IL-33預(yù)處理對(duì)小鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

朱 平，謝 莉，董傳江

缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury,IRI)是指在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官的損傷反而加重的病理生理現(xiàn)象[1]。肝臟缺血再灌注損傷(liver ischemia and reperfusion injury,LIRI)以肝細(xì)胞缺血壞死為特征，臨床上主要見(jiàn)于肝部分切除術(shù)、肝移植、創(chuàng)傷和低血容量性休克等[2]。但目前臨床上針對(duì)LIRI的防治僅是支持療法，因此，尋找防治LIRI的有效手段具有重要臨床意義。

白細(xì)胞介素(IL)-33最近被鑒定為孤兒受體ST2(IL-1RLI)的配體，除了表達(dá)在淋巴器官的高內(nèi)皮靜脈細(xì)胞核外，還組成性地表達(dá)于正常人的血管內(nèi)皮細(xì)胞、消化系統(tǒng)的上皮細(xì)胞以及淋巴組織纖維細(xì)胞[2]。IL-33在疾病中扮演雙重角色：它通過(guò)增強(qiáng)Th2型反應(yīng)保護(hù)機(jī)體免受寄生蟲感染和動(dòng)脈粥樣硬化，同時(shí)也能加重由Th2細(xì)胞和肥大細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病[3]。但I(xiàn)L-33在肝臟缺血再灌注(I/R)中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究將探討IL-33在小鼠LIRI中的作用及可能機(jī)制。現(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 75只雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠,8～10周齡，體質(zhì)量20～25 g。均購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司,按照清潔級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)和管理。兔抗小鼠IL-33多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；重組小鼠IL-33蛋白購(gòu)自北京方程佰金科技有限公司；ALT/AST檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司；髓過(guò)氧化物酶(MPO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。IL-17A ELISA試劑盒購(gòu)自Ebioscience公司。本實(shí)驗(yàn)使用的其他試劑均為分析純。

1.2 I/R模型建立[4]及分組 小鼠購(gòu)進(jìn)后在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。將小鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、磷酸鹽緩沖液I/R組(PBS+I/R組)及重組IL-33蛋白組(rIL-33+I/R組)，每組各15只。以戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，乙醇消毒腹部皮膚，沿腹部正中線切口入腹，在手術(shù)顯微鏡下從周圍組織中分離出支配肝臟左、中、尾葉的肝動(dòng)脈和門靜脈及膽管，應(yīng)用無(wú)損傷微血管夾阻斷以上血管，造成70%肝臟缺血，缺血部分肝組織顏色由紅潤(rùn)轉(zhuǎn)為蒼白，提示阻斷成功。隨后關(guān)閉腹腔。缺血60 min后再重新打開腹腔，移走無(wú)損傷微血管夾以解除阻斷，恢復(fù)肝臟血流供應(yīng)，肝臟顏色在1 min內(nèi)由蒼白變?yōu)榧t潤(rùn)提示再灌注成功。用3/0手術(shù)絲線縫合關(guān)閉腹腔。Sham組小鼠除了不夾閉無(wú)損傷微血管夾外其余處理同I/R組。每組分別于再灌注后6 h、12 h及24 h各時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，處死前經(jīng)眼球取血，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液沖洗肝臟，直至變白，切取I/R肝臟組織，分別行生化及形態(tài)學(xué)檢查。

1.3 IL-33表達(dá)檢測(cè) 將30只小鼠隨機(jī)分為6組(Sham組，再灌注后1 h、3 h、6 h、12 h及24 h組)。組織中IL-33表達(dá)采用免疫組化SP法檢測(cè)，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、3%甲醇、H2O2避光孵育、高壓抗原修復(fù)后，加入兔抗小鼠 IL-33抗體(1∶400稀釋)，孵育并洗滌后滴加二抗，光鏡下觀察控制DAB顯色時(shí)間，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封固。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。參考陳杰等[5]研究方法，血清中IL-33表達(dá)采用ELISA檢測(cè)法，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 IL-33預(yù)處理 參考FREITAS等[6-7]預(yù)處理方法，PBS+ I/R組于缺血前 60 min腹腔注射1 mL PBS溶液；rIL-33+I/R組小鼠于缺血前60 min腹腔注射1 mL的重組rIL-33蛋白溶液(5 μg/mL)；Sham組不夾閉無(wú)損傷微血管夾，余處理同I/R組。

1.5 肝功能指標(biāo)檢測(cè) 將小鼠血液標(biāo)本以3 000 r/min離心10 min，留取上層血清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)ALT和AST含量。

1.6 血清IL-17A檢測(cè) 參考DUAN等[8]研究方法，按不同組在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠取血，室溫放置30 min后，4 ℃下2 000 r/min離心分離血清。血清中IL-17A濃度根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 肝臟病理學(xué)評(píng)價(jià) 將小鼠肝臟組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，二甲苯中常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色10 min，流水沖洗后伊紅染色2 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光鏡下觀察各組肝臟組織變化。

1.8 MPO檢測(cè) 取I/R后肝臟組織勻漿,嚴(yán)格按MPO活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書步驟要求,460 nm波長(zhǎng)測(cè)量各管吸光度值。根據(jù)說(shuō)明書提供公式,計(jì)算MPO活性數(shù)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠LIRI過(guò)程中IL-33表達(dá)的變化 本研究檢測(cè)了小鼠缺血60 min，再灌注24 h血清中及肝臟組織表達(dá)IL-33的情況。小鼠缺血60 min，再灌注3 h后血清中IL-33開始明顯升高(P<0.05)，12 h達(dá)高峰，24 h后逐漸下降(見(jiàn)圖1)。免疫組化結(jié)果顯示，IL-33在小鼠缺血60 min，再灌注3 h后表達(dá)升高，一直持續(xù)至24 h(IL-33陽(yáng)性細(xì)胞顯示為棕色)(見(jiàn)圖2)。

2.2 肝功能評(píng)價(jià) 小鼠缺血60 min再灌注12 h，PBS+I/R組血清ALT及AST含量明顯高于Sham組 (P<0.01)。在缺血60 min，再灌注12 h，rIL-33+I/R組血清中ALT及AST水平明顯低于PBS+I/R組(P<0.01) (見(jiàn)表 1)。

表1 小鼠I/R 12 h后各組血清ALT及AST變化(ni=15;U/L)

2.3 肝臟損傷程度 HE染色顯示Sham組肝組織肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)正常(見(jiàn)圖3)。與Sham組相比，PBS+I/R組在缺血60 min再灌注12 h后，肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肝臟有大面積缺血壞死，肝細(xì)胞明顯腫脹，變性，壞死區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；rIL-33+I/R組小鼠肝臟損傷較PBS+I/R組明顯減輕。

2.4 肝臟組織MPO檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示：與Sham組相比，PBS+I/R組在缺血60 min，再灌注12 h后肝臟組織MPO含量明顯升高(P<0.01)；rIL-33+I/R組較PBS+I/R組在缺血60 min，再灌注12 h后肝臟組織MPO含量明顯降低 (P<0.01)(見(jiàn)表2)。上述結(jié)果提示，rIL-33+I/R組較PBS+I/R組在小鼠肝臟缺血60 min，再灌注12 h后中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。

2.5 IL-33預(yù)處理能抑制IL-17A的表達(dá) 結(jié)果顯示，小鼠肝臟缺血60 min,再灌注12 h PBS+I/R組血清中IL-17A含量較Sham組明顯升高(P<0.01),rIL-33+I/R組較PBS+I/R組在小鼠肝臟缺血60 min，再灌注12 h后血清中IL-17A含量明顯減少(P<0.01)(見(jiàn)表3)。

表2 小鼠I/R 12 h各組肝臟組織MPO含量(ni=15;U/g)

表3 小鼠肝臟I/R 12 h血清中IL-17A表達(dá)(ni=15;pg/mL)

3 討論

IL-33的mRNA表達(dá)于人和鼠的多種器官和細(xì)胞。在蛋白水平，IL-33主要表達(dá)在成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[9-10]，特別是高內(nèi)皮小靜脈[11]。本研究結(jié)果提示在小鼠肝臟I/R模型中，肝細(xì)胞也可以表達(dá)IL-33，再灌注后12 h達(dá)高峰，24 h逐漸降低，提示IL-33參與了小鼠LIRI。我們的預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，提前60 min腹腔注射rIL-33，IRI開始后血清中IL-33濃度最高，因此我們采用提前60 min預(yù)處理IL-33，這種預(yù)處理方法與FREITAS等[6-7]研究一致。

IL-33可通過(guò)其受體ST2保護(hù)小鼠心臟IRI，其保護(hù)機(jī)制可能與IL-33抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。有學(xué)者進(jìn)一步研究[12]發(fā)現(xiàn)，降低IL-33的表達(dá)能加重糖尿病小鼠心臟IRI，其機(jī)制可能與IL-33抑制PKCbII激活有關(guān)。最近研究[13]發(fā)現(xiàn)，IL-33能保護(hù)小鼠腦IRI，其機(jī)制可能與促進(jìn)Th2反應(yīng)，抑制Th17細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)。但也有研究[14]發(fā)現(xiàn)，IL-33能加重順鉑引起的急性腎損傷，其機(jī)制可能與IL-33促進(jìn)CD4+細(xì)胞介導(dǎo)的趨化因子CXCL-1的表達(dá)有關(guān)，可見(jiàn)IL-33具有兩面性，它在有些疾病中起保護(hù)作用，但在另外一些疾病中起促進(jìn)作用。但有關(guān)IL-33在肝臟I/R中的作用鮮有報(bào)道。

我們的研究結(jié)果提示，IL-33能抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)而保護(hù)LIRI。但I(xiàn)L-33如何抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)呢? 有大量文獻(xiàn)報(bào)道，IL-17A可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集而參與炎癥的發(fā)生、發(fā)展。有研究[15]證明，IL-17A基因敲除小鼠能明顯抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)而保護(hù)LIRI，提示IL-17A在LIRI過(guò)程中趨化中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)起關(guān)鍵作用。IL-17A可通過(guò)作用于巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，分泌多種趨化因子促進(jìn)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)[16]。也有研究[17]結(jié)果顯示，HMGB1可以通過(guò)抑制Th17細(xì)胞分泌IL-17A，從而抑制中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，而延長(zhǎng)心臟移植物的存活，提示IL-17A在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。在LIRI過(guò)程中，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到肝臟引起肝臟損傷依賴于CD4+T細(xì)胞，結(jié)果同時(shí)顯示應(yīng)用抗體清除CD4+T細(xì)胞能抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)而保護(hù)LIRI。CD4基因敲除小鼠能減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)保護(hù)LIRI，而且應(yīng)用抗IL-17抗體中和IL-17后，能通過(guò)抑制CXCL2的表達(dá)而抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步提示CD4+T細(xì)胞分泌的IL-17A在LIRI過(guò)程中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)起到關(guān)鍵作用。

有學(xué)者研究[13]發(fā)現(xiàn)，在小鼠腦IRI過(guò)程中，IL-33能通過(guò)促進(jìn)Th2型反應(yīng)而抑制Th17細(xì)胞的反應(yīng)。但在肝臟I/R過(guò)程中IL-33對(duì)IL-17A引起中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠I/R過(guò)程中，IL-33能夠減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，從而保護(hù)小鼠IRI。我們進(jìn)一步探討了加用rIL-33IL-17A水平的變化，提示IL-33能抑制IL-17A的表達(dá)，與上述研究[13]結(jié)果一致。因此，我們推測(cè)IL-33通過(guò)抑制IL-17A的表達(dá)，從而減少中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)而保護(hù)小鼠IRI。

DUAN等[8]研究結(jié)果提示IL-33在三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中表達(dá)升高，而且應(yīng)用rIL-33預(yù)處理能保護(hù)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。與DUAN等[8]研究結(jié)果一致，我們研究發(fā)現(xiàn)IL-33在小鼠肝臟I/R 3 h后開始升高，12 h達(dá)高峰，研究結(jié)果提示IL-33在此過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)，因此，我們推測(cè)IL-33在小鼠I/R過(guò)程中表達(dá)升高是反饋性的升高，是機(jī)體自我調(diào)節(jié)IRI的機(jī)制之一，我們預(yù)先給予IL-33可以更好的保護(hù)小鼠IRI。我們的研究也進(jìn)一步證實(shí)了上述推測(cè)。

本研究的不足之處在于未用ST2抗體阻斷IL-33/ST2信號(hào)通路進(jìn)行研究，因此，本研究結(jié)果不能排除IL-33除了ST2受體之外，還可能有其他信號(hào)通路參與保護(hù)LIRI。同時(shí)，本研究也未設(shè)置IL-33抗體組進(jìn)行對(duì)比研究，探討是否加入IL-33抗體后會(huì)加重LIRI。以上是本研究的兩個(gè)不足之處，本課題在以后的研究中將進(jìn)一步完善。

綜上所述，IL-33能保護(hù)小鼠LIRI，其可能機(jī)制與IL-33抑制IL-17A表達(dá)、從而抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。