不同發(fā)酵工藝糙米酵素中游離氨基酸、γ氨基丁酸及揮發(fā)性香氣成分分析

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(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000; 2.衡水學(xué)院生命科學(xué)系,河北衡水 053000)

糙米(Brown rice)是指除了外殼之外都保留的全谷粒,其營養(yǎng)及保健價(jià)值均大于精白米[1],但由于其口感較粗,蒸煮耗時(shí),不符合現(xiàn)代人飲食習(xí)慣,加工成精白米會(huì)造成人類食物資源浪費(fèi)10%～20%[2]。糙米酵素是在糙米中加入蜂蜜、麥芽等,采用酵母等發(fā)酵而成的功能性食品基料。微生物通過本身的中間代謝,使底物產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)變化,不僅改善了口感[3],而且在保留原有營養(yǎng)的基礎(chǔ)上又通過微生物代謝產(chǎn)生了很多生理活性物質(zhì)諸如γ-谷維醇[4-6]、γ-氨基丁酸(GABA)和谷胱甘肽(GSH)等[7]。其中游離氨基酸可起到影響食品風(fēng)味的作用[8],而GABA是糙米及其發(fā)酵產(chǎn)品中含量豐富的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[9],具有降血壓、抗驚厥、改善腦機(jī)能和調(diào)節(jié)睡眠的作用[10]。

關(guān)于糙米酵素的研究，國外起步較早,日本和美國已有眾多相關(guān)文獻(xiàn)。而中國近年才有糙米酵素的研究報(bào)道,且較多集中于配方及工藝的探討,對其營養(yǎng)價(jià)值諸如游離氨基酸和GABA,尤其對于不同發(fā)酵工藝下的探討甚少[2],部分學(xué)者雖然對氨基酸或GABA相對含量作出了分析[11],但鑒于配方有別,或工藝未經(jīng)糖化及巴氏殺菌,只集中探討了單菌酵母發(fā)酵,并未對不同發(fā)酵工藝下游離氨基酸和GABA含量作綜合探討[12];且并未有學(xué)者對糙米酵素本身的揮發(fā)性香氣成分作出過分析。

因此,本文集中探討了在增加糖化及滅菌工藝,采用釀酒酵母與植物乳桿菌混菌發(fā)酵[13]后,分別以發(fā)酵液總體抗氧化(T-AOC)、還原糖消耗量、總超氧化物歧化酶(SOD)及GSH含量為指標(biāo)得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝與優(yōu)化前、傳統(tǒng)酵母單菌發(fā)酵及未發(fā)酵原料作對比,采用氨基酸自動(dòng)分析儀對以上7種樣品的游離氨基酸及GABA的含量進(jìn)行測定,并采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù),檢測優(yōu)化后、優(yōu)化前及單菌發(fā)酵的揮發(fā)性香氣成分,從而確定混菌發(fā)酵對營養(yǎng)價(jià)值水平及風(fēng)味的影響,研究發(fā)酵工藝優(yōu)化的結(jié)果,為更好地利用和開發(fā)糙米酵素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母 安琪酵母股份有限公司;植物乳桿菌L42本實(shí)驗(yàn)室篩選及保藏[14];蜂蜜 桂林周氏順發(fā)食品有限公司;糙米 黑龍江鶴崗市五谷農(nóng)家養(yǎng)生坊;大麥芽、小麥芽 煙臺(tái)市帝伯仕啤酒技術(shù)有限公司;γ-氨基丁酸 色譜純(純度:99.9%),上海源葉生物科技有限公司;5-磺基水楊酸 分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;3-辛醇 西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;NaCl、(NH4)2SO4分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠。

Z80目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩 浙江上虞市華豐五金儀器有限公司;LY20-A型水浴恒溫振蕩器 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;LD5-2A型低速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;FA2204B型電子天平 上海天美天平儀器有限公司;101-1AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;1-15PK型高速離心機(jī) 德國西格瑪公司;L8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司;DVB/CAR/PDMS型固相纖維萃取頭 美國Supelco色譜科公司;7890B-5977A型Agilent氣質(zhì)聯(lián)用儀(7890B型色譜儀配5977A型質(zhì)譜檢測器) 美國安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

1.2.1.1 工藝流程 糙米發(fā)芽處理[15-16]→干燥→粉碎過篩→調(diào)配→糖化液化[17-19]→冷卻→離心取上清→調(diào)配→巴氏殺菌[20]→冷卻→不同工藝參數(shù)下接種發(fā)酵→巴氏殺菌→糙米酵素。

1.2.1.2 操作要點(diǎn) 糙米于37 ℃溫水中浸泡1～2 d,每6 h換一次水,使芽體長度為1～2 mm;將發(fā)芽糙米瀝干放入鼓風(fēng)干燥箱中,50 ℃干燥4～5 h;冷卻后使用食品粉碎機(jī)把烘干的糙米粉碎,并過80目篩備用;按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基:糙米粉10.710 g/100 mL、NaCl為0.240 g/100 mL、小麥芽0.250 g/100 mL、大麥芽0.500 g/100 mL、(NH4)2SO4為0.500 g/100 mL、茶葉粉0.025 g/100 mL[21];發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行糖化液化,升溫程序?yàn)?37 ℃保溫10 min;52 ℃保溫40 min;65 ℃保溫1 h;78 ℃保溫10 min[21];培養(yǎng)基冷卻后離心(4360×g、15 min)取上清,添加蜂蜜3.38 g/100 mL進(jìn)行調(diào)配,然后巴氏殺菌;滅菌后的培養(yǎng)基接入釀酒酵母、植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2 不同發(fā)酵工藝發(fā)酵糙米酵素 以發(fā)酵液總抗氧化能力(T-AOC)為指標(biāo)得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間12 h,接種量7%(釀酒酵母與植物乳桿菌體積比為1∶1;釀酒酵母約為1.71×107CFU/mL,植物乳桿菌約為2.15×108CFU/mL),發(fā)酵溫度34 ℃,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min;以還原糖消耗量為指標(biāo)得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間12 h,接種量7%,發(fā)酵溫度37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min;以總超氧化物歧化酶(SOD)為指標(biāo)得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間12 h,接種量7%,發(fā)酵溫度37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速120 r/min;以還原型谷胱甘肽(GSH)含量為指標(biāo)得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間12 h,接種量7%,發(fā)酵溫度34 ℃,搖床轉(zhuǎn)速120 r/min。按順序?qū)-AOC最優(yōu)組、還原糖消耗最優(yōu)組、SOD最優(yōu)組、GSH最優(yōu)組、未優(yōu)化組(釀酒酵母發(fā)酵與植物乳桿菌體積比1∶1混菌發(fā)酵,接種量7%,發(fā)酵時(shí)間10 h,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,溫度34 ℃)、單菌發(fā)酵組(釀酒酵母發(fā)酵,接種量7%,發(fā)酵時(shí)間10 h,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,溫度34 ℃)和未發(fā)酵組編號1～7[21]。按照不同發(fā)酵工藝發(fā)酵,得到糙米酵素發(fā)酵液。

1.2.3 酵母酵素游離氨基酸及γ-氨基丁酸含量的測定

1.2.3.1γ-氨基丁酸待測液的制備 取適量糙米酵素液經(jīng)過離心(2140×g,15 min)后取上清,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶加純凈水定容,取1 mL與8%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的5-磺基水楊酸3 mL混合均勻,高速離心(12000 r/min,10 min),取上清液過0.22 μm濾膜后待測[22]。

1.2.3.2 游離氨基酸待測液的制備 取適量糙米酵素液加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液,放入105 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱水解24 h,取出冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶,去離子水定容。過濾后取1 mL濾液置于60 ℃水浴脫酸,然后加1 mL去離子水蒸干得到干燥固體,然后將得到的干燥固體用0.02 mol/L稀鹽酸洗至5 mL容量瓶,過0.22 μm濾膜后待測[22]。

1.2.3.3 氨基酸分析儀色譜條件 色譜柱:標(biāo)準(zhǔn)分析陽離子型交換樹脂(4.6 mm×60 mm);進(jìn)樣量20 μL;輸液泵壓力0～20 MPa;檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液[12]流速0.45 mL/min;茚三酮反應(yīng)液[12]流速0.35 mL/min;分離柱柱溫57 ℃,反應(yīng)柱柱溫136 ℃;通道1:檢測波長570 nm檢測除脯氨酸外其他氨基酸;通道2:檢測波長440 nm檢測脯氨酸。

1.2.3.4 定性及定量 在上述氨基酸分析儀色譜條件下,17種氨基酸和γ-氨基丁酸達(dá)到明顯的基線分離,并得出各種氨基酸的保留時(shí)間,按照峰面積歸一化法計(jì)算出各氨基酸的相對含量。

1.2.4 糙米酵素?fù)]發(fā)性香氣成分的測定

1.2.4.1 揮發(fā)性香氣成分的提取 采用纖維針式固相微萃取[23],取上述不同發(fā)酵工藝的糙米酵素液各7.5 mL,置于規(guī)格20 mL的頂空瓶中,分別加入1 g無水氯化鈉和200 μL含量為0.25‰的內(nèi)標(biāo)物3-辛醇,在45 ℃恒溫水浴下平衡10 min,插入活化萃取針進(jìn)行頂空固相微萃取,萃取時(shí)間40 min[24]。

1.2.4.2 GC條件 色譜柱:HP-INNO Wax(60 m×250 μm×0.25 μm);固相微萃取纖維針:50/30 μm;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;檢測器溫度:230 ℃;載氣:氦氣;流量1 mL/min;升溫程序:50 ℃保持2 min,然后以3 ℃/min升溫至80 ℃,再以5 ℃/min升溫至230 ℃,保持6 min[25]。

1.2.4.3 MS條件 電離源:EI;電子能量:70 eV;掃描范圍:35.0～500.0 amu。

1.2.5 定性及定量 在上述GC-MS條件下,通過氣質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)對3種不同發(fā)酵條件下的糙米酵素香氣成分進(jìn)行檢測分析,取譜庫(NIST14)中匹配度大于80%的物質(zhì)進(jìn)行定性分析;以1.2.4.1固相微萃取的內(nèi)標(biāo)物含量為參考,按照峰面積歸一化法對香氣成分進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸的含量與分析

游離氨基酸混標(biāo)圖譜如圖1所示,圖2為第3組游離氨基酸的測定圖譜,1～7組游離氨基酸的測定結(jié)果見表1所示。

表1 1～7組發(fā)酵液中游離氨基酸的含量(mg/mL)Table 1 Free amino acid contents in fermentation broth of group 1～7(mg/mL)

圖1 游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)圖譜Fig.1 Standard map of free amino acids

圖2 組3的游離氨基酸的測定圖譜Fig.2 Determination of free amino acids in group 3

游離氨基酸本身可呈現(xiàn)出酸、甜、苦和鮮等味道[26]。其中谷氨酸和天門冬氨酸起到鮮味作用[27],由表1可知,4號組兩種氨基酸總含量最高可達(dá)2.785 mg/mL,相比較5號未優(yōu)化組的2.547 mg/mL和7號未發(fā)酵組的2.311 mg/mL分別提升0.238、0.474 mg/mL,相較于6號單菌發(fā)酵組,鮮味類氨基酸提升不明顯;呈苦味氨基酸基本包括苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸[13],1號組四種氨基酸總含量最高達(dá)0.920 mg/mL,相比較5、6、7號組的0.839、0.868、0.822 mg/mL,變化較不明顯;起甜味作用的氨基酸有甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和賴氨酸[28],1號組六種氨基酸總含量可達(dá)2.744 mg/mL,相較5、6、7號組的2.671、2.273、1.914 mg/mL分別提高0.073、0.471、0.830 mg/mL。隨著發(fā)酵過程中葡萄糖、果糖和麥芽糖的消耗,呈甜味氨基酸含量增高彌補(bǔ)了甜味的流失,表現(xiàn)在感官上則是產(chǎn)品的酸甜適口,其中賴氨酸作為必需氨基酸谷物類食品中含量較少,未發(fā)酵7號組含量為0.121 mg/mL,經(jīng)發(fā)酵后最高可達(dá)1號組的0.184 mg/mL,提高約52.07%。

以發(fā)酵優(yōu)化較好的1號組為例,其含量較高的呈味氨基酸分別為谷氨酸、丙氨酸、天門冬氨、脯氨酸和甘氨酸,五種氨基酸總含量可占到總氨基酸含量的68.10%,共同賦予了酵素產(chǎn)品酸甜鮮的滋味,可認(rèn)為以上五種氨基酸為糙米酵素的特征性風(fēng)味物質(zhì);綜合對比分析1～7組,EAA/TAA比值在13.3%～17.9%范圍內(nèi),EAA/NEAA比值在19.5%～21.8%范圍內(nèi),發(fā)酵前后并無明顯變化;氨基酸總量最高可達(dá)4號組的7.151 mg/mL,相較5號未優(yōu)化組、6號單菌發(fā)酵組和7號未發(fā)酵組分別提高0.36、0.464、1.496 mg/mL,充分表明混菌發(fā)酵相比較單菌發(fā)酵優(yōu)勢明顯。

2.2 GABA的含量與分析

圖3為GABA混標(biāo)圖譜,圖4為第3組GABA的測定圖譜,1～7組GABA的測定結(jié)果見表2。由表2可知,GABA含量經(jīng)過工藝優(yōu)化后顯著提高(P<0.05)。以最高的1號組為例,優(yōu)化后GABA含量最高可達(dá)2.595 mg/mL,相比較5號未優(yōu)化組、6號單菌發(fā)酵組和7號未發(fā)酵組的2.322、1.977和1.324 mg/mL分別提高約11.76%、31.26%和96.00%,對比其他自制液態(tài)糙米酵素,工藝優(yōu)化后GABA相對含量更高[29],同時(shí)GABA含量的提升同樣表明混菌發(fā)酵相比較單菌發(fā)酵優(yōu)勢明顯。

表2 1～7組發(fā)酵液中GABA的含量(mg/mL)Table 2 GABA contents in fermentation broth of group 1～7(mg/mL)

圖3 GABA的混標(biāo)圖譜Fig.3 GABA’s mixed spectrum

圖4 組3的GABA的測定圖譜Fig.4 Determination spectrum of GABA in group 4

2.3 揮發(fā)性香氣成分分析

表3為選取匹配度80以上的分析鑒定結(jié)果,包含香氣成分的參考閾值[30]及風(fēng)味描述[31-32]。但由于呈香化合物風(fēng)味描述與主觀評定相關(guān),閾值與蒸氣壓相關(guān),而蒸氣壓受溫度及溶劑介質(zhì)的影響[32]。并且糙米酵素并無相關(guān)研究分析其香氣成分。本試驗(yàn)樣品中水和乙醇作為溶劑所占比例最大,一般含酒精的體系內(nèi),化合物閾值隨乙醇濃度的升高而增大[33],而本試驗(yàn)中糙米酵素的酒精度經(jīng)測定約為2%vol～3%vol,故本文參考各香氣成分在啤酒中的閾值,如無文獻(xiàn)可考則參考水中的香氣閾值,溫度均為20 ℃。一些化合物閾值有爭議的,如香氣與香味、鼻前鼻后感覺的定義在各學(xué)者之間有不同觀點(diǎn)的[31],已在表中括號注明閾值測定方法。

如表3所示,單菌發(fā)酵的揮發(fā)性香氣成分為11種,混菌發(fā)酵分別產(chǎn)生揮發(fā)性香氣成分22種,共產(chǎn)生了異丁醇、異戊醇、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-辛醇、2,3-丁二醇、1-壬醇7種醇類物質(zhì);己酸和辛酸2種酸類物質(zhì);乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、苯乙酸乙酯和乙酸苯乙酯7種酯類物質(zhì);3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)1種酮類;2-甲基吡嗪一種吡嗪類和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚1種酚類?；炀l(fā)酵優(yōu)化后減少了八甲基環(huán)四硅氧烷、正己醇和糖醛3種物質(zhì)的含量。

糙米酵素經(jīng)過不同工藝混菌發(fā)酵后相比于單菌發(fā)酵分別增加了11種揮發(fā)性香氣成分。根據(jù)氣味活度值(OAV)[34]或芳香值[32]的定義描述,OAV=食品中香味化合物的濃度/食品中香味化合物的閾值,在多數(shù)情況下當(dāng)某一成分OAV<1時(shí)說明該組分對食品香氣不起直接作用,大于1時(shí)嗅覺可辨,此值越大,說明其越是該體系的特征嗅感化合物。如表3中所示,混菌發(fā)酵后糙米酵素中OAV值經(jīng)過密度換算明顯大于1的有乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、1-辛烯-3-醇和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚,其中四種酯類不受工藝變化影響全部檢出,表現(xiàn)在風(fēng)味描述上為水果香、甜香及花香,與實(shí)際觀感較為一致,因此以上四種酯類為酵母及乳酸混合發(fā)酵糙米酵素的重要特征性風(fēng)味物質(zhì),同時(shí)也證明混菌發(fā)酵相比于單菌發(fā)酵不僅在營養(yǎng)物質(zhì)含量方面占有一定優(yōu)勢,也在改善產(chǎn)品風(fēng)味方面有重要作用。

表3 不同發(fā)酵工藝糙米酵素主要香氣成分Table 3 Volatile aroma components of different fermentation brown rice enzyme

3 結(jié)論

工藝優(yōu)化后的1～4組總游離氨基酸、必需氨基酸及呈味氨基酸含量均顯著高于工藝優(yōu)化前、單菌發(fā)酵及未發(fā)酵的5～7組(P<0.05),1～3組GABA含量相對于5～7組也有較大提高(P<0.05),說明分別以發(fā)酵液T-AOC、還原糖消耗量、SOD及GSH含量為指標(biāo)對發(fā)酵工藝所作優(yōu)化結(jié)果良好,其中1號組優(yōu)化情況最佳,呈味氨基酸、必需氨基酸及GABA含量最高,證明混菌發(fā)酵相比于單菌發(fā)酵可行而且結(jié)果更佳。在揮發(fā)性香氣成分種類及含量上,混菌發(fā)酵同樣優(yōu)于傳統(tǒng)的酵母單菌發(fā)酵,不僅增加了11種香氣成分,而且增加了乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯四種特征風(fēng)味物質(zhì),同時(shí)發(fā)酵工藝的不同導(dǎo)致混菌發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣成分含量及種類有所不同,混菌發(fā)酵在改善糙米酵素風(fēng)味方面還有待更進(jìn)一步研究。

糙米原料發(fā)酵前后的EAA/TAA比值與EAA/NEAA比值均無明顯變化,且分別低于FAO/WHO推薦的理想蛋白模式下的40%與60%標(biāo)準(zhǔn)[29]。除了原料本身經(jīng)過糖化沉淀處理,只保留了可溶性蛋白可游離氨基酸以外,在發(fā)酵調(diào)控上還有改進(jìn)空間。揮發(fā)性香氣成分的研究尚屬初級,需要更進(jìn)一步探討香氣成分產(chǎn)生的機(jī)理,期待后續(xù)學(xué)者更進(jìn)一步完善糙米酵素發(fā)酵的關(guān)鍵工藝。