支氣管肺發(fā)育不良的分子遺傳學研究進展

段 江,黃慶祥 綜述，段 山 審校

(1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，昆明 650032；2.廣東省深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心醫(yī)學遺傳學實驗室 518028)

目前認為支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是一種多因素疾病。重度BPD的病死率高達25%[1]，存活患兒有較高罹患早產兒視網膜病、氣道高反應等疾病的風險[2]，BPD患兒認知、教育和行為障礙的發(fā)生率也明顯增高[3]。研究其發(fā)病機制、預防及治療十分迫切。

除了高體積分數氧，機械通氣和感染等外源性高危因素外，對雙胎的研究表明，BPD具有較強的遺傳易感性，中度及重度BPD的遺傳度可達50%～80%[4]，并且BPD的發(fā)病存在明顯個體差異。自NORTHWAY等在1967年首次將BPD描述為呼吸窘迫綜合征(RDS)嬰兒機械通氣后的肺部疾病以來，其臨床特點、診斷標準及病理機制和病因都已發(fā)生了變化[4]?！靶翨PD”肺部間質的纖維化、上皮細胞損傷、平滑肌增生和肺動脈重塑較少，而肺泡發(fā)育阻滯及肺部微血管發(fā)育不良則成為其主要病理特點[5]。分子生物學的研究重點逐漸從早期主要關注與BPD發(fā)病相關的生物過程轉為優(yōu)先考慮與肺成熟相關的基因研究，包括在小鼠模型和臨床研究中研究BPD候選基因[6]，運用全基因組關聯研究(genome-wide association study，GWAS)[7]和外顯子測序[8]等手段探索BPD的分子遺傳機制。本文將綜述目前BPD分子遺傳機制研究方面的進展，并提出未來關于BPD遺傳學機制的可能研究方向。

1 肺表面活性物質(pulmonary surfactant,PS)

PS能夠降低肺泡表面張力,并具有免疫調節(jié)的功能。人體內目前發(fā)現的SP共有4種，分別是SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。

SP-A是合成管狀髓磷脂的必要成分，管狀髓磷脂對肺泡氣液界面張力起到重要調節(jié)作用。SP-A與SP的循環(huán)利用也有關。此外它還有調節(jié)免疫的功能，SP-A基因敲除的小鼠對感染的易感性顯著升高。編碼SP-A的基因為在染色體上緊密連鎖的SP-A1和SP-A2。在它們的外顯子區(qū)均發(fā)現了多個多態(tài)位點，其中SP-A1的單倍體型6A6與BPD易感性有顯著關聯[9]。中國學者還發(fā)現SP-A等位基因1580C/T與早產兒罹患呼吸窘迫綜合征(RDS)有顯著關聯[10]。

SP-B是形成富含表面活性物的板層小體和合成管狀髓磷脂的重要成分，也與SP的循環(huán)利用有關。SP-B基因缺失的小鼠有致死性呼吸窘迫[11]。人體編碼SP-B的基因為SFTPB，在該基因的5′UTR及第4個內含子發(fā)現有單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)及插入/缺失多態(tài)性位點與BPD易感性增強有關。針對中國漢族人群的研究發(fā)現，SP-B第4個內含子和C/A-18的多態(tài)性與BPD有關，A-del-C-A單倍型分析表明，C/A-18的A等位基因和SP-B第4個內含子的del等位基因可能是BPD的危險因素[12]。在該基因上游約27 kb還發(fā)現了微衛(wèi)星標記AAGG，也與增強BPD易感性有關[6]。

SP-C的功能與脂類的運輸和管狀髓磷脂的組織結構形成有關。SP-C基因缺陷的轉基因大鼠有嚴重的肺間質疾病和肺泡缺失。人類編碼SP-C的基因為SFTPC，已發(fā)現該基因的突變與嚴重的呼吸衰竭或間質性肺病的易感性有關聯[9,11],但是目前尚未發(fā)現該基因的變異與BPD易感性之間的關系。

SP-D是一種膠原凝集素樣物質，通過與類碳水化合物受體的相互作用來增強肺巨噬細胞對微生物的清除能力，并通過與Toll樣受體的相互作用來調節(jié)炎癥介質如TNF-α的產生。人類編碼SP-D的基因為SFTPD，其外顯子包含至少3個SNP，這些位點可影響該基因所編碼的氨基酸序列。缺失該基因的鼠類出生時雖無呼吸系統(tǒng)疾病，但SP在細胞外的沉積可激活肺泡巨噬細胞引發(fā)炎性反應和肺氣腫。目前在人類呼吸系統(tǒng)疾病患者中尚未發(fā)現該基因的突變[9,11,13]。

2 免疫相關物質

免疫異常和炎性反應是BPD重要的病理特征之一，新生兒特別是早產兒特異性免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，非特異性免疫對新生兒來說尤為重要。多種對炎性反應有調控作用的物質也可能在BPD病理過程中起作用。

2.1免疫相關細胞因子

2.1.1巨噬細胞移動抑制因子(MIF) MIF是一種促炎細胞因子，在免疫和炎性反應中起關鍵作用。MIF誘導巨噬細胞產生細胞因子并促進T淋巴細胞增殖。MIF缺陷小鼠早產時呼吸窘迫和死亡率增高，肺成熟相關基因如血管內皮生長因子(VEGF)和SP下調[14]，最近的研究還發(fā)現MIF是1個缺氧應答基因[15]。MIF基因啟動子區(qū)域的1個SNP(173G/C)可使其表達水平增高，1項對該基因與BPD關聯性的小樣本研究顯示，含有該SNP的個體有較低的BPD易感性[16]。

2.1.2干擾素(interferon，INF) INF-γ具有抗病毒活性，并在轉錄水平對免疫相關的基因有廣泛的調控作用。IFN-γ(874)A等位基因在低出生體質量兒中過度表達，而IFN-γ(874)T等位基因攜帶者則受到保護，提示IFN-γ(874)A等位基因的攜帶狀態(tài)可能增加早產的風險[6]。

門脈期圖像傳至從PACS傳至IQQA-Liver肝臟CT影像解讀分析系統(tǒng)，運用智能半自動法測出人肝體積，由2位具有豐富重建經驗的放射科醫(yī)生獨立測量肝臟體積，并各自記錄所用的測量時間，兩組數據具有較高的一致性（kappa檢驗，K值分別為0.77、0.75）。

2.1.3白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1RN) IL-1RN是白細胞介素-1家族中的一員，白細胞介素-1家族成員對免疫系統(tǒng)和炎性反應有重要調節(jié)作用。IL-1RN基因的第2個內含子有86 bp數目的可變串聯重復序列(VNTR)的多態(tài)性，其中含有4個重復區(qū)域的等位基因使個體有較低的BPD易感性，而含有2個重復區(qū)域的等位基因使個體的易感性增強[17]。

2.1.4腫瘤壞死因子α(TNF-α) TNF-α影響促炎細胞因子的釋放，在調節(jié)炎性反應中起重要作用。在BPD早產兒的肺泡灌洗液中TNF-α水平升高,低水平的TNF-α可降低BPD發(fā)生的危險性和嚴重性,而TNF-α抗體則有利于BPD的治療[18]。在TNF-α基因的5′端啟動子/增強子區(qū)域存在多個SNP位點，TNF-α-238位點的SNP與BPD易感性降低有關[19]。TNF-α-308位點位于轉錄起始位點，對該位點的研究較多，該點的SNP可使TNF-α表達水平升高，但對該SNP和BPD易感性之間關聯關系的研究結果存在分歧[6,20]。

2.2其他免疫相關物質

2.2.1Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR) TLR是非特異性免疫系統(tǒng)中的病原模式識別受體，在急性炎性反應和細胞信號轉導中起重要作用。1項針對加拿大人群的研究發(fā)現TLR4-299雜合基因型與BPD有顯著相關性，但在芬蘭人群的研究中則未發(fā)現TLR4基因多態(tài)性與BPD易感性之間的關聯[21]。TLR10是較晚被發(fā)現的TLR，其基因多態(tài)位點與早產及哮喘有相關性。有研究發(fā)現TLR6 SNP位點rs5743827與BPD的發(fā)生有關[22]。

2.2.2甘露糖結合凝集素(MBL) MBL是一種膠原蛋白，在非特異性免疫中起病原識別作用。人體內編碼該蛋白的基因為MBL2，位于其編碼區(qū)的3個多態(tài)位點和啟動子區(qū)的一個多態(tài)位點導致該蛋白的表達量降低。該基因第一個外顯子區(qū)的SNP(rs1800450)和啟動子區(qū)的SNP(rs7096206)與BPD有相關性[23]。

2.2.3人類白細胞抗原復合體(HLA) HLA基因位于6號染色體短臂，長約4 Mb，編碼人類主要組織相容性復合體蛋白(MHC)，由一系列緊密連鎖的基因座位組成，具有高度多態(tài)性。HLA基因主要分為3類。HLA-Ⅰ類基因區(qū)包括HLA-A、B、C、E、F、G等位點，其編碼的抗原分子分布于所有的組織細胞上。研究發(fā)現等位基因HLA-A*68、HLA-B*51和HLA-C*14均與較高的BPD易感性有顯著關聯，提示自身免疫過程也可能與BPD病理進程有關[6]。

3 細胞外基質(ECM)相關物質

ECM的異常重塑是BPD的一個標志性特征之一。ECM蛋白形成復雜的纖維網絡，其調節(jié)細胞黏附、遷移和生長。與ECM重塑相關的眾多基因調控紊亂與BPD的發(fā)生發(fā)展可能有重要關聯。

3.1營養(yǎng)不良聚糖(dystroglycan,DG) DG是1種細胞外基質受體，作為1種廣泛存在的黏附分子，在維持細胞形態(tài)和質膜穩(wěn)定性、細胞黏著和創(chuàng)傷修復中有重要作用。DG也在肺上皮和平滑肌細胞中高度表達，參與上皮形態(tài)發(fā)生，支持維持細胞極性。在上皮細胞中，細胞外基質受體也與損傷后修復有關，而肺損傷后修復能力的下降常與慢性肺疾病有關。研究發(fā)現DG基因的一個多態(tài)位點(N494H)的純合基因型與較高的BPD易感性有關聯[6]。

3.2轉化生長因子-β1(TGF-β1) TGF-β1是一種多功能的細胞因子，對細胞的生長、分化、免疫及細胞外基質合成均有調節(jié)作用。它可以促進細胞外基質沉積，影響纖維化細胞因子，導致纖維化發(fā)生。在BPD患兒肺灌洗液、肺組織及血液中均發(fā)現了TGF-β1的高表達。在新生大鼠高氧暴露同時給予外源性抗TGF-β1 抗體干預，可以有效阻斷肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，并使高氧引起的急性肺損傷明顯減輕。但對TGF-β1基因SNP的研究尚未發(fā)現與BPD易感性有關聯的位點[6,18,24]。

3.3基質金屬蛋白酶(MMPs) MMPs是一類在結構上有極大同源性，能降解基底膜和細胞外基質蛋白的內肽酶，幾乎能降解ECM的所有成分。MMPs通過降解ECM的組分，促進ECM釋放出VEGF和成纖維細胞生長因子(bFGF)等物質刺激血管生成。對在肺部表達炎性細胞因子白細胞介素-1β的轉基因BPD模型小鼠的研究發(fā)現，MMP-9的活性增加與BPD的發(fā)病有關，而MMP-9缺陷會加重肺泡發(fā)育不全[25]。對位于MMP-2，MMP-14，MMP-16這3個基因的9個SNP位點與BPD易感性的關聯關系的研究表明，MMP-16(rs2664352)和(rs2664349)2個SNP位點可降低BPD易感性。在肺泡發(fā)育受阻的動物模型中，MMP-16 mRNA表達水平降低[6]。

3.4睪丸蛋白聚糖(Spock2) Spock2是骨粘連蛋白家族的細胞外基質鈣黏連蛋白，包含硫酸軟骨素/硫酸乙酰肝素兩個側鏈。編碼424 個氨基酸的糖蛋白，主要表達于腦、肺、睪丸和內分泌腺等組織。Spock2與MMP-14和MMP-16有相互作用。在1項關于BPD的大型GWAS的研究中，Spock2基因是唯一被發(fā)現的BPD易感基因,在白人和美洲人種中其SNP(rs1245560)與BPD有高度相關性，并且動物實驗進一步證實，處于肺泡發(fā)育期的大鼠全肺組織該基因mRNA的表達水平升高，而高氧暴露后肺組織中該基因mRNA的表達量也上調[26]。而在另2項[27-28]中國學者的研究中則發(fā)現，Spock2的表達隨著嬰兒出生后逐漸增高，其表達下調與BPD和ROP的嚴重程度相關。

3.5纖連蛋白1(FN1) FN1是ECM的一種成分，廣泛分布于血管和平滑肌細胞層。它與其他對ECM蛋白有關鍵調控作用的分子(如TGF-β1和VEGF)相互作用，并可受炎性反應誘導。因而FN1也可能在BPD的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。對高氧暴露的小鼠和細胞培養(yǎng)模型的研究發(fā)現，FN1 mRNA和蛋白質的表達水平均升高，FN1 mRNA在BPD患兒中的表達水平也顯著升高[29-30]。

4 生長因子

4.1血管內皮生長因子(VEGF) VEGF促進血管內皮細胞的增殖和遷移，提高血管通透性，在血管發(fā)生、血管生成和血管重塑過程中起重要調控作用。BPD患兒肺中VEGF水平降低，VEGF受體抑制劑可減少肺微血管生成，使肺泡化進程受阻，肺泡數量和氣體交換面積減少，呈現與BPD相似的病理特征。1項研究發(fā)現VEGF-460CC純合基因型使BPD易感性降低，研究人員推測該基因型使啟動子的活性增強。另1項研究對該基因的6個SNP位點與BPD易感性的關聯研究發(fā)現，-634C>G使BPD易感性增強[2,6]。

4.2成纖維細胞生長因子受體4(FGFR-4) 在胚胎發(fā)育尤其是胎兒肺發(fā)育中，成纖維細胞生長因子(FGF)信號通路對細胞的增殖和遷移起重要的調控作用。目前發(fā)現的人體內FGFR基因共有4個(FGFR 1～4)，其編碼的蛋白均位于細胞膜且含有一個酪氨酸激酶結構域。FGFR 1～4在肺泡發(fā)育期間對遠端肺發(fā)育起重要調控作用。目前已發(fā)現FGFR-4的SNP位點rs1966265使BPD易感性增強[31]。

4.3維生素D受體(VDR) VDR是一類配體激活轉錄因子，維生素D的主要生理功能通過該受體實現。維生素D在胎兒肺發(fā)育、細胞增殖分化及非特異性免疫等方面發(fā)揮重要作用。有研究認為維生素D是調節(jié)肺泡Ⅱ型細胞增殖的生長因子之一，并影響肺泡上皮細胞和肺間質的相互作用，調節(jié)肺泡間質成纖維細胞的凋亡，從而增加SP的合成和減少肺泡隔膜的厚度。對VDR基因4個限制性內切酶片段長度多態(tài)性的研究發(fā)現，Fok 1 多態(tài)性位點使BPD易感性增強[32]。

5 其 他

5.1一氧化氮合成酶(NOS)與精氨酸合成酶 肺血管發(fā)育受阻是BPD患兒的病理特征之一，一氧化氮具有調節(jié)血管張力的功能。1項關聯分析研究發(fā)現內源性NOS基因第7個外顯子和該基因5′UTR的兩個SNP位點(rs2070744，rs 1799983)均是BPD的獨立危險因素[33]。

精氨酸合成酶與NOS競爭結合相同的底物L-精氨酸，并且兩者對血管重塑的作用相反。精氨酸合成酶是細胞增殖所必需的多胺和脯氨酸合成的第一步，而NOS產生的NO促進細胞凋亡。研究發(fā)現位于精氨酸合成酶-1基因啟動子區(qū)域的SNP位點(rs2781666)與防止BPD患兒罹患肺動脈高壓有顯著關聯[34]。

5.2血管緊張素轉化酶(ACE) ACE有使血管收縮的作用，從而增大血管阻力和血壓。研究發(fā)現，早在胎齡12周時，胎肺中即可檢測到ACE的表達，在BPD患兒中可檢測到ACE的表達下調[35]，而其基因的一個SNP位點rs8066114使BPD易感性增強[6]。

5.3超氧化物歧化酶(SOD) 活性氧可導致肺損傷，這是BPD發(fā)病機制的重要方面。SOD可以消除活性氧。目前研究發(fā)現SOD3(rs2536512)以及SOD3的單倍體型(rs8192287,rs2536512 和 rs1799895)與較低的BPD易感性有關聯。而SOD2的單倍體型(rs4880和rs5746136)則使BPD易感性增強[6]。

5.4谷胱甘肽巰基轉移酶(GST) GST可以去除在高氧應激中產生的有害代謝物質。GSTM1和GSTT1為編碼兩個GST同工酶的基因。研究發(fā)現該兩基因的無效等位基因型可能與中國漢族人群中較高的BPD易感性有關聯[36]。

5.5凝血因子Ⅶ 編碼凝血因子Ⅶ的基因為hFⅦ，研究發(fā)現hFⅦ-323位點的插入/缺失多態(tài)性使BPD易感性降低[6]。

另外，近年來研究人員通過RNA表達譜分析和蛋白質組分析等多種方法發(fā)現了很多在BPD患者或動物模型中差異表達的分子，比如在BPD患者中高表達的結締組織生長因子(CTGF)[2]、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)[24]、結締組織肥大細胞的特異性標記物[37]、Ⅱ型肺泡細胞表面抗原(KL-6)[38]，以及在BPD患者中低表達的鈣離子信號通路相關蛋白[39]，還有在高氧暴露的大鼠模型中高表達的8氧基-鳥嘌呤DNA糖基化酶[40]等，這些分子差異表達的機制有待進一步研究。

綜上所述，近年的分子遺傳學研究發(fā)現了大量與BPD發(fā)病相關的基因，這些基因的產物包括SP、免疫及炎性反應相關物質、ECM相關物質、生長因子、調節(jié)血管張力的物質,對活性氧有清除作用的物質、以及其他與BPD發(fā)病相關的物質。BPD是由于發(fā)育不成熟的肺在異常環(huán)境下發(fā)育及損傷后異常修復而被引發(fā)的，因此在肺發(fā)育、肺成熟及修復過程中起重要作用的基因可能與BPD發(fā)病有關，這將是未來重要的研究方向。然而至目前為止，各個有關BPD的分子遺傳機制的研究結果之間一致性較低，也尚無公認的研究結論[13]。更重要的是，很多研究是關聯性研究，有關聯關系的基因不一定是致病相關基因，因而研究結果還需要大群體樣本及動物實驗等加以驗證。并且，與BPD相關的基因變異/通路在不同的種族/民族中存在差異。隨著高通量測序技術的出現，研究人員能夠同時研究數千種基因和變異體，可以預見，未來的研究將會更加高效，與BPD相關的新候選基因將會不斷涌現。