自體源血漿/細胞治療薄型子宮內(nèi)膜進展

黃秋艷，楊一華，黃沁璽，劉博，覃愛平

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021)

薄型子宮內(nèi)膜是指子宮內(nèi)膜厚度低于能夠獲得妊娠的厚度閾值，但目前此厚度閾值尚無統(tǒng)一標準，大部分研究認為卵泡中期內(nèi)膜厚度≤7 mm可稱為薄型子宮內(nèi)膜[1-2]，其在ART中的發(fā)生率約為2.4%[1]。近年來的研究認為單純子宮內(nèi)膜厚度對ART的妊娠結(jié)局并沒有預測價值，不建議僅依據(jù)子宮內(nèi)膜厚度來評估子宮內(nèi)膜容受性、預測ART妊娠結(jié)局或取消胚胎移植周期[2]，建議結(jié)合內(nèi)膜的形態(tài)類型、血流情況等作綜合評價。然而，在內(nèi)膜厚度≤7 mm時，臨床妊娠及活產(chǎn)率顯著降低[3]，妊娠期發(fā)生產(chǎn)科并發(fā)癥的風險增加[4]。薄型內(nèi)膜的病因包括多次宮腔操作史、宮腔炎癥及放療、枸櫞酸氯米芬等藥物作用以及腺上皮生長不良等，另有部分患者病因不明[1，5]。薄型子宮內(nèi)膜的厚度不足以讓胚胎更靠近供養(yǎng)豐富的螺旋動脈，其產(chǎn)生的活性氧自由基不利于胚胎種植，亦可能與炎癥環(huán)境異?；罨脱趸瘧し磻惓＝档陀嘘P(guān)[6]。

薄型子宮內(nèi)膜常規(guī)治療藥物包括大劑量雌激素、促性腺激素釋放激素激動劑、人絨毛膜促性腺激素、宮腔灌注粒細胞集落刺激因子(G-CSF)以及改善血流灌注的治療藥物如低劑量阿司匹林、維生素E、枸櫞酸西地那非[5]。但仍有部分患者常規(guī)治療后子宮內(nèi)膜仍極薄，根據(jù)2018年國內(nèi)生殖醫(yī)學相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜揖帉懙摹拜o助生殖技術(shù)中異常子宮內(nèi)膜診療的中國專家共識”，對于反復薄型子宮內(nèi)膜的患者建議選擇聯(lián)合治療方案，富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)、骨髓或者經(jīng)血來源的干細胞成為推薦的治療方案之一[2]。作為薄型內(nèi)膜前沿的治療方向之一，近年來PRP及干細胞治療等研究增多，相對于異體源的血漿/細胞，自體來源具有低免疫原性、低排斥反應、倫理爭議少及制備簡便等優(yōu)點。本文對自體源的血漿/細胞在薄型子宮內(nèi)膜治療中的應用進行綜述分析。

一、自體PRP

PRP由新鮮全血提取，血小板含量是普通血漿的3～5倍，其富含高濃度的生長因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、某些蛋白質(zhì)和肽(如纖維蛋白原、纖連蛋白、骨粘連蛋白、骨鈣素、血小板反應蛋白)以及某些趨化因子和細胞因子等[7-8]。PRP現(xiàn)多應用于骨骼、肌腱、創(chuàng)面、瘢痕、皮膚等組織再生修復[7-10]。自體PRP中高濃度的生長因子和細胞因子可刺激子宮內(nèi)膜細胞或子宮內(nèi)膜干細胞的有絲分裂和增殖，進而激活內(nèi)分泌旁分泌通路，改善子宮內(nèi)膜反應，促進胚胎著床和妊娠[11]。PRP亦可減少子宮內(nèi)膜損傷所致纖維化，增加宮腔局部的抗炎效果，提高子宮內(nèi)膜容受性[12]。另外，體外試驗證實活化的PRP促進子宮內(nèi)膜上皮細胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)成纖維細胞、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞(EnMSCs)和骨髓源性MSC的遷移，促進子宮基質(zhì)及EnMSCs的增殖[13-14]。

我國中山大學附屬第六醫(yī)院梁曉燕教授團隊于2015年首次報道了應用自體PRP宮腔灌注治療5例薄型子宮內(nèi)膜患者，治療后所有患者子宮內(nèi)膜厚度增加并經(jīng)IVF-ET成功妊娠[15]。之后她們團隊又兩次報道了凍融胚胎移植(FET)周期中薄型子宮內(nèi)膜患者應用PRP治療的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組子宮內(nèi)膜厚度、生化妊娠率、臨床妊娠率及胚胎種植率均高于對照組[11，16]。與國外學者Eftekhar等[17]、Zadehmodarres等[18]的研究結(jié)果類似。2018年Aghajanova等[19]報道2例嚴重宮腔粘連所致薄型子宮內(nèi)膜的患者(34歲和40歲)經(jīng)宮腔灌注自體PRP后自發(fā)妊娠或在IVF-ET幫助下獲得妊娠。

二、自體骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells，BMMCs)/骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)

1. BMMCs：作為體內(nèi)重要的干細胞龕，骨髓液含有多種祖細胞，梯度密度分離法處理后的獲取的BMMCs含有造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)及內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)等各種成體干細胞。這些細胞多可以合成釋放多種促進EPCs遷移、分化和血管新生的因子如VEGF[20]，可用于組織器官再生及修復、促進血管新生、改善局部微環(huán)境等[21]。血管發(fā)生是以HSCs為中心，邊緣為EPCs的血島形成，經(jīng)過多重血島互相融合形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。骨髓源細胞可定植入血管，作為支持細胞促進側(cè)枝循環(huán)血管的發(fā)生，改善缺血組織的血液循環(huán)及緩解缺血狀態(tài)[22-23]。骨髓移植的患者子宮內(nèi)膜活檢樣本中檢測到供體來源的子宮內(nèi)膜細胞，推測骨髓源干細胞在細胞更新和炎癥刺激下參與子宮內(nèi)膜再生[24]。2014年Singh等[25]報道6例Asherman’s綜合征患者，經(jīng)陰道超聲引導下于子宮內(nèi)膜下注射自體BMMCs，5例患者術(shù)后3個月恢復月經(jīng)來潮，內(nèi)膜由術(shù)前的1～2 mm增厚至3.7～6.7 mm不等。2017年Zhao等[26]將附著有高濃度自體BMMCs的膠原蛋白材料移植入5例重度宮腔粘連患者宮腔中，治療后子宮內(nèi)膜明顯增厚，行IVF-ET助孕均獲得妊娠并活產(chǎn)；機制分析顯示BMMCs通過降調(diào)ΔNp63的表達促進內(nèi)膜的修復，膠原蛋白支架在術(shù)后8周降解。

2. BM-MSCs：MSCs具有多向分化、造血支持、低免疫原性、旁分泌，以及向損傷組織部位遷移并定植即“歸巢”等特點，因有特殊的分子表型表達，可通過特定標志物分離篩選[27]。近年來，多類MSCs已經(jīng)證實對薄型子宮內(nèi)膜及宮腔粘連治療有效果[28]。BM-MSCs來源于骨髓，作為最早發(fā)現(xiàn)的MSCs，目前在再生醫(yī)學各領(lǐng)域研究應用較多[29]。有研究報道，人源CD133+BM-MSCs可遷移至受損傷的子宮內(nèi)膜血管周圍，通過旁分泌血小板反應蛋白1和胰島素樣生長因子1(IGF1)等旁分泌分子誘導內(nèi)膜周圍細胞增殖[30]，宮腔移植BM-MSCs后細胞角蛋白和波形蛋白(子宮內(nèi)膜細胞的標記蛋白)表達較高，同時調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜活動的重要因子整合素ανβ3和白血病抑制因子(LIF)表達升高，提高抗炎作用，促進子宮內(nèi)膜增厚[31]。2011年Nagori等[32]首次報道在1例宮腔粘連所致薄型子宮內(nèi)膜患者的治療中，通過免疫磁珠法自骨髓液分離篩選CD9+、CD90+和 CD133+的自體BM-MSCs，于月經(jīng)第2天經(jīng)宮腔灌注移植，治療后月經(jīng)量增多，術(shù)后6個月內(nèi)膜由治療前的3.6 mm增厚至7.1 mm，之后IVF-ET助孕成功。

三、自體外周血間充質(zhì)干細胞(peripheral blood mesenchymal stem cells，PB-MSCs)

MSCs可來源于多類組織，可通過G-CSF從骨髓動員至外周血來源，為PB-MSCs。PB-MSCs和BM-MSCs有相似特性[33]。研究者發(fā)現(xiàn)經(jīng)G-CSF動員后由外周血采集單個核細胞，分選出CD133+PB-MSCs灌注入子宮螺旋動脈，可顯著改善嚴重Asherman綜合征和宮腔粘連患者的內(nèi)膜厚度及妊娠結(jié)局：16例治療患者中有3例術(shù)后自發(fā)懷孕，7例患者IVF-ET后懷孕[34]。經(jīng)動員后外周血采集干細胞數(shù)量有限，明顯低于骨髓來源[33]，該研究分選出CD133+PB-MSCs，相對提高了MSCs的純度，故效果顯著。

四、自體子宮內(nèi)膜干細胞(endometrial stem cell，EMSCs)/月經(jīng)血來源間充質(zhì)干細胞(menstrual blood-derived stromal cells，menSCs)

EMSCs可從經(jīng)血和子宮內(nèi)膜活檢中獲得[35-36]，menSCs具有BM-MSCs類似MSCs表型和多分化潛能，低氧條件下仍具有較強的旁分泌功能和較優(yōu)的細胞遷移及增殖能力，同時具有抗炎、抗纖維化，免疫調(diào)節(jié)等優(yōu)勢[37]。經(jīng)血源干細胞在體外細胞因子及雌激素共培養(yǎng)條件下可向子宮內(nèi)膜細胞分化，Zhang等[38]研究發(fā)現(xiàn)menSCs可促進子宮內(nèi)膜損傷小鼠的子宮內(nèi)膜血管生成，厚度增加，提高小鼠的生育力。2016年Tan等[39]報道收集月經(jīng)第2天經(jīng)血，經(jīng)體外培養(yǎng)擴增提純menSCs，于月經(jīng)第16天B超引導下宮底注射，治療7例宮腔粘連Ⅲ-Ⅳ度的患者，其中5例患者子宮內(nèi)膜厚度增加≥7 mm，3例患者治療后妊娠(自然受孕1例，胚胎移植受孕2例，妊娠率43%)。上述研究表明經(jīng)血源干細胞可作為治療重度宮腔粘連干細胞來源，Phermthai等[40]首次成功從不育婦女身上分離提取自生和無外源EMSCs株系(autogenic and xeno-free EMSC lines)，為臨床應用自體子宮內(nèi)膜干細胞提供了可能。

五、小結(jié)及展望

各類自體血漿/細胞治療在薄型子宮內(nèi)膜的臨床治療中取得了一定效果，自體源PRP及骨髓、外周血單核細胞的采集制備和通過磁珠篩選MSCs除保證自體來源外，均無需體外擴增培養(yǎng)，避免了細胞培養(yǎng)中的生物污染，臨床應用前景良好。但是，對于需體外擴增的menSCs，如何降低生物污染的幾率？在保證自體移植下，成體干細胞數(shù)量少，如何提高細胞的存活力及移植后增殖力？由于子宮特殊的解剖結(jié)構(gòu)，如何使血漿/細胞持續(xù)良好地發(fā)揮作用？能否通過優(yōu)化移植方式提高治療的效果？

針對上述問題，有幾點值得思考：(1)自體MSCs的體外擴增：因自體MSCs的常規(guī)體外擴增需要添加胎牛血清之類的生物制品，增加了非人類病原體和病毒傳播的風險，亦可引起局部炎癥反應，導致移植細胞移植時排斥反應增加[41]。人臍帶血源血清富含高效的細胞因子和生長因子，在臨床應用中可有助于高質(zhì)量及低風險的自體MSCs產(chǎn)生[42]。(2)自體MSCs移植后效率：PRP可促進MSCs分化、血管生成、抗炎、組織重建等[43]，PRP促進menSCs的增殖，抑制細胞的凋亡，提高menSCs細胞干性及多能性，聯(lián)合自體PRP可提高MSCs并且改善子宮內(nèi)膜容受性及相關(guān)蛋白的表達[44]。另外，有研究報道經(jīng)過轉(zhuǎn)染VEGF基因的BM-MSCs移植治療薄型子宮內(nèi)膜提高了子宮內(nèi)膜容受性，可能比單純干細胞治療效果更好[45]。(3)治療方式：宮腔灌注及內(nèi)膜下注射可直接提高局部組織的干細胞濃度，保證植入部位的準確，但是由于子宮腔的特殊解剖結(jié)構(gòu)，液狀的血漿及細胞懸液無法長期粘附在子宮肌層及內(nèi)膜表面，聯(lián)合應用可降解生物支架材料等進行細胞宮腔內(nèi)移植，延長細胞與創(chuàng)面的接觸時間，可提高修復作用[26]。另外，有報道稱全身給藥比局部注射能更好地使骨髓源干細胞歸巢至子宮內(nèi)膜[46]，但是仍需將全身用藥可能發(fā)生的炎癥反應等考慮在內(nèi)，同時需要更多的研究支持。(4)治療時間：生理狀態(tài)下子宮內(nèi)膜在月經(jīng)期脫落后，在雌激素的作用下進行增殖修復，月經(jīng)期移植自體源細胞[34]取得較好的臨床效果，宮腔創(chuàng)面局部處理及搔刮亦可取得類似效果[26]。

自體源PRP及單核細胞、間充質(zhì)細胞在目前薄型子宮內(nèi)膜的臨床研究中取得一定效果，充分發(fā)揮了自體來源這一得天獨厚的優(yōu)勢，結(jié)合各類血漿/細胞的優(yōu)缺點，選擇更高效、更優(yōu)化組合等治療方式，可最大程度提高治療的效果。