紅棗多糖提取、分離與純化研究進(jìn)展

楊燕敏，高琳，張仁堂，張東旭，鄭振佳

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.），又名中華大棗，是鼠李科棗屬植物棗樹的果實(shí)[1]。棗樹在我國(guó)已有四千多年的栽培歷史，主要分布在西北地區(qū)、黃河流域地區(qū)和東部地區(qū)[2]。我國(guó)主要的品種有冬棗、金絲小棗、和田玉棗、壺瓶棗、長(zhǎng)棗和灰棗等。紅棗營(yíng)養(yǎng)豐富，具補(bǔ)虛益氣、養(yǎng)血安神與健脾和胃等多種保健功能[3]，有“日食三顆棗，終身不顯老”之說(shuō)。多糖是紅棗中一種重要的生物活性物質(zhì)，研究表明紅棗多糖具有抗氧化、降血脂和保肝等多種生物活性[4]，逐漸受到人們的關(guān)注。因此紅棗多糖相關(guān)的產(chǎn)品加工具有廣闊的發(fā)展前景。

多糖，又稱多聚糖，是由醛糖或酮糖通過(guò)苷鍵鏈接在一起的天然高分子化合物[5]。目前提取多糖的主要方法有：水提法、超聲輔助浸提法、微波輔助浸提法、酶提法和堿液提取法等[6]。對(duì)近年來(lái)大棗多糖的提取、除雜質(zhì)和分離純化方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，為植物多糖的相關(guān)研究及開發(fā)利用提供參考。

1 紅棗多糖的提取

1.1 熱水提取

熱水提取法是常用的方法，提取溶劑主要有水和堿液，該方法具有簡(jiǎn)單、方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)為時(shí)間長(zhǎng)、效率低以及多糖易降解[7]。采用堿液輔助熱水提取多糖可以提高粘多糖以及酸性多糖的溶解度，提高提取率。陳國(guó)梁等[8]用熱水浸提法研究浸提溫度、料液比、提取時(shí)間3 因素對(duì)冬棗多糖提取的影響，確定了最佳工藝參數(shù)：溫度為 90 ℃、料液比為 1∶15（g/mL）時(shí)提取率最佳，而提取時(shí)間對(duì)多糖得率無(wú)明顯影響。潘瑩等[9]用熱水浸提法在 100 ℃按料液比 1∶25（g/mL）提取4 h 提取粗多糖。李杰等[10]采用熱水提取法提取敦煌圓棗中的多糖，通過(guò)試驗(yàn)分析影響熱水提取法提取紅棗多糖提取率的因素順序?yàn)椋簳r(shí)間＞溫度＞料液比，確定了較優(yōu)工藝參數(shù)為：提取時(shí)間3.5 h，提取溫度95 ℃，料液比 1∶12（g/mL）浸提 2 次，多糖提取率可達(dá) 2.53%。楊云等[11]采用正交研究堿液提取大棗多糖，其各因素對(duì)多糖提取率的影響大小為：提取溫度＞提取時(shí)間＞溶劑體積＞堿的種類，最佳提取工藝為：將 20∶1（mL/g）的0.5 mol/L Na2CO3溶液與棗渣體積置于80 ℃浸提3 h。

1.2 超聲輔助提取

超聲輔助提取法是通過(guò)頻率在20 kHz 以上的超聲波對(duì)媒質(zhì)產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)和空化作用破碎細(xì)胞提高多糖的提取率[12]。李福帥等[13]在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)超聲輔助提取長(zhǎng)紅棗多糖試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)得出影響紅棗多糖提取率的因素順序?yàn)椋撼暅囟龋境晻r(shí)間＞料液比，最佳提取工藝參數(shù)為：料液比 1∶16（g/mL），超聲溫度 50 ℃，超聲時(shí)間30 min，提取所得長(zhǎng)紅棗多糖得率為15.12%。Li 等[14]采用方法學(xué)優(yōu)化超聲提取條件，結(jié)果表明：最佳提取條件是溫度45 ℃～53 ℃、聲波功率為31.7 W、時(shí)間為20 min、水固比 20∶1（mL/g）。黎云龍等[15]用超聲輔助熱水提取駿棗多糖，用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化了工藝參數(shù)，試驗(yàn)所得最優(yōu)工藝參數(shù)為：水提取溫度83 ℃、提取時(shí)間4 h、液固比 17∶1（mL/g），駿棗粗多糖得率為9.51%。和熱水提取法相比不僅縮短了提取時(shí)間并且在多糖得率方面也有所提高。超聲輔助提取紅棗多糖與熱水浸提法相比有著提高多糖提取率，縮短提取時(shí)間，提取方法簡(jiǎn)便易行的優(yōu)點(diǎn)[16-17]。

1.3 微波輔助提取

微波是頻率介于300 MHz 和300 GHz 之間的電磁波，作用于植物細(xì)胞壁，其熱效應(yīng)促使細(xì)胞膜酶失去活性和細(xì)胞壁破裂以提取多糖的方法[12]。白艷林等[18]用微波輔助提取法提取山西紅棗中的多糖，在單因素基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果表明最優(yōu)工藝參數(shù)為：提取時(shí)間 5.5 min，液料比 37∶1（mL/g），微波功率830 W，提取次數(shù)為3，多糖的提取率為6.78%。李新明等[19]用響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取紅棗多糖的參數(shù)為：微波功率 800 W，液料比 8∶1（mL/g），提取時(shí)間75 min，提取次數(shù)為3；在此條件下多糖提取量為27.28%。Rostami 等[20]研究了微波輔助浸提法提取大棗多糖，得到在微波功率400 W、提取溫度75 ℃、提取時(shí)間 60 min 時(shí)，以液料比 30∶1（mL/g）為最佳條件，可獲得多糖最大提取率。

1.4 酶法輔助提取

酶提取法常用的酶有果膠酶、蛋白酶、纖維素酶等，酶類可以分解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，加速多糖釋放和提取[12]。吳洪斌等[21]利用纖維素酶對(duì)新疆紅棗進(jìn)行多糖提取，運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化工藝參數(shù)，提高多糖提取率，試驗(yàn)所得最佳提取條件為：酶添加量0.85 mg/mL、酶解時(shí)間 60 min、酶解溫度 50.0 ℃、液料比 10∶1（mL/g），其多糖提取含量達(dá)7.71%。石勇等[22]以紅棗為材料比較熱水提取法和酶提取法，熱水提取紅棗多糖時(shí)間為6 h，多糖得率為2.69 %；利用同等單位復(fù)合的果膠酶、纖維素酶、蛋白酶對(duì)紅棗中的蛋白質(zhì)、纖維素等進(jìn)行酶解處理，獲得提取紅棗多糖的最佳條件為：提取溫度48 ℃、提取時(shí)間2.2 h、復(fù)合酶添加量1.0%，多糖提取率為4.61 %，復(fù)合酶法提取效果優(yōu)于熱水提取法的結(jié)論。

2 多糖的分離純化

2.1 蛋白的去除

蛋白質(zhì)約占紅棗中干重的3.3%[23]，與多糖同為親水性大分子物質(zhì)，在多糖提取過(guò)程中會(huì)大量存在。去除蛋白質(zhì)的方法有Sevage 法，三氯乙酸法和酶解法等。Sevage 法利用蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性而不溶于水的特性離心除去蛋白質(zhì)，此法對(duì)多糖的性質(zhì)影響較小但提取效率比較低。三氯乙酸法的原理是蛋白質(zhì)中的疏水基團(tuán)可以與三氯乙酸反應(yīng)使蛋白質(zhì)變性而相互凝聚沉淀，離心去除[24]，此法操作簡(jiǎn)單但酸性強(qiáng)，可能引起多糖的降解。酶解法是采用蛋白酶可以分解蛋白質(zhì)達(dá)到去除蛋白質(zhì)的效果，具有反應(yīng)條件溫和，提取效率高的特點(diǎn)。楊斌等[25]以蛋白清除率和多糖保留率為指標(biāo)比較了Sevage 法、三氯乙酸法、酶解法對(duì)多糖除蛋白效果，結(jié)果表明：酶法蛋白清除率（56.57%）＞Sevage 法（47.47%）＞三氯乙酸法（45.13 %），其多糖保留率（98.16%）＞Sevage 法（67.65%）＞三氯乙酸法（61.05%）。孔繁東等[26]以蛋白質(zhì)清除率和多糖保留率為指標(biāo)，研究Sevage 法、酶法、酶法-Sevage 法聯(lián)用、三氯乙酸法4 種方法對(duì)多糖除蛋白的比較。結(jié)果表明：酶-Sevage 結(jié)合法蛋白清除率（90.4334 %）＞酶法（80.7644%）＞Sevage 法（65.64%）＞三氯乙酸法；三氯乙酸法多糖保留率（96.1002%）＞酶法（95.2901%）＞酶-Sevage 結(jié)合法（91.9932%）＞Sevage 法（65.64%）。

2.2 脫色

色素也是多糖提取中的主要雜質(zhì)，脫色的常用方法有活性炭脫色法、雙氧水法、樹脂脫色法等?；钚蕴渴强糠兜氯A力對(duì)色素顆粒的吸附作用使其與目標(biāo)物質(zhì)分離而達(dá)到脫色目的[27]。雙氧水在水溶液中可電離出過(guò)氧氫根離子攻擊色素，利用H2O2的氧化性使有色物質(zhì)脫去原有色素[28]。樹脂是一種吸附性質(zhì)的脫色劑，具有穩(wěn)定性高，吸附速度快等特點(diǎn)。潘瑩等[9]用活性炭脫色和樹脂（LS-850、AB-8 和 D-101）脫色 2 種脫色方法對(duì)冬棗多糖進(jìn)行脫色，結(jié)果表明：活性炭法脫色率（78.71%）＞D-101（46.08%）＞LS-850（20.77%）＞AB-8（14.75%），活性炭法多糖保留率（90.22%）＞AB-8（90.12%）＞D-101（83.00%）＞LS-850（80.05%），活性炭脫色效果明顯高于樹脂（LS-850、AB-8 和D-101）脫色。蔣俊等[29]先后比較了大孔樹脂（D315 和D303）脫色、雙氧水脫色和活性碳脫色3 種脫色對(duì)多糖的脫色效果的影響，結(jié)果表明，大孔樹脂D303 脫色率（86.2%）＞D315（59.4%）＞雙氧水（48.7%）＞活性炭（22.1%）；活性炭多糖保留率（89.1%）＞D315（84.4%）＞D303（75.5%）＞雙氧水（72.2%），大孔樹脂（D315 和D303）脫色法明顯優(yōu)于雙氧水脫色和活性炭脫色。

2.3 柱色譜分離

柱色譜分離方法主要有：凝膠柱層析法、離子交換層析法和大孔樹脂柱層析等。凝膠柱層析的分離原理是按物質(zhì)的大小進(jìn)行分離[24]；離子交換層析是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子發(fā)生交換，使離子交換層析介質(zhì)達(dá)到分離和純化的方法[30]，大孔樹脂層析是通過(guò)物理吸附可選擇地吸附分離提純物質(zhì)。陳晉芳[30]先進(jìn)行DE-52 離子交換柱層析，通過(guò)不同濃度的離子洗脫后，得到不同的大棗多糖組分；再進(jìn)行采用Sephadex G-100 柱層析，進(jìn)一步得到分子量大小不同的大棗多糖組分：JP1、JP3、JP3a 和 JP3b。李小平[31]采用 DEAE-纖維素離子交換柱層析法對(duì)棗多糖進(jìn)行了組分分析，得到了5 種多糖組分。陳晴晴等[32]選出DM-18 型大孔樹脂為分離沙棗多糖的分離材料，在最佳分離條件下，DM-18 型大孔樹脂對(duì)沙棗多糖的吸附率達(dá)90.23%，解吸率達(dá)92.37%，得出純化多糖的純度為70.56%。Zou 等[33]用DEAE-52 纖維素陰離子交換柱和Sephadex G-200 柱層析法分離純化了灰棗中的HP1 和HP2 兩種酸性多糖。

3 多糖含量的測(cè)定

多糖含量測(cè)定傳統(tǒng)的方法有苯酚-硫酸法和蒽酮比色法，文獻(xiàn)最早可追溯至1983年[34-35]。苯酚硫酸法[36]是利用在硫酸的作用下多糖先水解成單糖，脫水生成糖醛衍生物后與苯酚生成橙黃色化合物，進(jìn)行比色法測(cè)定。蒽酮比色法[37]原理是糖遇濃硫酸會(huì)脫水生成糠醛及其衍生物，該衍生物可與蒽酮發(fā)生反應(yīng)生成藍(lán)綠色的絡(luò)合物，在620 nm 處有最大吸收，顏色的深淺與糖含量有關(guān)。王文潔等[38]比較蒽酮比色法與苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量的差異，蒽酮比色法測(cè)得多糖含量為27.79%，穩(wěn)定性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.11%，精密度和重現(xiàn)性RSD 為1.00%；苯酚硫酸法測(cè)得多糖含量為22.06%，穩(wěn)定性RSD 為0.22%，精密度和重現(xiàn)性RSD 為1.31%，得出2 種測(cè)定方法均穩(wěn)定可行、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠。

儀器分析方法主要有示差法、蒸發(fā)光散射檢測(cè)法、柱前衍生化法等，此類檢測(cè)方法主要是將多糖水解后進(jìn)行單糖組成測(cè)定。示差折光檢測(cè)器根據(jù)流通池內(nèi)的化合物折射率不同的原理而對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，常與高效液相色譜儀連用檢測(cè)糖類[39]，對(duì)糖類檢測(cè)靈敏度較高。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是將柱洗脫液霧化形成氣溶膠，在加熱的漂移管中將溶劑蒸發(fā)，最后余下的不揮發(fā)性溶質(zhì)顆粒在光散射檢測(cè)池中得到檢測(cè)的檢測(cè)器[40]。衍生化是利用化學(xué)反應(yīng)改變目標(biāo)化合物分子中的原子或官能團(tuán)，通過(guò)檢測(cè)新生產(chǎn)物對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行氣相色譜定性和定量分析[41]。申明月等[42]采用AKTA Puri-fier-100 生物分子純化系統(tǒng)對(duì)多糖進(jìn)行純化，高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法進(jìn)行了純度檢測(cè)，得出純化的最佳條件：上樣量5 mL，超純水洗脫，流速2.6 mL/min，純度大于99%。Li 等[43]用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和高效液相色譜連用測(cè)定了低聚果糖的含量，在West-XBig 酰胺柱上進(jìn)行梯度洗脫，它們的檢測(cè)限（limit of detect，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分別低于 3.63 μg/mL 和 24.82 μg/mL，回收率在99.2%～102.6%之間。郝蕾蕾等[44]以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）作為衍生劑，用高效液相色譜法分析了黃河灘棗多糖的單糖組成及摩爾比為D-半乳糖醛酸（0.27）、L-鼠李糖（0.50）、D-甘露糖（0.54）、L-阿拉伯糖（1.00）、D-葡萄糖（2.03）、D-半乳糖（5.40）。Wang 等[45]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)PMP 衍生后多糖含量進(jìn)行測(cè)定。

4 存在問題以及發(fā)展前景

紅棗多糖具有廣泛的生物活性和廣泛的研究?jī)r(jià)值。目前研究中主要存在以下問題：一是由于提取過(guò)程中的粗多糖與蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)共存，在去除雜質(zhì)的同時(shí)會(huì)有部分多糖損失；二是多糖種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多糖的結(jié)構(gòu)確證難度大；三是對(duì)于多糖活性的研究主要集中于粗提物，對(duì)于多糖的組成和精準(zhǔn)功能評(píng)價(jià)的研究較少。此外，黑變紅棗是紅棗通過(guò)固態(tài)發(fā)酵精深加工的一種產(chǎn)品，發(fā)酵后多糖的變化以及功能性評(píng)價(jià)研究也亟待開展。因此，尋找建立多糖的高效提取、分離純化和檢測(cè)方法仍舊是今后研究的重點(diǎn)。多糖具有生理活性廣泛與低毒性的特點(diǎn)，隨著生活水平的提高和健康的意識(shí)增強(qiáng)，在食品、藥品以及保健品領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊的市場(chǎng)前景。