白藜蘆醇干預(yù)口腔炎性骨吸收作用及機(jī)理的實(shí)驗研究進(jìn)展

米 靖 仇麗鴻

口腔炎癥性骨吸收疾病主要包括慢性根尖周炎、牙周炎等，其共同表現(xiàn)是長期存在的感染及病原刺激物導(dǎo)致組織慢性炎癥反應(yīng)，以至牙槽骨的吸收破壞，與細(xì)菌感染及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激等有關(guān)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有治療口腔炎癥性骨吸收疾病的潛能。

一、白藜蘆醇的理化性質(zhì)

白藜蘆醇（resveratrol，Res）又稱芪三酚，是非黃酮類的多酚化合物，分子式為C14H12O3，相對分子質(zhì)量為228.25，性狀為白色無味針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)在256～257℃，波長365nm 的紫外光照條件下可以產(chǎn)生熒光，易溶于乙醚、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑而難溶于水，與堿性溶液如氨水等作用可顯紅色，與三氯化鐵-鐵氰化鉀可發(fā)生顯色反應(yīng)，可以利用此性質(zhì)鑒定白藜蘆醇。天然的白藜蘆醇是一種廣泛存在于葡萄、松樹等天然植物或果實(shí)中的植物抗毒素[1]。多項研究表明白藜蘆醇具有很多藥理作用，比如抗氧化、抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)等作用，近年來深受生物醫(yī)學(xué)界的重視。

二、白藜蘆醇治療口腔炎癥性骨吸收疾病潛在機(jī)制

1.白藜蘆醇的抗炎作用

慢性根尖周炎及慢性牙周炎病損組織中可以檢測到高水平的炎癥因子表達(dá)，包括白介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等[2]。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）及牙髓卟啉單胞菌（Porphyromonas endodontalis，P.e）脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是重要致病因子，Antonietta Rizzo[3]及Zhen[4]分別用P.g-LPS 刺激人牙周膜細(xì)胞和牙齦上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞高水平表達(dá)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等炎癥因子，而經(jīng)過白藜蘆醇作用后上述炎癥因子的表達(dá)下降；P.e-LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13），白藜蘆醇可以抑制P.e-LPS 引起的成骨細(xì)胞MMP-13 表達(dá)和分泌[5]。LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞引起TNF-α 高表達(dá)，與不同濃度的白藜蘆醇作用后細(xì)胞分泌TNF-α 的量明顯減少并呈現(xiàn)出劑量依賴性[6]。Ma[7]等人發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以減輕LPS 誘導(dǎo)的鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低IL-6的表達(dá)。除此之外，根尖周炎和牙周炎的發(fā)生發(fā)展還與IL-17 有著密切關(guān)系，Casati MZ 建立了小鼠牙周炎模型，模型組IL-17 表達(dá)量升高，白藜蘆醇處理組IL-17水平則顯著降低，但是兩組IL-1β和IL-4的表達(dá)水平?jīng)]有差異[8]。除上述炎癥因子外，白藜蘆醇還可以通過抑制Toll 樣受體（toll like receptor，TLR）如TLR-4 來抑制炎癥反應(yīng)，Liu L 等用IL-1β刺激軟骨細(xì)胞后，TLR-4 表達(dá)增高，白藜蘆醇作用后與對照組相比TLR-4 表達(dá)降低，Capiralla 等用LPS 處理小膠質(zhì)細(xì)胞后得出同樣結(jié)論[9～11]。

2.白藜蘆醇的抗氧化應(yīng)激作用

氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）是指在遭受各種有害刺激時，組織或細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與抗氧化防御系統(tǒng)之間存在著嚴(yán)重失衡，活性氧蓄積導(dǎo)致?lián)p傷的過程。生理狀態(tài)下，機(jī)體組織內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除保持動態(tài)平衡，當(dāng)自由基過度產(chǎn)生或者抗氧化防御體系功能受損時，機(jī)體將處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[12]。氧化應(yīng)激狀態(tài)可以使炎癥因子如IL-8、TNF-α 等分泌增加，加速炎癥發(fā)展并加重牙槽骨的破壞[13，14]。Gan[15]等人發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以顯著降低成骨細(xì)胞活性，并呈現(xiàn)出時間依賴性，細(xì)胞的礦化能力也顯著降低，證明氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能失調(diào)。

線粒體呼吸鏈?zhǔn)钱a(chǎn)生ROS 的一個重要途徑，白藜蘆醇可以通過調(diào)節(jié)該途徑減少ROS 的生成[16]。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ是細(xì)胞內(nèi)ROS 的重要來源，白藜蘆醇可以調(diào)節(jié)復(fù)合體Ⅰ，改變線粒體NAD+/NADH 比例[17]，還可以通過與輔酶Q 競爭降低復(fù)合體Ⅲ活性，不僅可以抑制ROS 的產(chǎn)生，也可以清除已經(jīng)產(chǎn)生的ROS[18，19]。

Naofumi 的實(shí)驗證明白藜蘆醇可以通過Sirt1/AMPK 和Nrf2 抗氧化途徑來減輕鼠牙周炎模型中的氧化應(yīng)激程度，與牙周炎組相比，白藜蘆醇處理組Nrf2、HO-1、NQO-1 的mRNA 表達(dá)量升高，iNOSmRNA 表達(dá)量降低，同時牙槽骨吸收程度與對照組相比明顯緩解[20]。Rita 等人用雙氧水刺激人牙齦成纖維細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型，比較白藜蘆醇、槲皮素、NAC 三種藥物的抗氧化效果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與其他藥物相比能增強(qiáng)細(xì)胞增殖，清除絕大部分ROS，刺激Ⅰ型膠原纖維形成，調(diào)節(jié)線粒體呼吸反應(yīng)，可以作為治療氧化應(yīng)激失調(diào)的補(bǔ)充藥物[21]。ROS可以誘導(dǎo)氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，引起小鼠骨丟失，口服白藜蘆醇則預(yù)防了因氧化應(yīng)激造成的骨丟失[22]。Hung 等[23]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以清除體內(nèi)自由基并抑制自由基的形成，減輕DNA 的損傷。綜上所述，白藜蘆醇可以通過抑制ROS 生成及清除已產(chǎn)生的ROS，并通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路起到抗氧化的作用。

3.白藜蘆醇調(diào)節(jié)骨代謝的作用

慢性根尖周炎及牙周炎的特征性表現(xiàn)為成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的骨代謝平衡被打破導(dǎo)致的牙槽骨的破壞[24]。成骨細(xì)胞是形成骨的主要細(xì)胞，起源于多能骨髓基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞，白藜蘆醇可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，并且可以提高堿性磷酸酶和脯氨酰羥化酶的活性，具有劑量依賴性[25]。Patrice[26]等人發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞標(biāo)志物，如骨鈣素（osteocalcin）和骨橋素（osteopontin），表明白藜蘆醇具有促成骨作用。除此之外，白藜蘆醇還可以通過雌激素受體（E2）激活ERK 通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化基因如RUNX2、OCN 的表達(dá)[27]。

除了促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化外，近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以誘導(dǎo)牙源性干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Zhang[28]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過SIRT1 來促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，白藜蘆醇處理干細(xì)胞后成骨分化的標(biāo)志如ALP 活性、礦化能力、以及成骨相關(guān)基因（ALP、骨鈣素、骨橋素）均有不同程度的提高。

核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）和骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）在破骨細(xì)胞形成過程中發(fā)揮著重要作用。Zhao[22]等在小鼠成骨細(xì)胞中加入金屬離子，導(dǎo)致RANKL/OPG 比值升高，而白藜蘆醇作用后與對照組相比OPG/RANKL 比值維持在正常水平，避免了金屬離子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。Mehdi[29]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對RANKL 產(chǎn)生抑制作用，并呈現(xiàn)出時間及濃度依賴性。值得注意的是白藜蘆醇不是簡單的促進(jìn)或者抑制OPG 生成，而是維持其穩(wěn)定水平。在OPG/RANKL 降低時促進(jìn)OPG 生成，而在一些刺激因素如PGD2、PGE2 等作用在成骨細(xì)胞后引起OPG 上調(diào)時，起到降低OPG 的作用[30，31]。

綜上，白藜蘆醇不僅可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞及牙源性干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，還能抑制破骨細(xì)胞的形成，發(fā)揮多種作用維持牙槽骨重建與吸收的平衡，起到保護(hù)牙槽骨的作用。

三、白藜蘆醇調(diào)控疾病相關(guān)信號通路

目前已發(fā)現(xiàn)多條信號通路參與了白藜蘆醇調(diào)控口腔炎癥性骨吸收疾病的發(fā)展，其中NF-κB、SIRT1、p38MAPK 等信號通路的作用最關(guān)鍵。這些信號通路不但自身具有較復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，而且彼此相互聯(lián)系、相互影響，從而組成了一個更復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與白藜蘆醇的調(diào)控作用。

1.NF-κB炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

核因子κB（nuclear factor-κB）是一類炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。NF-κB 被證實(shí)可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 等）、趨化因子、粘附分子以及各種炎癥相關(guān)的酶類持續(xù)表達(dá)，趨化炎性細(xì)胞浸潤，引起炎癥反應(yīng)[32，33]。同時上述炎性因子又可以活化NF-κB，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。白藜蘆醇可以通過抑制NF-κB 來發(fā)揮抗炎效應(yīng)[7]。Capiralla 等[11]細(xì)胞實(shí)驗發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過干擾IKK 和IκB 的磷酸化來抑制LPS 引起的NF-κB活化。另有研究表明白藜蘆醇可以作用在TLR-4/MyD88/NF-κB 信號通路，減輕軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[10]。白藜蘆醇的衍生物也被證明可以減少LPS 引起的NF-κB 核移位[34]。

2.SIRT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

SIRT1 是組蛋白去乙酰化酶，可以通過減少炎性因子的產(chǎn)生及減輕細(xì)胞的病理損傷直接抑制炎癥，也可以通過抑制下游信號通路（NF-κB、p38MAPK 等）來間接抑制炎癥[35]。白藜蘆醇是SIRT1的天然激動劑，早在2003年就被證明其可以直接提高細(xì)胞內(nèi)SIRT1 活性，發(fā)揮抗腫瘤、抗炎等作用[36]。Pan[37]的細(xì)胞實(shí)驗中，TNF-α 誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，白藜蘆醇作用后激活SIRT1，抑制NF-κB 及p38MAPK 表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。另幾項動物實(shí)驗表明白藜蘆醇可以激活SIRT1 來緩解敗血癥小鼠模型急性腎損傷及心肌損傷癥狀，選擇性抑制SIRT1之后白藜蘆醇對小鼠的保護(hù)作用也被抑制了[38，39]。除此之外，白藜蘆醇可以通過上調(diào)SIRT1 蛋白表達(dá)，降低P.e-LPS 刺激的成骨細(xì)胞中NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制NF-κBp65 亞基與MMP-13 啟動子結(jié)合，從而降低成骨細(xì)胞MMP-13 的表達(dá)[5]。最近有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇也可以通過抑制cAMP 磷酸二酯酶間接激活SIRT1[40]。在Sadeghi[41]的細(xì)胞實(shí)驗中，白藜蘆醇減輕氧化應(yīng)激并抑制JNK-NF-κB 信號通路的作用不依賴于SIRT1。白藜蘆醇與SIRT1 的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

3.p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

p38MAPK 是一種分子量約為38KD 的蛋白激酶，磷酸化后核移位，作用于多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1、IL-6等多種細(xì)胞因子表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)。p38MAPK與根尖周炎的發(fā)生發(fā)展也有著密切關(guān)系[42]。白藜蘆醇與p38MAPK 信號通路的關(guān)系研究較少。Bi[43]等人發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以抑制LPS 誘導(dǎo)的p38MAPK 磷酸化，減少TNF-α 等炎性因子的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)。其他兩個實(shí)驗[7，37]證明白藜蘆醇可以下調(diào)p38MAPK 活性起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

除上述炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之外，白藜蘆醇還與JAK/STAT、AMPK、SOCS-1、SOCS-3 等多種炎癥相關(guān)信號通路有關(guān)[7，44，45]。白藜蘆醇的抗炎作用及作用機(jī)制還需不斷的研究。