NOD樣受體蛋白3、Toll樣受體2在胎膜早破患者胎盤和胎膜組織中的表達(dá)及其臨床意義▲

(1 江蘇省如皋市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，如皋市 226500，電子郵箱：cuoasoa@163.com；2 南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇省海安市 226600)

胎膜早破(premature rupture of membrane，PROM)是產(chǎn)科常見疾病，是指在臨產(chǎn)期孕產(chǎn)婦出現(xiàn)的胎膜破裂，屏障能力的消失導(dǎo)致胎盤早剝、感染、絨毛膜羊膜炎、早產(chǎn)、新生兒呼吸窘迫綜合征等母嬰并發(fā)癥，對母嬰安全和健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[1]。PROM發(fā)生的最基本病理變化是胎膜結(jié)構(gòu)缺陷和炎癥，研究指出，在眾多影響PROM發(fā)生的因素中，細(xì)菌、衣原體、支原體等感染不僅是導(dǎo)致生殖道炎癥的常見因素，同時也被公認(rèn)為與PROM密切相關(guān)[2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor,NLR)是一類參與人體先天性免疫應(yīng)答的具有可識別體內(nèi)和侵入人體危險信號作用的位于細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體。NOD樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein-3,NLRP3)屬于NLRP家族，其被認(rèn)為參與了感染性疾病、自身免疫性疾病等非特異性免疫應(yīng)答過程[3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，受到細(xì)菌感染的離體胎膜組織中可見NLRP3表達(dá)升高，其可介導(dǎo)胎盤、胎膜、羊水、臍血等妊娠組織釋放炎性因子[4]。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一類參與體內(nèi)固有免疫的蛋白質(zhì)家族，作為對相關(guān)分泌炎性介質(zhì)產(chǎn)生激活作用的閘門受體，其主要在細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮作用，其中以TLR-2最為常見，其能識別多種病原微生物和產(chǎn)物，在PROM的發(fā)生中具有關(guān)鍵作用[5]。本研究探討NLRP3、TLR-2在PROM組織中的表達(dá)及其臨床意義，為防治PROM提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年4月至2017年11月我院收治的90例PROM患者作為觀察組，根據(jù)孕周分為觀察1組[孕周≥37周，足月胎膜早破(term premature rupture of membranes，TPROM)組48例]和觀察2組[孕周28～36+6周，未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membranes，PPROM)組42例]；另選取同期在我院分娩的健康孕婦70例作為對照組，根據(jù)孕周不同分為對照1組(孕周≥37周，足月對照組)和對照2組(孕周28～36+6周，未足月對照組)，各35例。觀察組患者根據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》(第7版)中PROM的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診[6]，均存在生殖道感染，PROM前14 d內(nèi)羊水培養(yǎng)或陰道分泌物培養(yǎng)呈陽性。排除母體有產(chǎn)科并發(fā)癥、妊娠疾病，胎兒胎位異常等病例。對照組孕婦均無宮內(nèi)感染，無妊娠并發(fā)癥，其中對照2組為宮頸機(jī)能不全而終止妊娠的產(chǎn)婦。入選者均為單胎妊娠。觀察1組年齡23～34(27.24±3.96)歲；孕周(39.13±1.01)周；體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)為(29.14±3.76)kg/m2。觀察2組年齡23～35(27.71±3.82)歲；孕周(35.01±1.42)周；BMI(29.43±3.65)kg/m2。對照1組年齡23～34(28.01±3.86)歲；孕周(39.71±1.10)周；BMI(29.51±3.81)kg/m2。對照2組年齡23～35(27.34±3.83)歲；孕周(35.06±1.27)周；BMI(29.22±3.78)kg/m2。各組年齡和BMI比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，對照1組與觀察1組、對照2組與觀察2組孕周比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核同意，入選孕婦均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：所有入組研究對象均接受剖宮產(chǎn)，且在娩出胎盤15 min內(nèi)采集標(biāo)本，取胎盤母體面的中央?yún)^(qū)域，將底部的蛻膜層剪除，垂直剪切2塊大小相同的胎盤組織(約為2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm)，避開異常胎盤組織(如鈣化灶、梗死區(qū)、出血處等)，將其中1塊胎膜組織放于10%中性甲醛固定后送病理檢查。

1.2.2 標(biāo)本處理：另一塊胎膜組織用0.9%氯化鈉溶液將組織漂洗干凈，用無菌濾紙清除組織上的血液和羊水，置入10%中性甲醛固定24 h，采用梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切成厚度為4 μm的切片，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(1)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色：預(yù)熱烤片箱至60℃，將切好的石蠟切片置于烤箱中烘烤0.5 h；取出石蠟切片后依次置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ液中各浸泡5 min，之后用不同濃度的乙醇脫蠟，再用自來水沖洗；將石蠟切片在蘇木精溶液中染核5 min后，自來水清洗，再放置于1%的鹽酸酒精液中分色1～2 s，自來水沖洗20 min后在室溫下放置5～10 min使其返藍(lán)，再放入伊紅液中復(fù)染胞漿2～3 min，自來水沖洗，在不同梯度乙醇中依次浸泡5 min后再置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ液中浸泡分別5 min，最后用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。(2)免疫組化法：預(yù)熱烤片箱至60℃，將切好的石蠟切片于烤箱中烘烤0.5～1 h；取出石蠟切片后常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗載玻片上多余的酒精；對石蠟切片進(jìn)行微博抗原熱修復(fù)后，3% H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗3次，5 min/次，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；正常羊血清工作液在37℃下封閉10 min后傾去封閉液，滴加稀釋后的一抗，置于濕盒內(nèi)4℃過夜；將石蠟切片取出，放置在室溫下約30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃下放置30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃恒溫箱內(nèi)放置30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；3,3-二甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽/H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并判斷免疫組化結(jié)果，分析NLRP3、TLR-2表達(dá)情況。

1.3 觀察指標(biāo) (1)絨毛膜羊膜炎發(fā)生情況：絨毛膜羊膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：① 陰道液有臭味，且存在子宮壓痛、母兒心率加快、發(fā)熱、白細(xì)胞計數(shù)增加等；② C反應(yīng)蛋白水平>8 mg/L；③ 顯微鏡下胎膜病理切片可見中性粒細(xì)胞浸潤，每高倍視野≥11個。(2)NLRP3、TLR-2表達(dá)情況：計數(shù)各組研究對象胎盤胎膜組織NLRP3、TLR-2表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)。陽性細(xì)胞：細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中可見有棕褐色、棕黃色顆粒，細(xì)胞核為藍(lán)色；陰性細(xì)胞：細(xì)胞核藍(lán)色，在細(xì)胞核映襯下細(xì)胞質(zhì)也為藍(lán)色。用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件測定胎膜胎盤組織NLRP3、TLR-2的平均光密度值，胎膜胎盤組織中NLRP3、TLR-2的表達(dá)水平以圖像5個陽性區(qū)積分光密度的平均值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，、多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組研究對象絨毛膜炎發(fā)生率比較 觀察組絨毛膜羊膜炎發(fā)生率為47.78%(43/90)，高于對照組的8.57%(6/70)(χ2=24.488，P<0.001)；其中觀察1組發(fā)生率為39.58%(13/48)，觀察2組發(fā)生率為57.14%(24/42)，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.768，P=0.096)。

2.2 觀察組與對照組胎膜胎盤組織鏡下觀察結(jié)果 觀察組和對照組的胎盤胎膜組織中均有NLRP3和TLR-2的表達(dá)(見圖1)。胎盤組織中NLRP3主要定位在胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(見圖2)，胎膜組織NLRP3主要定位在間充質(zhì)細(xì)胞和胎膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(見圖3)。胎膜組織的TLR-2主要定位在羊膜上皮細(xì)胞和絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞，胎盤組織的TLR-2主要定位在合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中(見圖4～5)，另外也可見其在胎盤絨毛和蛻膜間質(zhì)中有少量表達(dá)。對照組和觀察組胎盤胎膜組織NLRP3和TLR-2的表達(dá)定位基本相同，而觀察組大多細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可見有明顯的棕染顆粒沉著。

圖1 胎盤胎膜HE染色結(jié)果(×40)

圖2 胎盤組織NLRP3蛋白免疫組化染色結(jié)果(×40)

圖3 胎膜組織NLRP3蛋白免疫組化染色結(jié)果(×40)

圖4 胎盤組織TLR-2蛋白免疫組化染色結(jié)果(×40)

圖5 胎膜組織TLR-2蛋白免疫組化染色結(jié)果(×40)

2.3 觀察組與對照組胎膜胎盤組織NLRP3、TLR-2的平均光密度值比較 4組研究對象胎膜、胎盤組織NLRP3、TLR-2的平均光密度值比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中，觀察1組胎膜、胎盤組織的NLRP3平均光密度值均高于其余3組，觀察2組高于對照1組及對照2組(均P<0.05)；觀察1組和觀察2組胎膜、胎盤組織的TLR-2平均光密度值均高于對照1組和對照2組(均P<0.05)，但觀察1組和觀察2組TLR-2平均光密度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組胎膜、胎盤組織NLRP3及TLR-2的平均光密度值比較(x±s)

注：與對照1組相比，*P<0.05；與對照2組相比，#P<0.05；與觀察2組相比，△P<0.05。

2.4 各組胎膜、胎盤組織NLRP3、TLR-2陽性細(xì)胞數(shù)比較 4組研究對象胎膜、胎盤組織NLRP3、TLR-2陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其中，觀察1組患者胎膜、胎盤組織的NLRP3陽性細(xì)胞數(shù)均高于其余3組，觀察2組高于對照1組和對照2組(均P<0.05)；觀察1組和觀察2組胎膜、胎盤組織的TLR-2陽性細(xì)胞數(shù)均高于對照1組和對照2組(均P<0.05)，但觀察1組和觀察2組TLR-2陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組胎膜、胎盤組織NLRP3及TLR-2陽性細(xì)胞數(shù)比較(x±s，陽性細(xì)胞數(shù)/mm2)

注：與對照1組相比，*P<0.05；與對照2組相比，#P<0.05；與觀察2組相比，△P<0.05。

3 討 論

PROM是指臨產(chǎn)開始前包括羊膜和絨毛膜的胎膜發(fā)生破裂，可分為發(fā)生于妊娠37周后的TPROM和發(fā)生在妊娠37周以前的PPROM。PROM發(fā)生率較高，已經(jīng)成為常見的威脅母嬰健康的產(chǎn)科疾病。雖然目前國內(nèi)外對PROM具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但臨床醫(yī)生一致認(rèn)為，PROM并不是由單一因素誘發(fā)的，導(dǎo)致其發(fā)生的風(fēng)險因素眾多，包括感染、胎位異常、頭盆不對稱、多胎等，而生殖道病原微生物上行感染被認(rèn)為是導(dǎo)致其發(fā)生的關(guān)鍵性因素。陰道等部位的菌群通過上行渠道感染子宮頸，新生兒和母親進(jìn)一步受到感染，導(dǎo)致PROM，并引發(fā)子宮下段炎癥和絨毛膜羊膜炎等并發(fā)癥[7]。有研究指出，PROM產(chǎn)婦中有50%以上存在絨毛膜羊膜炎[8]。本研究結(jié)果顯示，觀察組產(chǎn)婦絨毛膜羊膜炎發(fā)生率為47.78%，高于對照組的8.57%，提示絨毛膜羊膜炎可能與PROM的發(fā)生密切相關(guān)。

PROM的病理變化是胎膜本身結(jié)構(gòu)缺陷和炎癥，炎癥和感染不僅會損傷胎膜結(jié)構(gòu)，還會影響孕婦免疫系統(tǒng)。機(jī)體發(fā)生感染時，炎癥會誘導(dǎo)產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)分子，參與機(jī)體胎盤胎膜組織的免疫過程[9]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)的被病原微生物感染的胎膜組織中NLRP3表達(dá)水平升高[10]。還有研究發(fā)現(xiàn)，正常的胎膜胎盤中NLRP3表達(dá)水平較低，而在PROM患者中高表達(dá)[11]。NLRP3是一種參與胎盤非特異性免疫的炎性體，主要存在于胎膜上皮細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜內(nèi)皮細(xì)胞及蛻膜基質(zhì)細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，胎膜組織NLRP3主要定位在間充質(zhì)細(xì)胞和胎膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，胎盤組織中NLRP3主要定位在胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。觀察組胎盤胎膜組織中NLRP3表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，提示NLRP3有可能參與了PROM的免疫應(yīng)答過程。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察1組患者胎盤胎膜組織NLRP3表達(dá)水平高于觀察2組(P<0.05)，這可能與兩組患者細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分和細(xì)胞凋亡等過程的炎性因子釋放水平不同有關(guān)，但具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

TLR是一種連接特異性免疫和非特異性免疫，并自發(fā)參與機(jī)體非特異性免疫過程的重要蛋白質(zhì)分子，其屬于膜結(jié)合蛋白家族，可通過識別不同光譜的病原體并生成相應(yīng)信號來對異己分子產(chǎn)生先天性免疫反應(yīng)，從而協(xié)調(diào)機(jī)體的免疫過程，在介導(dǎo)母胎之間的天然免疫過程中發(fā)揮重要作用[12]。TLR可通過與二聚體或其他蛋白質(zhì)連接的途徑來激活微生物宿主啟動炎癥反應(yīng)的第一步-先天性免疫系統(tǒng)的病原體相關(guān)分子模式，進(jìn)而誘導(dǎo)和促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，人類胎盤組織中有10種TLR表達(dá)，主要表達(dá)在滋養(yǎng)細(xì)胞，而TLR-2表達(dá)范圍最廣、識別病原微生物及其產(chǎn)物種類最多[13]。TLR-2可識別支原體、革蘭陽性菌、螺旋體、病毒、寄生蟲、真菌等，其中真菌、淋病雙球菌、滴蟲等是常見的陰道和宮頸感染病原微生物[14]。研究指出，絨毛膜羊膜炎孕婦胎膜組織TLR-2表達(dá)水平高于正常晚期妊娠婦女，這與絨毛膜羊膜炎孕婦容易發(fā)生感染和早產(chǎn)密切相關(guān)[15]。TLR-2的大量表達(dá)會通過不同信號通路的協(xié)同作用引發(fā)胎膜分子級聯(lián)反應(yīng)，體內(nèi)胎盤和蛻膜在這個過程中會釋放分泌各種促炎細(xì)胞因子和趨化因子，最終導(dǎo)致PROM[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在胎膜組織中，TLR-2主要定位在的羊膜上皮細(xì)胞和絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞，在胎盤組織中，其主要定位在合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，另外也可見其在胎盤絨毛和蛻膜間質(zhì)中有少量表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者的TLR-2蛋白表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，但觀察1組和觀察2組TLR-2表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示TLR-2可能參與了PROM的發(fā)生發(fā)展，其主要通過促進(jìn)炎性因子的大量釋放和炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)來發(fā)揮作用，但其表達(dá)水平可能與PROM孕婦的孕周無關(guān)。

綜上所述，PROM產(chǎn)婦NLRP3、TLR-2表達(dá)水平均升高，兩者可能與PROM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，進(jìn)一步研究兩者的作用機(jī)制有可能為PROM的診斷和治療提供新的方向和途徑。