枸杞色素微乳液的理化穩(wěn)定性

張春蘭1,2,李 斌

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300; 2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室,新疆阿拉爾 843300; 3.華中農業(yè)大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科枸杞屬植物的成熟果實。枸杞是名貴的藥材和滋補品,具有養(yǎng)陰補血、滋補肝腎、益精明目的功效。枸杞色素是存在于枸杞漿果中各種呈色物質的總稱[1]。枸杞色素主要是由脂溶性色素構成,包括類胡蘿卜素及其類黃酮[2-3]。

國內外研究者們對枸杞多糖、生物堿、多肽、生育酚等的化學組成以及各成分的功效等都進行了研究。關于枸杞色素的研究主要集中在其檢測、提取、純化和穩(wěn)定性方面[4-5]。對枸杞色素功能方面的研究很少,孫高峰等發(fā)現枸杞色素具有一定延緩衰老的作用[6],而且枸杞色素在體外能清除自由基[7],大鼠葡萄膜炎也能被一定濃度的枸杞色素所抑制[8]。國內外對枸杞中的天然色素-類胡蘿卜素這一重要活性成分研究尚不夠深入,應用不夠廣泛,而類胡蘿卜素不溶于水且性質不穩(wěn)定[9],生物利用度低,可能是限制其廣泛應用的瓶頸。

生物活性成分穩(wěn)定性差,不易保存,目前采用乳液體系增溶、輸送、保護生物活性成分的研究已較為廣泛。枸杞色素屬于脂溶性色素,屬于生物活性成分,很難溶于水,而將枸杞色素溶解在油中,再添加乳化劑制備成乳液,可以提高枸杞色素在水中的溶解性,從而達到增溶的目的。因枸杞色素微乳液粒徑小,所以其能夠在澄清飲料等感官要求透明的食品中得到應用,但是成分較多較復雜的食品體系是否會影響枸杞色素微乳液的穩(wěn)定性尚未得知。因此本文研究食品環(huán)境因素(溫度、pH、加熱、離子強度、抗氧化劑和EDTA-2Na)對枸杞色素微乳液的粒徑大小和枸杞色素保留率等物理化學穩(wěn)定性的影響,將為微乳液在食品環(huán)境條件中的應用提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中鏈甘油三酸酯(MCT食品級) 武漢博星化學試劑公司;吐溫80、司盤80、乙醇、正己烷、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、抗壞血酸、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯、乙二胺四乙酸二鈉等均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

BSA124S-CW分析天平 德國Sartorius;85-2磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司;Nano-ZS納米粒度測定儀 英國Malvern公司;UV-1100紫外可見分光光度計 美普達有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;SC-3614低速離心機 安徽中科中佳科學儀器公司;Avanti J-E超速冷凍離心機 河南致達電子有限公司;TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微乳液的制備 枸杞皮渣經過清洗、浸泡,將枸杞皮和枸杞籽分離,枸杞皮真空干燥、粉碎后,用正己烷充分浸提其中的脂溶性色素,浸提液濃縮、冷凍干燥,即得枸杞色素油樹脂。根據Saberi的方法[10-11]采用自乳化法制備枸杞色素微乳液。首先,將枸杞色素油樹脂溶解在MCT中,使其含0.2%的類胡蘿卜素,含有色素的MCT作為油相,再將表面活性劑(吐溫80∶司盤80=8.5∶1.5 W/W)與油相按照質量比2∶1的比例混合,然后在室溫下逐滴地把30 g混合物加入到有磁力攪拌的70 g水相中,繼續(xù)在磁力攪拌器上攪拌15 min使其充分擴散后得到枸杞色素微乳液。

1.2.2 貯存溫度對微乳液穩(wěn)定性的影響 將制備好的微乳液以及對照樣品(將枸杞色素溶解在MCT中使其含總類胡蘿卜素0.02%)分別在4、25、37 ℃下避光貯存10 d,每兩天取樣測定微乳液中總類胡蘿卜素含量,計算色素保留率。

1.2.3 pH對微乳液穩(wěn)定性的影響 將制備好的微乳液用0.2 mol/L的HCl或NaOH分別調節(jié)成pH3.5、4.5、5.5、6.5、7.5在室溫避光處貯存,每兩天取樣測定色素的保留率。

1.2.4 加熱處理對微乳液穩(wěn)定性的影響 將微乳液放于密閉的小瓶內,并在水浴鍋中不同溫度20、40、60、80 ℃加熱30 min后,取出立即流水冷卻至室溫,測定色素的保留率并測定粒徑和粒徑分布。

1.2.5 NaCl濃度對微乳液穩(wěn)定性的影響 在微乳液中分別加入一定量的NaCl,使其終濃度為1%、2%、3%、4%、5%,以不加鹽離子的微乳液為空白,將各樣品放在55 ℃烘箱中,每天測定色素的保留率。

1.2.6 常用抗氧化劑和金屬螯合劑對微乳液穩(wěn)定性的影響 選取常用的水溶性抗氧化劑VC,脂溶性抗氧化劑丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG),以及金屬螯合劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na),參考GB2760-2014的要求將VC(0.2、0.5、1、2 g/kg)、EDTA-2Na(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g/kg)添加入制備好的微乳液中。BHA、BHT、PG以0.2 g/kg的濃度添加入MCT中,再制成微乳液,以不加添加劑的微乳液為空白對照,將各樣品放在55 ℃烘箱中,每天測定色素的保留率。

1.2.7 指標的測定

1.2.7.1 粒徑的測定 將微乳液用pH7.0的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋100倍后,采用Nano-ZS粒度儀測定微乳液粒徑。

1.2.7.2 總類胡蘿卜素含量及保留率的測定 稱取1.00 g的微乳液與2 mL正己烷∶乙醇(1∶1,V/V)混合、渦旋后在4000 r/min離心10 min。將溶解有類胡蘿卜素的上層正己烷層收集起來,下層溶液繼續(xù)與有機溶劑混合、離心,收集上層并與前面的正己烷層合并。相同的操作繼續(xù)同上,直到下層無色。以上層萃取溶劑正己烷為參照,收集的上層有機相在450 nm下測定吸光度A,總類胡蘿卜素的含量根據McBeth的公式計算[12-13]。

色素的保留率(%)=C/C0×100

式中,C為測定時微乳液或MCT中總類胡蘿卜素含量mg/100 g,C0為初始微乳液或MCT中總類胡蘿卜素含量mg/100 g。

1.2.7.3 濁度的測定 將制備好的pH為7的微乳液放在1 cm比色皿中,用雙光束分光光度計(帶有溫度控制裝置),在600 nm以蒸餾水為參比,從20～85 ℃以1 ℃/min的升溫速率對微乳液進行加熱,測定微乳液的透光率,根據計算公式:濁度=-LN(透光率/100),計算出微乳液濁度。

1.3 數據處理

每個試驗各值均為3個平行數據的均值,試驗數據采用Excel進行分析,采用Origin 8.0軟件進行科技作圖。

2 結果與分析

2.1 貯存溫度對微乳液穩(wěn)定性的影響

以溶有枸杞色素油樹脂的MCT為對照,研究了4、25及37 ℃三種貯藏溫度對枸杞色素微乳液穩(wěn)定性的影響。由圖1可以看出,隨著貯存時間的延長,枸杞色素的保留率逐漸減小。溫度越高,對枸杞色素微乳液穩(wěn)定性的影響越大,微乳液的色素保留率越低。在整個貯藏期內,4 ℃條件下貯存的枸杞色素其保留率下降緩慢,貯存10d后,保留率在80%以上。在4 ℃下貯藏的微乳液,其色素保留率高于在25 ℃及37 ℃下貯藏的微乳液,說明較高的貯存溫度會加速色素降解。

圖1 貯存溫度對微乳液穩(wěn)定性的影響Fig.1 Influence of storage temperature on the stability of microemulsions

對于微乳液體系來說,油滴的外層有一層乳化劑包裹,理論上應對油脂中的枸杞色素起到一定的保護作用,但從實驗結果看,乳化劑的存在并沒有延緩枸杞色素的氧化。這可能是因為:一方面,微乳液粒徑小,具有很大的比表面積,從而促進了油水界面上的化學降解反應[14]。同時該微乳液是較透明的,紫外光和可見光能透過微乳液,從而促進光敏降解反應。另一方面,乳液對生物活性成分的保護作用與其界面組成、界面厚度都有一定的關系,一般不同食品乳化劑形成的界面膜厚度為:小分子表面活性劑(如吐溫、司盤)<球蛋白(如乳清蛋白、大豆蛋白)<纖維蛋白(如酪蛋白、明膠)<多糖(如阿拉伯膠、變性淀粉)[15],本實驗采用的是小分子表面活性劑,因此形成的界面膜較薄。

2.2 pH對微乳液穩(wěn)定性的影響

各種食品體系都具有一定的酸堿性,大部分飲料偏酸性,因此對不同pH下微乳液中枸杞色素的穩(wěn)定性進行研究是十分有必要的。從圖2中可以看出,pH對微乳液體系中枸杞色素的穩(wěn)定性有一定的影響。枸杞色素微乳液體系在中性條件下,其色素保留率較高。在酸性條件下(pH≤5.5)隨著貯存時間的延長,枸杞色素的保留率急劇下降,微乳液由桔紅色變?yōu)榻鯚o色,在貯藏后期,保留率幾乎接近于0。以前的研究也表明,O/W微乳液中類胡蘿卜素(番茄紅素)在酸性條件下的降解速率更快[16]。進一步的研究發(fā)現,類胡蘿卜素在酸性條件下不穩(wěn)定的機制是:類胡蘿卜素的質子化,然后經歷順反異構化和降解反應[17-18]。

圖2 pH對微乳液穩(wěn)定性的影響Fig.2 Influence of pH on the stability of microemulsions

2.3 加熱處理對微乳液穩(wěn)定性的影響

溫度是導致天然色素不穩(wěn)定的主要因素。一般高溫加熱會使類胡蘿卜素異構化,使反式構型轉化成為生物利用率低的順式結構,還可能發(fā)生熱降解。同時,加熱處理可能也會造成微乳液粒徑增大,濁度增加。由圖3a可知,隨著加熱溫度的升高,微乳液及MCT中的色素含量均降低,說明加熱使樣品的色素發(fā)生了一定降解。80 ℃下加熱30 min,微乳液色素保留率約為86%,而MCT中的色素保留率約為83%,兩種體系的色素降解率基本一致。從整體看,相同溫度處理后,微乳液的色素保留率與MCT幾乎一致,可能是色素被較薄的界面膜所包裹,同時該界面膜也不能有效阻礙熱傳導,因此沒有對色素起到很好的保護作用。

由圖3b可以看出,微乳液經過不同溫度加熱后,粒徑逐漸增加,由初始的30 nm增加至120 nm左右,在60 ℃粒徑已增加至55 nm,微乳液體系由澄清透明轉變?yōu)闇啙釥顟B(tài),而且此過程不可逆。

圖3 加熱處理對微乳液穩(wěn)定性(a)、粒徑(b)和濁度(c)的影響Fig.3 Influence of heating temperature on the stability(a),droplets size(b)and turbidity(c)of microemulsions

由圖3c可以看出,在采用溫度掃描實驗測定濁度過程中,微乳液以1 ℃/min升溫時,微乳液的濁度也發(fā)生了明顯的變化。在70 ℃之前微乳液體系的濁度值低,微乳液較澄清,而當溫度高于70 ℃,微乳液的濁度迅速上升,在85 ℃濁度達到6.9 cm-1?？偟膩碚f,微乳液體系在溫度升高后,都會有粒徑增大、渾濁現象,而且該體系在溫度降低后不會恢復到澄清透明的狀態(tài)。Saberi等采用10%的吐溫80制備的微乳液也發(fā)生了相同的現象,溫度向相轉變溫度(PIT)升高時,乳滴的聚集速率通常會隨著溫度的升高而增加[19]。這是由于表面活性劑末端的脫水引起了最佳曲率和界面張力的改變[11]。同時,Saberi等在水相中加入40%甘油或者少量SDS均能抑制吐溫微乳液加熱時的渾濁現象。

2.4 NaCl對微乳液穩(wěn)定性的影響

由圖4可以看出,隨著時間的延長,微乳液中枸杞色素的保留率逐漸下降,經過6 d的加速氧化,其色素保留率接近0。微乳液體系中加入不同量的NaCl,對色素保留率影響不大。加鹽體系的色素保留率略高于不加鹽的體系,這可能是因為加鹽體系的滲透壓高,使體系中的溶解氧量減少,從而減少了枸杞色素的氧化。

圖4 鹽濃度對微乳液穩(wěn)定性的影響Fig.4 Influence of NaClconcentration on the stability of microemulsions

2.5 抗氧化劑和金屬螯合劑對微乳液穩(wěn)定性的影響

維生素C是一種水溶性維生素,水果和蔬菜中含量豐富,也常作為添加劑存在于各類食品中。從圖5a可以看出,微乳液體系中添加一定量的維生素C,可以對枸杞色素起到保護作用。當VC的濃度為2 g/kg時,經過6 d的加速氧化,體系中色素的保留率約為33%,而空白組的幾乎為0。由圖5a可以看出,VC的濃度越高,枸杞色素微乳液的色素保留率越高,這可能是因為VC本身極易氧化,能與體系中的氧發(fā)生反應,從而降低了體系的含氧量,阻止色素與氧發(fā)生反應。

BHA、BHT、PG是常用的油溶性抗氧化劑,由圖5b可以看出,在油相中添加一定量的脂溶性抗氧化劑,其微乳液體系的色素保留率顯著高于空白組的,在6 d加速氧化后,添加抗氧化劑的微乳液體系的色素保留率為73.8%～81%,而空白組的幾乎為0,說明脂溶性抗氧化劑能很好地維持微乳液體系的穩(wěn)定性。這主要是因為它們是自由基清除劑,能吸收氧化產生的自由基,阻斷自由基鏈式反應。

金屬離子的存在往往會促進油脂、色素等的氧化降解。EDTA-2Na是一種常用的金屬離子螯合劑,由圖5c可知,含EDTA-2Na的微乳液色素在經過6 d 55 ℃的氧化后,保留率為11%左右,高于空白組,但五個添加量的微乳液色素保留率差異不顯著,可能是當EDTA的濃度達到0.05 g/kg時即可把體系中存在的全部金屬離子螯合掉,因而再增大EDTA的濃度對微乳液的穩(wěn)定性影響不大。從實驗結果中可以得出,EDTA為0.05 g/kg時即可提高枸杞色素微乳液的化學穩(wěn)定性。

圖5 抗氧化劑(a)VC、(b)0.2 g/kg脂溶性抗氧化劑和(c)EDTA-2Na對微乳液穩(wěn)定性的影響Fig.5 Influence of antioxidants(a)VC,(b)fat-soluble antioxidants and(c)EDTA-2Na on the stability of microemulsions

3 結論

枸杞色素微乳液在4 ℃條件下貯存10 d后,枸杞色素保留率在80%以上。食品環(huán)境中的酸性條件對微乳液有影響,在酸性條件下經過10 d的貯存,色素保留率幾乎為0。微乳液經過不同溫度加熱后,粒徑逐漸增加,由初始的30 nm增加至120 nm左右,在60 ℃粒徑已增加至55 nm,微乳液體系由澄清透明轉變?yōu)闇啙釥顟B(tài),而且發(fā)現此過程不可逆。當溫度高于70 ℃,微乳液的濁度迅速上升,在85 ℃濁度達到6.9 cm-1。添加抗氧化劑可以明顯減緩微乳液中枸杞色素的降解,在6 d 55 ℃氧化后,添加脂溶性抗氧化劑的微乳液體系的色素保留率為73.8%～81%,添加VC的濃度為2 g/kg時,色素保留率約為33%。添加0.05 g/kg的EDTA可輕微提高枸杞色素微乳液的穩(wěn)定性。該研究為非離子型表面活性劑穩(wěn)定的微乳液在食品環(huán)境條件中的應用提供了可靠依據。