèi)芽孢桿菌屬的菌株處于同一大的分支(圖4),其中與多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)DSM 36聚類(lèi)在一起,進(jìn)化距離最近,相似度為99.72%。因此,結(jié)合形態(tài)、生理生化和16S rRNA基因分析,菌株BD3736鑒定結(jié)果為多粘類(lèi)芽孢桿菌,并命名為PaenibacilluspolymyxaBD3736。同時(shí),在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏,專(zhuān)利保藏號(hào)為CGMCC 10062。

圖3 菌株BD3736的16S rRNA基因Fig.3 Electrophoresis profile of 16S rRNA gene from strain BD3736 by PCR

圖4 菌株BD3736基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the strain BD3736 based on 16S rRNA sequences

2.3 P. polymyxa BD3736與其他乳酸菌的比較

由圖5可知,其他6株不同乳酸菌的發(fā)酵乳,對(duì)DPP-4的抑制率差異較大,大部分乳酸菌的抑制活力較低(抑制率<20%),其中只有L.caseinATCC334對(duì)DPP-4的抑制活性為27.6%±3.4%,而P.polymyxaBD3736發(fā)酵乳的抑制效果為最佳,顯著優(yōu)于其他乳酸菌(P<0.05)。P.polymyxaBD3736在以脫脂乳為培養(yǎng)介質(zhì),具有合成DPP-4抑制劑的特性尚未報(bào)道過(guò)。因此,P.polymyxaBD3736的研究值得進(jìn)一步深入開(kāi)展。

圖5 不同乳酸菌對(duì)DPP-4的抑制效果Fig.5 Inhibition activity of different lactic acid bacteria on DPP-4

2.4 P. polymyxa D3736在不同培養(yǎng)介質(zhì)中產(chǎn)DPP-4抑制活性

從圖6可知,P.polymyxaBD3736在以脫脂乳(SKM)為培養(yǎng)介質(zhì)時(shí),其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPP-4抑制效果最高,其次是以營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)為介質(zhì),抑制率為32.8%±2.5%。P.polymyxaBD3736在其他類(lèi)型的培養(yǎng)介質(zhì)中的發(fā)酵產(chǎn)物,對(duì)DPP-4的抑制率均<20%。P.polymyxaBD3736以脫脂乳為培養(yǎng)介質(zhì),利用自身較完整的蛋白水解酶體系,具有水解成多種生物學(xué)功能的乳源性小肽或多肽。

2.5 發(fā)酵條件對(duì)P. polymyxa BD3736的DPP-4抑制活性影響

如圖7所示,在30 ℃和37 ℃培養(yǎng)溫度與好氧或厭氧條件下,獲得四組發(fā)酵乳,其DPP-4的抑制率及IC50分別為:90.6%±2.6%和(14.2±2.0) mg/mL(30 ℃、好氧)、80.0%±2.5%和(18.9±2.1) mg/mL(37 ℃、好氧)、73.3%±2.9%和(23.1±1.3) mg/mL(30 ℃、厭氧)以及67.3%±3.0%和(27.1±2.3) mg/mL(37 ℃、厭氧)。在好氧條件下,P.polymyxaBD3736在培養(yǎng)溫度30 ℃下的發(fā)酵乳,其DPP-4的抑制活性高于37 ℃條件下的發(fā)酵乳,并且前者的IC50值也低于后者。在相同培養(yǎng)溫度下,來(lái)自搖床培養(yǎng)的發(fā)酵乳的DPP-4抑制活性,顯著高于靜置培養(yǎng)(P<0.05)。由此可見(jiàn),30 ℃培養(yǎng)溫度、好氧培養(yǎng)是P.polymyxaBD3736發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)DPP-4抑制劑的優(yōu)選條件,該條件與類(lèi)芽孢桿菌家族菌株的最適生長(zhǎng)條件一致[29]。因此,根據(jù)DPP-4抑制效果與菌體在SKM中生長(zhǎng)的正相關(guān)性,為后續(xù)P.polymyxaBD3736工業(yè)化制備DPP-4抑制劑奠定基礎(chǔ)。

圖7 發(fā)酵條件對(duì)P. polymyxa BD3736產(chǎn)DPP-4抑制劑的影響Fig.7 Effect of fermentation conditions on DPP-4 inhibitor by P. polymyxa BD3736

2.6 P. polymyxa BD3736在SKM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

由圖8可知,在發(fā)酵前期,P.polymyxaBD3736在脫脂乳中的生長(zhǎng)趨勢(shì)與保加利亞乳桿菌等乳酸菌類(lèi)似[30],呈典型的“S”型生長(zhǎng)曲線,尤其在6～9 h時(shí),菌體由于生境營(yíng)養(yǎng)充足,且活力旺盛的關(guān)系,導(dǎo)致增殖速率最快(活菌對(duì)數(shù)值8.08→8.79),直至12 h時(shí)達(dá)到活菌數(shù)峰值1.05×109CFU/mL,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),活菌總數(shù)開(kāi)始緩慢下滑至5.50×108CFU/mL(24 h),并一直保持至發(fā)酵終點(diǎn)(36 h)。

在pH變化方面,P.polymyxaBD3736發(fā)酵體系的pH呈現(xiàn)快速降低現(xiàn)象(pH6.40→5.64)，主要出現(xiàn)在發(fā)酵前12 h,繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間至36 h,其發(fā)酵終點(diǎn)pH為5.58,此時(shí)對(duì)DPP-4抑制活性為64.33%±6.6%,見(jiàn)圖8(B)。該現(xiàn)象的產(chǎn)生與常規(guī)乳酸菌完全不同,后者的發(fā)酵乳終點(diǎn)pH較低(5.0以下),主要由于乳酸的大量積累[31]。P.polymyxaBD3736發(fā)酵乳終點(diǎn)pH較高,除了少量乳酸的貢獻(xiàn)外,菌株自身分泌的多種乳蛋白水解酶將酪蛋白水解成偏酸性的小肽和氨基酸,也可能是影響pH的重要因素之一。因此有利于后續(xù)DPP-4抑制劑的工業(yè)化放大生產(chǎn)。

圖8 P. polymyxa BD3736在SKM液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.8 Growth of P. polymyxa BD3736in SKM liquid medium注:A:菌株BD3736的生長(zhǎng)曲線和pH變化;B:菌株BD3736對(duì)DPP-4的抑制活性。

3 結(jié)論

多粘類(lèi)芽孢桿菌屬于類(lèi)芽孢桿菌模式菌種,其被美國(guó)環(huán)保署(EPA)列為可在商業(yè)上應(yīng)用的微生物之一,我國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種。本研究從江南傳統(tǒng)酸豆角汁中,分離純化并鑒定出一株多粘類(lèi)芽孢桿菌BD3736,其具有強(qiáng)烈的乳蛋白水解能力,并以10%(W/V)SKM為培養(yǎng)基,在30 ℃、180 r/min條件下,培養(yǎng)2 d時(shí)的發(fā)酵乳,對(duì)DPP-4的抑制率為90.6%±2.6%,IC50值為(14.2±2.0) mg/mL。P.polymyxaBD3736在脫脂乳培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況也符合類(lèi)芽孢桿菌的生長(zhǎng)特性,但又不同于常見(jiàn)的酸奶菌株,無(wú)大量乳酸生成,為后續(xù)分離純化DPP-4抑制劑排除了諸多干擾。同時(shí),此研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型、副作用低的口服降糖藥物或功能性食品配料提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。