長(zhǎng)白落葉松3種黃酮化合物定性、定量分析及其抗氧化活性研究

周生學(xué)1,邵 瑩,鄭毅男

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院,吉林吉林 132101; 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

長(zhǎng)白落葉松(Larixolgensisvar.koreana)別名黃花松、黃花落葉松、朝鮮落葉松,為高大喬木[1-3]。主要分布于我國(guó)黑龍江、遼寧、吉林等地,另外朝鮮和俄羅斯也有少量分布[4]。文獻(xiàn)報(bào)道,長(zhǎng)白落葉松中有許多重要的生物學(xué)活性物質(zhì)[5-6],而自1966年從花旗松樹(shù)皮中提取出二氫槲皮素(Dihydroquercetin)[7]以來(lái),松樹(shù)中黃酮成分便成為研究熱點(diǎn)問(wèn)題,而多酚類也成為抗氧化活性的主要成分,捕集和清除氧自由基的能力較強(qiáng)[8-9],具有抗腫瘤[10-12]、抗病毒[13-14]、抗炎抗過(guò)敏、抗心血管[15]系統(tǒng)疾病等藥理作用[16]。黃酮類成分含有大量的酚羥基,是目前抗氧化劑主要的研究對(duì)象。近年來(lái)科研人員側(cè)重于對(duì)長(zhǎng)白落葉松中二氫槲皮素[16-18]提取、分離、純化工藝進(jìn)行研究,而對(duì)落葉松中含有的其它黃酮類化合物卻很少報(bào)道[16],只局限于總黃酮的提取[19]和槲皮素及二氫槲皮素活性研究[20]。本研究在探索二氫槲皮素新資源和新工藝的同時(shí),以長(zhǎng)白落葉松副產(chǎn)品鋸末子[21]為原料,首次對(duì)長(zhǎng)白落葉松中其他黃酮類化合物進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、含量分析及抗氧化活性測(cè)定,以尋找強(qiáng)抗氧化劑的新資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長(zhǎng)白落葉松鋸末子 2018年從中國(guó)吉林省臨江市收集獲得,由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)的鄭毅男教授鑒定為30年齡長(zhǎng)白落葉松根部干燥粉末;葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司;二氫槲皮素、香橙素、圣草酚 西格瑪-奧爾德里奇(上海)有限公司;乙醇、甲酸 分析級(jí),北京化學(xué)試劑公司;聚酰胺樹(shù)脂 廣州寶人化學(xué)試劑有限公司;2,2-二苯基-1-吡啶酰肼自由基(DPPH)、2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS) 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

SpectraMax iD5酶標(biāo)儀 美谷分子儀器公司(上海);N-1300D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化(日本);BSA6202S-CW電子天平 賽多利斯(德國(guó));HPLC-MS/MS LCMSD色譜儀 安捷倫(美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 長(zhǎng)白落葉松總黃酮的提取、分離和純化 長(zhǎng)白落葉松鋸末子(200 g)粉碎,80%甲醇(2000 mL)回流提取2 h,過(guò)濾,65 ℃干燥得提取物6.53 g。干燥提取物經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離,乙醇洗脫(2 mL/min)。按時(shí)間收集各分離組分,薄層色譜跟蹤鑒定,得含有黃酮類化合物組分,濃縮提取物經(jīng)聚酰胺樹(shù)脂純化[22],洗脫條件:水、50%乙醇依次洗脫。薄層色譜展開(kāi)劑為苯、丙酮和甲醇(8∶3∶0.5),依據(jù)分析結(jié)果合并洗脫液,濃縮,95 ℃水溶解、過(guò)濾,4 ℃冰箱中結(jié)晶。得2.3 g總黃酮化合物。

1.2.2 長(zhǎng)白落葉松黃酮類物質(zhì)的定性和定量分析

1.2.2.1 樣品預(yù)處理 將1.2.1得到的2.3 g黃酮化合物通過(guò)制備色譜柱COSMOSIL-C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×150 mm,5 μm)對(duì)樣品先進(jìn)行了部分成分去除和純化處理,流動(dòng)相為含有0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇溶液(B),梯度洗脫:0～2 min,35% B;2～12 min,35%～75% B;12～17 min,75%～95% B;17～23 min,95% B;23～25 min,95%～35% B;25～30 min,35% B。流速0.35 mL/min,溫度30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm,檢測(cè)時(shí)間20 min,進(jìn)樣量20 μL[23]。

1.2.2.2 樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精確稱量1.2.1得到的黃酮類提取物樣品和二氫槲皮素、香橙素、圣草酚標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,用甲醇∶水(4∶6)溶液定容于10 mL容量瓶中,得到樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 mg/mL),過(guò)0.22 μm微孔濾膜。

1.2.2.3 HPLC-MS/MS條件 色譜柱為Phenomenex Lunar(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動(dòng)相為含有0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇溶液(B),梯度洗脫:0～5 min,25% B;5～25 min,25%～70% B;25～27 min,70%～95% B;27～33 min,95% B;33～35 min,95%～25% B;35～40 min,25% B。流速0.35 mL/min,溫度30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm,檢測(cè)時(shí)間30 min,進(jìn)樣量10 μL[23]。

電噴霧離子源(ESI+),離子源溫度150 ℃,脫溶溫度為200 ℃,毛細(xì)管電壓2.65 kV,提取器電壓5500 V;氮?dú)饧兌取?9.99%;脫溶劑氣和錐孔氣流量分別設(shè)定為700 L/h 和50 L/h,質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1600。

1.2.2.4 定性和定量方法 外標(biāo)法測(cè)定長(zhǎng)白落葉松提取物中的黃酮類化合物含量。由于二氫槲皮素含量高,其吸收峰強(qiáng)度高,影響微量化合物的檢測(cè)分析。因此對(duì)該化合物進(jìn)行了制備色譜柱分離和部分去除,然后對(duì)分離得到的黃酮化合物進(jìn)行相關(guān)的分析,色譜柱為COSMOSIL-C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×150 mm,5 μm),洗脫條件與1.2.2.3條件相同,計(jì)算二氫槲皮素、香橙素、圣草酚含量。

1.2.3 長(zhǎng)白落葉松黃酮提取物抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 精稱128 mg DPPH定容于50 mL無(wú)水乙醇,取該溶液10 mL,50 mL無(wú)水乙醇稀釋,終濃度為1.3×10-4mol/L,取落葉松黃酮提取物、二氫槲皮素、香橙素、圣草酚和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)待測(cè)樣品(80 μL)與DPPH溶液(80 μL)等體積混合,37 ℃避光反應(yīng)30 min,517 nm測(cè)吸光度(AS),無(wú)水乙醇為空白;待測(cè)樣品(80 μL)與70%乙醇溶液(80 μL)混合,測(cè)吸光度(A1);DPPH溶液(80 μL)和70%乙醇(80 μL)測(cè)吸光度(A0),根據(jù)公式計(jì)算清除率,BHT為陽(yáng)性對(duì)照(公式1)[24]。實(shí)現(xiàn)50%清除率(scavenging capacity,%)所需的有效濃度記為IC50值。

式(1)

1.2.3.2 ABTS自由基清除能力測(cè)定 取86 μL過(guò)硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)與5 μL ABTS溶液(7 mmol/L)混合,避光、室溫放置12～16 h,用70%乙醇稀釋,734 nm處測(cè)定吸光度為0.70±0.02。待測(cè)樣品50 μL與200 μL ABTS稀釋后溶液混合,734 nm測(cè)吸光度(As),ABTS稀釋后液體(200 μL)與70%乙醇(50 μL)混合[25],測(cè)定其吸光度為A0,根據(jù)公式2計(jì)算清除率SC。BHT為陽(yáng)性對(duì)照，IC50按前面1.2.3.1所述計(jì)算。

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并使用單因素方差分析驗(yàn)證顯著性,P<0.01作為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果和討論

2.1 長(zhǎng)白落葉松黃酮類提取物HPLC-MS/MS鑒定結(jié)果

經(jīng)HPLC-MS/MS分析,總提取物HPLC 圖(1A)和提取物的離子色譜圖(1B),具體信息見(jiàn)表1,長(zhǎng)白落葉松提取物中主要含有3個(gè)黃酮類化合物,圖1A中1、2、3化合物的出峰時(shí)間與二氫槲皮素、香橙素、圣草酚標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間相同,進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜分析,確定這些化合物的結(jié)構(gòu)。

圖1 長(zhǎng)白落葉松提取物的HPLC-MS/MS譜圖Fig.1 HPLC-MS/MS spectra of the L. olgensis var. koreana extract注:A:總提取物HPLC圖;B:提取峰的離子色譜圖;C～E:化合物1～3的質(zhì)譜圖。

表1 長(zhǎng)白落葉松提取物的成分質(zhì)譜信息Table 1 Composition and mass spectrometry information of extracts of L. olgensis var. koreana

化合物1(圖1C)在m/z 305.5284[M+H]+處出現(xiàn)分子離子峰,在m/z 287.0546[M+H-H2O]+、259.0596[M+H-H2O-CO]+、195.0284[M+H-C6H6O2]+和153.0178[M+H-C6H6O2-C2H2O]+處觀察到離子碎片,再對(duì)比相關(guān)文獻(xiàn),與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的二氫槲皮素對(duì)應(yīng)的三個(gè)主要離子峰吻合,確定該化合物為二氫槲皮素(C15H13O7,m/z 305.0661[M+H]+;C15H16NO7,m/z 322.0927[M+NH3+H]+;C15H12NaO7,m/z 327.0481[M+Na]+)。

化合物2(圖1D)的分子離子峰是m/z 289.0696[M+H]+,同時(shí)伴隨一個(gè)額外的離子峰m/z 271.0597[M+H-H2O]+,離子片段峰為m/z 195.0284[M+H-C6H6O]+和153.0178[M+H-C6H6O-C2H2O]+。其分子量和離子碎片峰與文獻(xiàn)[27]吻合,對(duì)比后確定該化合物為香橙素(C15H13O6,m/z 289.0707[M+H]+;C15H12NaO6,m/z 311.0526[M+Na]+)。

化合物3與化合物2的分子量相同。化合物3(圖1E)的分子離子峰是m/z 289.0678[M+H]+,然而在m/z 271.0596[M+H-H2O]+、163.0385[M+H-C6H6O3]+有兩個(gè)離子峰碎片,同時(shí)還有兩個(gè)特征峰碎片m/z 179.0335[M+H-C6H6O2]+和153.0178[M+H-C6H6O2-C2H2]+,針對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道[27],該兩個(gè)離子碎片峰為圣草酚的特征峰,由以上數(shù)據(jù)確定該化合物為圣草酚。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

通過(guò)線性、回收率、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的有效性。

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限、定量限 按照1.2.2.2處理,得到質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照1.2.2.3色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè),以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度X對(duì)定量離子的峰面積Y繪制各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在溶液濃度在0.05～1.00 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,R2均不低于0.9986,詳見(jiàn)表2。信噪比S/N=3計(jì)算檢出限(LOD)為0.003 mg/kg,S/N=10計(jì)算定量限均為0.005 mg/kg。

表2 線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients

2.2.2 回收實(shí)驗(yàn) 陰性樣品分別添加低、中、高濃度黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.8、1.0、1.2 μg/mL),測(cè)定3種化合物含量,平行3次,計(jì)算回收率。每個(gè)水平單獨(dú)測(cè)定6次,結(jié)果見(jiàn)表3,二氫槲皮素回收率為98.9%～99.6%,香橙素回收率為99.5%～100.2%,圣草酚為99.4%～99.9%。

表3 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and relative standard deviation(n=6)

2.2.3 精確度和重復(fù)性 通過(guò)對(duì)3種分析物標(biāo)準(zhǔn)品的3種不同濃度(0.8、1.0、1.2 μg/mL)進(jìn)行日內(nèi)測(cè)試,進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的精密度。標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2.11%(表4),表明本實(shí)驗(yàn)方法精確度和準(zhǔn)確度在可接受范圍內(nèi)?；煊袠?biāo)準(zhǔn)品的溶液進(jìn)行日內(nèi)測(cè)試,每天5次,分別測(cè)試3 d(相隔天數(shù)分別為1、3、5 d)。確定的日內(nèi)精確度的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.29%～1.51%(表4)。結(jié)果顯示,3個(gè)不同日期測(cè)試重復(fù)性,得出日間測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)高于其日內(nèi)偏差,但是考慮分析物濃度為10～100 mg/L,其濃度較低,標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)處于1.73%～2.90%之間,仍然在可接受的精確度范圍之內(nèi)。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 對(duì)二氫槲皮素、香橙素和圣草酚(1 mg/mL)進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。在0、1、4、8、16、24 h注射相同的樣品溶液,計(jì)算色譜峰面積偏差(RSD),驗(yàn)證黃酮類化合物穩(wěn)定性。標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.60%～1.93%(表4),表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 精確度、重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果(n=6)Table 4 Results of accuracy,repeatability and stability(n=6)

2.3 長(zhǎng)白落葉松黃酮化合物含量測(cè)定

考慮長(zhǎng)白落葉松中二氫槲皮素含量高,峰面積大,影響含量低的化合含量測(cè)定,所以對(duì)部分二氫槲皮素進(jìn)行制備和去除,用外標(biāo)法對(duì)長(zhǎng)白落葉松中部分去除后分離制備得到的黃酮化合物進(jìn)行含量測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖見(jiàn)圖2，得出長(zhǎng)白落葉松黃酮提取物中二氫槲皮素含量最多(92.07%),香橙素為2.39%,而圣草酚含量最少,為0.19%,確定長(zhǎng)白落葉松中主要含有這3種黃酮類化合物。

圖2 長(zhǎng)白落葉松提取物、二氫槲皮素、香橙素和圣草酚標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the L.olgensis var. koreana extraction and taxifolin,aromadendrin and eriodictyol standards注:A:長(zhǎng)白落葉松提取物HPLC圖;B:二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品;C:香橙素標(biāo)準(zhǔn)品;D:圣草酚標(biāo)準(zhǔn)品;峰1、2、3分別為二氫槲皮素、香橙素、圣草酚。

2.4 長(zhǎng)白落葉松黃酮提取物的抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH是最常用的抗氧化活性篩選方法,本實(shí)驗(yàn)以清除自由基與DPPH的結(jié)合能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果顯示(圖3),提取物清除自由基的能力高于2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT),而二氫槲皮素清除自由基的能力分兩個(gè)階段,低濃度(0.001～0.01 mg/mL)時(shí)清除率比BHT低,高濃度時(shí)(0.05～0.20 mg/mL)清除自由基能力比BHT高,在高濃度(0.2 mg/mL)時(shí)落葉松黃酮提取物與二氫槲皮素的清除率分別達(dá)到92.21%和93.45%,與BHT差異極顯著(P<0.01)。而香橙素和圣草酚清除自由基能力較弱,均低于50%以下,圣草酚的抗氧化能力比香橙素略強(qiáng)。落葉松提取物在低濃度時(shí)抗氧化活性高于二氫槲皮素和BHT,高濃度時(shí)與二氫槲皮素相似,其原因可能是落葉松中三種黃酮類化合物協(xié)同作用,導(dǎo)致低濃度時(shí)提取物抗氧化活性較強(qiáng),而高濃度時(shí)主要體現(xiàn)為二氫槲皮素活性。落葉松提取物、二氫槲皮素與BHT對(duì)DPPH的IC50值分別為0.0026±0.0004、0.0084±0.0007和0.0247±0.0025 mg/mL。而香橙素和圣草酚IC50分別為0.6315±0.0053和0.3371±0.0036 mg/mL。結(jié)果表明,落葉松黃酮提取物和二氫槲皮素均有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖3 長(zhǎng)白落葉松黃酮提取物、二輕槲皮素、香橙素、圣草酚和BHT清除DPPH的能力Fig.3 Scavenging DPPH free radical ability ofL. olgensis var. koreana flavonoids extract,taxifolin,aromadendrin,eriodictyol standard and BHT

2.4.2 ABTS自由基清除能力 長(zhǎng)白落葉松提取物和BHT清除自由基與ABTS結(jié)合能力趨勢(shì)相同(圖4),均表現(xiàn)極強(qiáng)的抗氧化能力,而落葉松提取物活性高于BHT,在濃度為0.05 mg/mL時(shí),清除率均達(dá)到91.43%以上,二氫槲皮素清除率在0.1 mg/mL時(shí)清除率為50.21%,濃度升高到0.2 mg/mL清除率卻升高到93.45%,香橙素和圣草酚抗氧化活性一直不是很高,均在50%以下。落葉松提取物、二氫槲皮素和BHT的IC50值分別為0.0083±0.0002、0.0178±0.0004和0.0104±0.0006 mg/mL，香橙素和圣草酚IC50分別為0.6652±0.0034、0.4207±0.0026 mg/mL。表明落葉松黃酮提取物清除ABTS自由基能力強(qiáng)于BHT,在0.2 mg/mL二氫槲皮素表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖4 長(zhǎng)白落葉松黃酮提取物、二輕槲皮素、香橙素、圣草酚和BHT清除ABTS自由基能力Fig.4 Scavenging ABTS free radical ability ofL. olgensis var. koreana flavonoids extract,taxifolin,aromadendrin,eriodictyol standard and BHT

化合物的抗氧化活性與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)[28],多酚類物質(zhì)具有抗氧化降血壓、抗腫瘤等多種健康功能[29],酚羥基的數(shù)量和位置是黃酮類化合物表現(xiàn)抗氧化活性的重要影響因素。隨著類黃酮酚羥基數(shù)量增加,其抗氧化能力隨之增加。同時(shí),鄰位酚羥基比間位酚羥基類黃酮抗氧化活性更強(qiáng),原因是鄰位酚羥基容易形成半醌型自由基[30]。二氫槲皮素是長(zhǎng)白落葉松中主要化合物,其結(jié)構(gòu)中有五個(gè)酚羥基[31],這應(yīng)該是該提取物的強(qiáng)效抗氧化作用的原因(圖5)。

圖5 長(zhǎng)白落葉松黃酮提取物中黃酮類化合物結(jié)構(gòu)Fig.5 Structures of flavonoids identified in the flavonoids extract of L. olgensis var. koreana

3 結(jié)論

結(jié)果表明,長(zhǎng)白落葉松提取物中含有三種黃酮類化合物,分別為二氫槲皮素(92.07%)、香橙素(2.39%)和圣草酚(0.19%)。在抗氧化活性檢測(cè)中,長(zhǎng)白落葉松黃酮提取物和二氫槲皮素均表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化活性,清除DPPH自由基能力二者分別達(dá)到92.21%和93.45%(0.2 mg/mL),超過(guò)BHT;清除ABTS自由基能力方面,落葉松黃酮提取物表現(xiàn)極強(qiáng)的活性,在濃度為0.05 mg/mL時(shí)達(dá)到91.43%,二氫槲皮素在濃度為0.2 mg/mL時(shí)清除率升高到93.45%。表明長(zhǎng)白落葉松黃酮提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,是天然的強(qiáng)抗氧化劑。