植入前遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)在單基因病和染色體平衡易位中的應(yīng)用進(jìn)展

史達(dá)源，徐家偉，孫瑩璞

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，河南省生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450052)

遺傳性疾病是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的重要原因之一，目前部分遺傳病缺乏有效的治療方法。《中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告2012》[1]指出，我國(guó)出生缺陷發(fā)生率約為5.6%，每年新增出生缺陷約90萬例，包括單基因病和染色體病的新生兒，給患者家庭造成了極大的負(fù)擔(dān)。近年來，植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing，PGT)技術(shù)的發(fā)展逐步應(yīng)用于單基因病、染色體病等遺傳性疾病的預(yù)防，為高齡和反復(fù)流產(chǎn)的患者帶來了希望，通過對(duì)植入子宮前的胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，選擇不攜帶致病基因和異常染色體的整倍體胚胎移植，能夠提高IVF患者的妊娠率，阻斷遺傳性疾病向子代傳遞。

一、PGT技術(shù)的進(jìn)展

1990年國(guó)際首例PGT試管嬰兒誕生[2]，標(biāo)志著試管嬰兒技術(shù)出現(xiàn)突破性進(jìn)展，遺傳病患者可以生育健康后代。早期，針對(duì)遺傳病和反復(fù)不孕患者的PGT分為兩部分：植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)和植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening，PGS)[3]。PGD適用于單基因病和染色體病的患者，PGS適用于女方高齡、反復(fù)流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗和嚴(yán)重男性因素不育的患者。2017年，國(guó)際輔助生殖技術(shù)監(jiān)控委員會(huì)對(duì)PGT進(jìn)行了新的分類，包括三部分：植入前胚胎單基因遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M)、植入前胚胎染色體結(jié)構(gòu)變異遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT for chromosomal structural rearrangement，PGT-SR)和植入前胚胎非整倍體遺傳學(xué)篩查(PGT for aneuploidy，PGT-A)[4]。單基因病患者攜帶的致病基因遺傳給子代，會(huì)導(dǎo)致子代患病，加重家庭負(fù)擔(dān)。PGT-M可以篩選出不攜帶致病基因的胚胎用于移植，獲得健康后代。易位、倒位、重復(fù)、缺失等染色體結(jié)構(gòu)異常的患者會(huì)形成染色體核型不平衡的配子和胚胎，導(dǎo)致胚胎反復(fù)種植失敗和早期流產(chǎn)[5-6]。PGT-SR可以發(fā)現(xiàn)胚胎的拷貝數(shù)變異(CNV)，移植不攜帶缺失和重復(fù)的整倍體胚胎。非整倍體作為人類胚胎中最常見的遺傳學(xué)異常，是導(dǎo)致早期流產(chǎn)最常見的原因之一[5，7]。對(duì)于接受IVF助孕的患者，PGT-A尤其適用于女方高齡、反復(fù)流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗和嚴(yán)重男性因素不育的患者[3]。

隨著PGT技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)準(zhǔn)確性不斷提高，患者的臨床結(jié)局獲得改善。早期，通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)進(jìn)行PGT-A，評(píng)估染色體整倍性，但由于其檢測(cè)染色體數(shù)目有限和卵裂球活檢對(duì)胚胎的影響，未能改善IVF結(jié)局[8]。定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)在4 h內(nèi)快速檢測(cè)24條染色體的整倍性，可在同一周期行新鮮胚胎移植[9]。近年來，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展可以對(duì)24條染色體進(jìn)行全部染色體篩查(comprehensive chromosome screening，CCS)。微陣列比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization，aCGH)技術(shù)可檢測(cè)全部染色體的非整倍體和大于10 Mb的非整倍體片段[10-11]。單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP array)芯片覆蓋了基因組上約300 000個(gè)SNPs位點(diǎn)，能檢測(cè)全部染色體的拷貝數(shù)變異、微重復(fù)微缺失、單基因病和單親二倍體[12-13]。二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)因其高通量、低成本、邊合成邊測(cè)序等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用，能檢測(cè)全部染色體的非整倍體、嵌合體、基因組和線粒體拷貝數(shù)變異、單基因病[14]。

目前廣泛使用的PGT技術(shù)存在一定局限性。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification，WGA)由于起始DNA量少，可能引起等位基因脫扣(allele dropout，ADO)，雜合子中的一個(gè)等位基因擴(kuò)增失敗，導(dǎo)致該位點(diǎn)被錯(cuò)誤檢測(cè)為純合子，影響診斷準(zhǔn)確性。染色體相互易位和羅氏易位是引起出生缺陷、不孕和反復(fù)流產(chǎn)的常見原因。CCS技術(shù)可以檢測(cè)全部24條染色體整倍性，但無法區(qū)分正常核型與攜帶染色體易位的整倍體胚胎。移植易位攜帶狀態(tài)的胚胎會(huì)使子代同樣遭受反復(fù)流產(chǎn)和不孕的風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)以上問題，近來有新技術(shù)方法能夠減少誤診、提高診斷準(zhǔn)確性。

二、PGT技術(shù)在單基因病阻斷中的應(yīng)用

目前已知有7 000多種單基因遺傳病，超過一半有明確的致病基因[15]。大部分單基因病會(huì)導(dǎo)致先天畸形、疾病或死亡，給患者家庭和社會(huì)醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來沉重負(fù)擔(dān)。罕見病是一類嚴(yán)重影響人類健康的疾病，80%由于基因缺陷導(dǎo)致[16]，具有基因缺陷的罕見病患者通過PGT-M可以獲得健康后代。1990年第一例PGT-M通過擴(kuò)增Y染色體特異性重復(fù)序列，移植不包含Y染色體的胚胎，避免了X連鎖隱性遺傳病患者生育患病子代[2]。自PGT-M誕生以來，經(jīng)歷了20多年的臨床應(yīng)用，成功阻斷了杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、苯丙酮尿癥、多囊腎、Alport綜合征等多種單基因疾病向子代傳遞。近年來，單基因病檢測(cè)技術(shù)不斷提高，能準(zhǔn)確識(shí)別攜帶致病基因的染色體，并檢測(cè)拷貝數(shù)變異。

1.Karyomapping技術(shù)識(shí)別攜帶致病基因的染色體：WGA的局限性之一是ADO。Karyomapping技術(shù)通過對(duì)雙親、待測(cè)胚胎和患病親屬DNA進(jìn)行SNP分析，能夠檢測(cè)遺傳物質(zhì)的親本來源[17-18]，有效降低了ADO導(dǎo)致的誤診。該技術(shù)首先要尋找親本中攜帶者為雜合、另一方為純合的有效SNPs，然后與患病親屬的SNPs進(jìn)行比較，確定攜帶致病突變的單體型。最后，根據(jù)胚胎中SNPs，篩選出不攜帶致病突變的胚胎用于移植。

該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于，能同時(shí)診斷單基因病和胚胎非整倍體，已成功應(yīng)用于多種遺傳病的植入前診斷，并獲得健康新生兒[19-20]。然而，Karyomapping技術(shù)存在一定的局限性：需要患病親屬的DNA樣本進(jìn)行連鎖分析；如果突變基因附近發(fā)生染色體重組，可能會(huì)導(dǎo)致SNP位點(diǎn)失效；對(duì)于近親結(jié)婚的患者，需要結(jié)合傳統(tǒng)PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

2. 非整倍體測(cè)序與連鎖分析(mutated allele revealed by sequencing with aneuploidy and lingkage analyses，MARSALA)同時(shí)檢測(cè)單基因病和胚胎非整倍體：MARSALA是Yan等[21]研發(fā)的一種基于二代測(cè)序的PGT技術(shù)，能同時(shí)檢測(cè)單基因病和染色體異常，并進(jìn)行連鎖分析。該技術(shù)將囊胚滋養(yǎng)外胚層活檢細(xì)胞通過多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(MALBAC)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后針對(duì)基因突變區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，運(yùn)用低測(cè)序深度(0.1-2X)的二代測(cè)序準(zhǔn)確檢測(cè)染色體整倍性和單核苷酸變異。目前，MARSALA技術(shù)已成功應(yīng)用于常染色體顯性、隱性遺傳病和X連鎖遺傳病患者，并且獲得了不攜帶致病基因的健康新生兒[22]。

Wu等[23]在經(jīng)典MARSALA的基礎(chǔ)上，對(duì)多個(gè)單精子進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，3X測(cè)序深度尋找有效SNP進(jìn)行連鎖分析，無需特定引物和患病家庭成員的檢測(cè)。運(yùn)用單精子連鎖分析，該團(tuán)隊(duì)為β地中海貧血相關(guān)基因HBB均為雜合突變的夫婦移植了不攜帶突變的整倍體胚胎，獲得了臨床妊娠，并且羊水檢測(cè)證明了該技術(shù)的準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)的NGS技術(shù)檢測(cè)點(diǎn)突變需要30X測(cè)序深度。MARSALA技術(shù)使用低測(cè)序深度能同時(shí)檢測(cè)非整倍體和突變位點(diǎn)，測(cè)序成本低，但該技術(shù)無法檢測(cè)新發(fā)突變。

3.qPCR特異性檢測(cè)突變位點(diǎn)：TaqMan qPCR為基礎(chǔ)的PGT技術(shù)，成本低，可以廣泛應(yīng)用，且其可同時(shí)檢測(cè)單基因病和非整倍體，能夠在4～6 h內(nèi)完成檢測(cè)，因此患者可以在子宮內(nèi)膜容受性移植窗內(nèi)進(jìn)行新鮮胚胎移植。該技術(shù)具有極低的ADO發(fā)生率和極高的結(jié)果一致性，無需進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，使用TaqMan探針通過位點(diǎn)特異性擴(kuò)增可以直接靶向檢測(cè)突變位點(diǎn)。

有研究運(yùn)用TaqMan qPCR對(duì)43例單基因病患者的304枚胚胎進(jìn)行PGT，篩選出39枚不攜帶致病基因的整倍體胚胎進(jìn)行移植，最終有27位患者成功分娩[24]。然而，脆性X綜合征和亨廷頓舞蹈病等疾病存在三核苷酸重復(fù)，無法通過qPCR基因型探針直接檢測(cè)突變，需要對(duì)患者家系突變基因附近的SNPs進(jìn)行連鎖分析。對(duì)于TaqMan qPCR可以直接檢測(cè)的突變，連鎖分析可以避免ADO造成的誤診。

4.長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序(long read sequencing)在長(zhǎng)片段結(jié)構(gòu)變異的單基因病中的應(yīng)用：目前，通常使用全外顯子組測(cè)序(WES)或全基因組測(cè)序(WGS)檢測(cè)單基因遺傳病的突變位點(diǎn)，但由于模板DNA捕獲效率不足、測(cè)序覆蓋偏倚等問題，某些結(jié)構(gòu)變異未被發(fā)現(xiàn)。Miao等[25]通過Nanopore全基因組長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了WES短讀測(cè)序未能捕獲到的G6PC等位基因上的7.1 kb雜合缺失，結(jié)合WES檢測(cè)到的另一個(gè)等位基因上的點(diǎn)突變，鑒定出患者家系常染色體隱性遺傳方式的糖原貯積病Ia型的發(fā)病原因和致病基因來源。聯(lián)合定量PCR和微衛(wèi)星連鎖分析，篩選出僅攜帶母源點(diǎn)突變的胚胎進(jìn)行移植，成功分娩了一個(gè)健康女嬰。

長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，具有超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、極低GC偏好性等優(yōu)勢(shì)，可以精確檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異、串聯(lián)重復(fù)序列，彌補(bǔ)了短讀測(cè)序的不足[26-27]。雖然長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本高，但對(duì)于人類基因復(fù)雜序列拼接和致病性的人類基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)有巨大潛力，可有效阻斷單基因病和復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異向子代傳遞，在未來PGT中有重要發(fā)展前景。

三、PGT技術(shù)在染色體平衡易位胚胎識(shí)別中的應(yīng)用

染色體平衡易位在人群中的發(fā)生率約為0.2%，絕大部分因染色體組成未改變而表型正常，少部分易位染色體的斷裂破壞了基因功能，導(dǎo)致不孕、疾病綜合征和先天畸形。減數(shù)分裂時(shí)期，易位染色體分離紊亂，產(chǎn)生約70%不平衡配子，導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)或新生兒染色體異常。運(yùn)用斷裂區(qū)域DNA探針的FISH技術(shù)和短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STR)單體型分析可以鑒別易位攜帶者，但無法進(jìn)行全部染色體篩查[28]。對(duì)于反復(fù)流產(chǎn)和希望生育染色體核型正常后代的患者，尤其需要能區(qū)分易位攜帶狀態(tài)和正常胚胎的PGT技術(shù)。

1. 顯微切割和二代測(cè)序(MicroSeq)準(zhǔn)確檢測(cè)染色體易位斷裂點(diǎn)：Hu等[29]使用激光顯微切割技術(shù)識(shí)別易位斷裂點(diǎn)及其連鎖的SNPs位點(diǎn)，建立了一種能夠精準(zhǔn)定位染色體平衡易位斷裂點(diǎn)的方法，篩選出正常胚胎并成功應(yīng)用于PGT。該技術(shù)能夠?qū)σ孜桓浇闹嘏湃旧w進(jìn)行顯微切割和二代測(cè)序，通過靶向PCR和Sanger測(cè)序精準(zhǔn)檢測(cè)斷裂點(diǎn)及附近SNPs，利用有效SNPs進(jìn)行連鎖分析，篩選出不攜帶染色體易位的正常胚胎。然而，該技術(shù)需要高度特異性的設(shè)備和復(fù)雜的樣本制備程序，難以應(yīng)用于高通量的臨床檢測(cè)。

2. 等位基因映射識(shí)別技術(shù)(mapping allele with resolved carrier status，MaReCs)在染色體平衡易位胚胎識(shí)別中的應(yīng)用：MaReCs是一種以NGS為基礎(chǔ)的方法，運(yùn)用連鎖分析識(shí)別與易位相關(guān)的等位基因，能夠鑒別易位攜帶狀態(tài)的胚胎[30]。該技術(shù)運(yùn)用MALBAC和NGS對(duì)活檢細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和測(cè)序，通過拷貝數(shù)變異識(shí)別染色體非平衡胚胎中發(fā)生易位的斷裂點(diǎn)，在斷裂點(diǎn)附近1 Mb區(qū)域的SNPs用于分析胚胎是否攜帶染色體易位，并篩選出正常胚胎用于移植。

使用MALBAC-NGS能將斷裂點(diǎn)檢測(cè)的準(zhǔn)確性提高到200 bp，將SNPs的檢測(cè)范圍縮小到斷裂點(diǎn)附近約1 Mb區(qū)域，降低了因染色體重組而導(dǎo)致誤診的風(fēng)險(xiǎn)。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，保證了染色體平衡易位患者胚胎的有效篩選。由于檢測(cè)需要非平衡的異常胚胎作為對(duì)照尋找斷裂位點(diǎn)，因此該技術(shù)具有一定局限性。

3. 植入前遺傳學(xué)單體型分析(preimplantation genetic haplotyping，PGH)在染色體平衡易位胚胎識(shí)別中的應(yīng)用：近來有團(tuán)隊(duì)通過SNP基因型構(gòu)建斷裂區(qū)域單體型，從而識(shí)別不攜帶易位的正常胚胎。Wang等[31]使用Illumina Human Cyto-12芯片檢測(cè)基因組SNPs，將攜帶易位的非平衡胚胎作為參照，通過 SNP單體型分析識(shí)別出羅氏易位攜帶狀態(tài)的胚胎，移植了染色體正常的胚胎，并獲得臨床妊娠。Zhang等[32]利用SNP微陣列技術(shù)成功鑒別了平衡易位和羅氏易位攜帶狀態(tài)的胚胎。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于，能夠同時(shí)篩查染色體易位和23對(duì)染色體拷貝數(shù)變異；適用于全部染色體的相互易位和羅氏易位。由于該技術(shù)使用的芯片僅有300 000個(gè)SNPs位點(diǎn)，因此檢測(cè)結(jié)果不能排除染色體重組的可能性。

BasePhasing是Zhang等[33]的團(tuán)隊(duì)最近報(bào)道的一項(xiàng)能夠有效識(shí)別染色體平衡易位的技術(shù)。該團(tuán)隊(duì)使用Infinium Asian Screening Array-24 v1.0(ASA)芯片及優(yōu)化的分析流程，對(duì)兩例染色體平衡易位患者的胚胎進(jìn)行了檢測(cè)，通過羊水穿刺細(xì)胞遺傳學(xué)分析證明了其技術(shù)的有效性。由于該芯片包含700 000個(gè)SNPs位點(diǎn)，因此斷裂區(qū)域內(nèi)的有效SNPs數(shù)目較多，可以較好的排除染色體重組的影響。

4.配對(duì)二代測(cè)序和PCR斷點(diǎn)分析技術(shù)有效檢測(cè)染色體易位斷裂區(qū)域：Wang等[34]使用長(zhǎng)范圍配對(duì)測(cè)序的方法識(shí)別平衡易位斷裂區(qū)域，獲得了染色體核型正常的新生兒。該策略首先通過配對(duì)測(cè)序檢測(cè)出包含斷裂點(diǎn)的5 kb片段，進(jìn)行巢式PCR和Sanger測(cè)序，精確檢測(cè)出兩個(gè)斷裂點(diǎn)及其鄰近序列。然后，對(duì)胚胎的活檢DNA進(jìn)行特異性PCR，并進(jìn)行Sanger測(cè)序確認(rèn)是否存在斷裂點(diǎn)。

該方法無需參照，但存在幾點(diǎn)局限性：首先，盡管測(cè)序深度高(30X)，但在11個(gè)相互易位患者中有2個(gè)未檢測(cè)到斷裂點(diǎn)；羅氏易位的斷裂點(diǎn)往往位于高度重復(fù)的著絲粒區(qū)域而不易檢測(cè)。第二，位于AT富集區(qū)域的斷裂點(diǎn)因缺乏有效的PCR引物而無法檢測(cè)；小片段缺失、插入或重復(fù)導(dǎo)致斷點(diǎn)附近序列改變，使PCR引物無效。因此，明確斷裂點(diǎn)之間額外的序列可以增加引物設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性。第三，由于起始DNA量少導(dǎo)致ADO，可能會(huì)使易位攜帶狀態(tài)的胚胎誤診為正常胚胎。為了提高準(zhǔn)確性，可以同一斷裂點(diǎn)使用兩對(duì)特異性引物來降低ADO的發(fā)生率。

四、展望

PGT誕生20多年以來，在單基因病、染色體病和非整倍體檢測(cè)等方面廣泛應(yīng)用，阻斷致病基因和異常染色體向子代傳遞，篩選整倍體胚胎用于移植，改善了IVF患者的臨床結(jié)局。隨著SNP芯片技術(shù)的改進(jìn)，基因組SNP檢測(cè)位點(diǎn)增加，診斷準(zhǔn)確性提高[33]。全基因組范圍內(nèi)的SNP連鎖分析可以確定染色體親本來源，能夠識(shí)別攜帶致病基因或平衡易位的染色體，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。三代測(cè)序具有超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、單分子測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)有成功檢測(cè)單基因病和染色體平衡易位的報(bào)道[25-26，35]。今后，在優(yōu)化檢測(cè)流程和更新測(cè)序儀器的基礎(chǔ)上，三代測(cè)序可以為單基因病和染色體平衡易位患者提供低成本、準(zhǔn)確有效的PGT。目前，PGT仍然存在ADO、擴(kuò)增偏倚、胚胎嵌合體和外源性DNA污染等問題。因此，需要更加便捷有效和能廣泛使用的技術(shù)應(yīng)用于PGT，縮短患者等待時(shí)間，降低成本，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，改善臨床結(jié)局。