納豆激酶分離純化和酶活性測定的研究進展

法 蕓, 張金玲, 趙海杰, 劉會洲*

(1. 中國科學院大學, 北京 100049; 2. 中國科學院青島生物能源與過程研究所,山東 青島 266101; 3. 濰坊海關(guān), 山東 濰坊 261041)

納豆激酶(NK)是新一代極富纖溶活性、安全、經(jīng)濟的溶栓劑,相對分子質(zhì)量遠小于鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)以及重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)這些常用的溶栓藥,具有強烈的纖溶活性和多元化的溶栓機制[1]。雖然對甲氧苯甲酰纖溶酶原鏈激酶激活劑復合物(APSAC)、尿激酶原(proUK)等新型溶血栓藥物正在開發(fā)中,但這些藥物均在不同程度上存在一些缺陷,如毒性強、副作用大、半衰期較短、來源緊缺、價格昂貴等[2]。而NK生產(chǎn)成本相對較低,無毒副作用,可由細菌發(fā)酵生產(chǎn),具有很好的市場前景和臨床使用價值[3,4]。NK于1980年首次由日本的醫(yī)學博士須見洋行[5]在納豆中提取和發(fā)現(xiàn),因其高效的溶栓效果受到人們的普遍關(guān)注。2015年,納豆健康功效再迎來官方認可。納豆激酶作為功效成分獲得國家食品藥品監(jiān)督總局(CFDA)的批準,并對納豆膠囊保健食品中的納豆激酶含量、納豆芽孢桿菌含量做出了明確規(guī)定,并在批復文件上附上檢測標準[6]。這種在日本、美國等發(fā)達國家風靡20余年的心腦血管預防產(chǎn)品,開始得到國人的青睞。近年來,對納豆激酶在制備工藝[7]、生理生化[8]、藥理藥效[9]、溶栓機理[10,11]和基因表達[12]等方面的研究獲得了長足發(fā)展。本文主要對納豆激酶分離純化和酶活性測定技術(shù)的研究進行綜述。

1 納豆激酶的分離純化

基因改造技術(shù)和發(fā)酵工藝優(yōu)化大大提高了NK的生產(chǎn),NK高效的分離純化技術(shù)便成為下一步的挑戰(zhàn)。目前,NK的分離純化工藝多采用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法,如有機溶劑沉淀、鹽析、親和層析等方法。也有一些新的分離技術(shù)和方法,如疏水離子交換法、磁性微球吸附法、膨脹床法、三相分割(TPP)法等。

1.1 有機溶劑沉淀法

有機溶劑沉淀法多用于NK粗產(chǎn)品的預分離。Wei等[13]通過菌株篩選、發(fā)酵、分離和成膠囊工藝報道了一種納豆激酶功能食品的制備。對發(fā)酵后的鷹嘴豆進行多次水提后利用乙醇沉淀NK,得到活性為(4 000.58±192.98) FU/g的NK粗樣品。楊志興等[14]用生理鹽水對Bacillus Subtilis HW-12分泌的溶栓酶進行提取,再用乙醇分級沉淀,然后用柱層析法進一步純化。

1.2 柱層析法

柱層析分離純化是分離蛋白質(zhì)最常用的方法。多數(shù)研究者對原料液經(jīng)過過濾、離心和鹽析后,將得到的樣品再進行柱層析分離純化。柱層析分離的方式采用凝膠分子排阻、離子交換、親和分離或多種方式結(jié)合。

Fujita等[15]將NK發(fā)酵液鹽析離心后,將得到的粗酶上清液分別經(jīng)疏水色譜柱(butyl-toyopearl)、陽離子交換色譜柱(CM-toyopearl)和凝膠分子排阻色譜柱(Sephadex G-50)分離后得到電泳級NK。閆家麒等[16]和Liu等[17]先將粗酶上清液經(jīng)過分子排阻色譜柱分離后,前者又經(jīng)過不同型號的分子排阻色譜柱純化,后者采用離子交換得到NK。Peng等[18]將硫酸銨溶液鹽析后的樣品先用陽離子交換和疏水性色譜柱分離后,再用凝膠分子排阻色譜柱過濾得到活性為1.3×105U/L的NK。Wang等[19]和Wang等[20]將硫酸銨溶液鹽析后的樣品分別經(jīng)過凝膠分子排阻色譜柱(Sephadex G-75)和(Sephacryl S-100)得到NK,其回收率分別為43.2%和12%。Dubey等[21]和Lin等[22]分別將硫酸銨鹽析后的樣品經(jīng)離子交換(DEAE Cellulose和CM-Sepharose)和凝膠分子排阻色譜柱(Sephadex G-75和Sephadex G-50)分離純化得到NK樣品。Li等[23]利用一種His-bond Ni+親和樹脂純化得到活性為6×105U/L的His-tagged NK。Deepak等[24]將含有NK的B.subtilis發(fā)酵液經(jīng)丙酮沉淀后,用離子交換柱分離得到電泳級NK。然后將NK固定在聚羥基丁酸酯(PHB)納米顆粒上使NK活性和穩(wěn)定性增強了20%。

1.3 磁性微球吸附法

磁性微球吸附是20世紀70年代發(fā)展起來的一種生物分離技術(shù)。微球內(nèi)核帶有磁性,外殼修飾多種功能基可與目標物結(jié)合。在外加磁場作用下,結(jié)合有目標物的磁性微球可定向移動,達到快速分離的目的。Yang等[25]利用修飾了對氨基苯甲脒的磁性微球來快速分離NK。純化效率和酶活性回收率分別達到8.7%和85%。

1.4 膨脹床法

膨脹床法是20世紀90年代發(fā)展起來的一種新型生物分離技術(shù)。根據(jù)靜電吸附作用,將帶有相反電荷的蛋白酶吸附在離子交換柱上,許多研究[26]表明膨脹床吸附適合從不透明的原料中分離蛋白質(zhì),具有快速分離的優(yōu)點。Hu等[27]從枯草桿菌發(fā)酵液中將粗酶溶液在pH低于其等電點的條件下,采用Streamline SP和Streamline SPXL離子交換柱,直接吸附NK,然后進行清洗解析,整個分離過程縮短為8～10 h。另外Lu等[28]利用一種新型混合模式的膨脹床從發(fā)酵液里捕集NK。優(yōu)化的pH和離子濃度提高了填料的吸附能力,得到的純化效率達到12.3%。

1.5 反相膠束萃取法

Liu等[29]等首次報道了利用二(2-乙基己基)磺基琥珀酸鈉/異辛烷反相膠束分離NK,分離過程包括兩步。第一步用50 mmol/L的二(2-乙基己基)磺基琥珀酸鈉/異辛烷與解凍的發(fā)酵液混合搖晃,混合體積比為1∶1,并在室溫條件下調(diào)至pH 6.5,離心后得到明顯分離的兩相。第二步提取:包含蛋白質(zhì)的膠束相與緩沖溶液(20 mmol/L磷酸緩沖液、0.2 mol/L KCl溶液、15%(體積分數(shù))異丙醇溶液)混合,混合體積比為1∶1。混合物離心后達到明顯的相分離。利用反相膠束得到了高達80%回收率的產(chǎn)品。

1.6 三相分割法

Garg等[30]等利用三相分割技術(shù)來純化NK,利用硫酸銨和叔丁醇從原液中沉淀NK。沉淀的蛋白質(zhì)在下層水相和上層有機相間形成界面。他們優(yōu)化了溫度、pH、硫酸銨和叔丁醇的濃度,僅用一步三相分割得到5.6倍的純化效率和129.5%的酶回收率。

如上所述,鹽析、有機溶劑分級分離等方法廣泛用于粗分級分離,這些方法的特點是簡便、處理量大,既能除去大量雜質(zhì),又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。如果有些蛋白質(zhì)提取液體積較大,又不適于用沉淀和鹽析法濃縮,可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法。傳統(tǒng)間歇式的柱層析分離方法用于NK的進一步純化。一般規(guī)模較小,工藝繁瑣,分辨率較高。磁性微球法、擴展床法、反相膠束法、三相分割法等方法是基于傳統(tǒng)方法的在分離材料和工藝上的改進,分離步驟少,相對成本低,具有快速分離的特點。但選擇性和特異性有待提高,規(guī)?；a(chǎn)尚有局限性?，F(xiàn)有的分離純化研究和質(zhì)量控制中,主要通過NK的酶活性測定進行實驗優(yōu)化和評價。

2 酶活性測定

納豆激酶是一種相對分子質(zhì)量為27.8 kDa左右的絲氨酸蛋白酶,因此可以用測定蛋白質(zhì)的方法檢測其濃度。目前蛋白含量測定的方法主要有染料法、雙縮脲(Biuret)法、酚試劑(Lowry)法等,但這些方法受共存蛋白質(zhì)的干擾嚴重。人們通常用酶的活力測定進行NK定量,尚沒有完全規(guī)范標準的測定方法[31]?，F(xiàn)有的方法包括:纖維蛋白平板法、纖維蛋白塊溶解時間法、四肽底物法、血清平板法、酶聯(lián)免疫法、纖維蛋白降解法、酪蛋白-Flion-酚法、甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)法等。

2.1 纖維蛋白平板法

纖維蛋白平板法根據(jù)Asturp方法改進[32],是目前國家衛(wèi)生部測定尿激酶及蚓激酶等溶栓酶活力的標準方法。主要原理是以瓊脂糖作為相應的骨架,加入相應濃度的凝血酶和纖維蛋白原,二者相互作用,從而在瓊脂糖平板上形成人工血栓。NK能將人纖維蛋白降解為可溶性的纖維蛋白片段,因此便會有溶解圈出現(xiàn),利用游標卡尺測量溶解圈的直徑,得到溶解圈的面積,從而可以計算出酶活力。該方法直觀簡便,可同時測定多個樣品。但通過表觀的溶解圈面積大小定量纖溶活性,檢測誤差大,靈敏度低。此外該方法受時間和溫度及產(chǎn)品純度影響較大,另因纖維蛋白源和凝血酶價格高導致檢測成本難以降低[33]。

2.2 纖維蛋白塊溶解時間法

纖維蛋白塊溶解時間法[34]簡稱CLT法,纖溶酶、組織纖溶酶原激活劑(t-PA)、尿激酶等溶血栓物質(zhì)都采用此法測定酶活。該方法的原理是NK和纖維蛋白原反應,有氣泡上升到液面,測定其溶解時間。尿激酶或纖溶酶作為標準品,以NK濃度的對數(shù)值和纖維蛋白溶解時間作圖計算酶活。此方法的優(yōu)點是分辨率高,測定時間短,更適合于粗酶的活性測定。但該法需要精確判斷反應時間,所以不太適合靈敏度要求較高的樣品活性測定,難以測量多個樣品。

2.3 四肽底物法

四肽底物法[35]是根據(jù)枯草桿菌蛋白酶E的酶活測定方法改進。納豆激酶與枯草芽孢桿菌蛋白酶E有高達99.5%的同源性,二者的催化中心和結(jié)合中心相同,只有兩個氨基酸不同。因此有人采用四肽底物法測定納豆激酶的活性。其原理是在四肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-硝基苯胺(pNA)溶液中加入酶液,于37 ℃水浴孵育1 min,測定單位時間內(nèi)410 nm處光吸收的變化。酶活力單位的定義為1 min內(nèi)水解該四肽底物生成1 μL硝基苯胺的NK量為1 U。四肽底物法簡便、靈敏度高,可迅速測定酶的活性。缺點為四肽底物法測得的蛋白酶活性并不能完全表示其溶纖維活性。

2.4 血清平板法

血清平板法[36]是根據(jù)如下原理測定酶活的:纖維蛋白形成初始,在655 nm處的吸光度最大,隨著NK的加入,使纖維蛋白溶解,吸光度逐漸下降。吸光度的減少同NK的濃度呈線性關(guān)系。其優(yōu)點是操作簡便、快捷,在4 h內(nèi)可對酶活性進行測定。樣品消耗少,成本低,可信度高,可同時檢測多個樣品,但受人工血栓的質(zhì)量影響較大。

2.5 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法[37]是利用NK有特異性的單克隆抗體與納豆激酶發(fā)生特異結(jié)合,然后同連有標志酶的多克隆抗體結(jié)合,形成一種類似三明治的結(jié)構(gòu),通過對標志酶-過氧化物酶的反應測定NK的活性。該法具有極高的特異性,靈敏度高達0.1 μg/L,抗干擾性及特異性強。但該方法在測定過程中需要升高溫度,易使NK的活性降低。另外操作成本高,難度大,實際應用受到限制。

2.6 纖維蛋白降解法

纖維蛋白降解法測定NK活性[38]的步驟是將纖維蛋白原溶液與Tris-HCl(pH 7～8)混合,于37 ℃孵育,加入凝血酶,配制成為纖維蛋白底物溶液。將纖維蛋白底物溶液與含有NK的肉湯混合,于37 ℃孵育60 min。加入三氯乙酸(TCA)溶液停止反應。作為對照,在37 ℃孵育60 min后,將含有NK的培養(yǎng)液和TCA溶液加入纖維蛋白底物溶液中。樣品離心后取上清,測量其在275 nm處的吸光度。一個單位的NK活性被定義為在1 min內(nèi)使0.01吸光度增加的酶量。

2.7 酪蛋白-Folin-酚法

酪蛋白-Folin-酚法[39]根據(jù)蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸,在堿性條件下,酪氨酸與Folin試劑反應生成藍色物質(zhì),于680 nm處比色測定光吸收值,計算酶活力。此方法簡單易行,可同時測多個樣品,成本低,但需嚴格控制酶解時間。

2.8 TAME法

TAME法[40,41]以TAME為底物,于574 nm處測定藍色復合物的吸收度,依照公式TAME(U/mL)=(甲醇微克分子數(shù)×樣品稀釋倍數(shù))/(樣品量(mL)×時間(min))計算樣品的TAME值。該方法快速、操作簡便、靈敏度高、精密度好、重復性好。熊迎新等[40]對TAME法和纖維蛋白平板法進行了比較研究。結(jié)果表明TAME法靈敏度高,操作簡便,適合作為常規(guī)分析檢測手段;而纖維蛋白平板法專屬性高,但操作繁瑣,靈敏度等不及TAME法。

NK酶活性的幾種測定方法中,科學家們使用最多的是纖維蛋白平板法,中國、日本、印度、韓國和加拿大的科學家都使用這種方法。很多中國、印度和日本的科學家也在使用纖維蛋白降解法。酶聯(lián)免疫吸附法有日本科學家在使用。NK測定方法雖然很多,但沒有完全規(guī)范統(tǒng)一的標準。上述各活性檢測方法的局限性常導致相關(guān)研究結(jié)果之間存在差異,難以進行比對。

3 展望

強勁的市場需求導致NK生產(chǎn)企業(yè)數(shù)量猛增。2018年5月18日,在由中國保健協(xié)會科技發(fā)展部[42]指導的“道清源518心腦血管日中日論壇暨納豆激酶團體標準研討會”上,中日專家們共同研討了心腦血管疾病防治工作的新成果和NK產(chǎn)品在國內(nèi)的發(fā)展問題,并啟動了“中國納豆激酶行業(yè)團體標準”的制定。這是中國納豆激酶行業(yè)的首個相關(guān)標準,宣告中國納豆激酶全產(chǎn)業(yè)即將進入標準化時代。然而,NK作為新產(chǎn)品,國內(nèi)生產(chǎn)技術(shù)工藝尚處于初級階段。我國開發(fā)高純NK產(chǎn)品則剛剛起步,僅限于納豆保健品的生產(chǎn)。獲得高純度、高產(chǎn)率的NK產(chǎn)品已勢在必行。因此提高NK分離純化方法的選擇性、特異性和高效性將是未來的發(fā)展方向。在其生產(chǎn)優(yōu)化和分離提純的研究中,不同菌種、不同發(fā)酵工藝所得相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)也有差別,使得其準確測定和分離較困難。實際應用中,酶活性的測定有時不能直接反映NK的真實產(chǎn)量。這些都限制了其作為溶栓劑的規(guī)模生產(chǎn)和開發(fā)應用。

基于核酸適配體的識別技術(shù)有望成為NK測定和高效分離純化的發(fā)展方向。由于核酸適配體(Aptamer, APT)是一類具有穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的DNA片段。具有精準的特異性、高親和力、便于化學修飾,且易于進行大量低成本的可重復性合成。無機離子、有機分子、蛋白質(zhì)乃至細胞等均可能存在與其對應的高特異性親和配體[43]。核酸適配體還可作為一種有效的分子識別工具用于蛋白質(zhì)的高靈敏分析[44],基于適配體的IgE蛋白質(zhì)[45]、丙型肝炎病毒聚合酶[46]、胰蛋白酶[47]分析已有報道。這些方法靈敏度高,特異性強。而NK具有特定的空間結(jié)構(gòu)和氫鍵的供體和受體[48,49],適配體可嵌入到NK表面的特定區(qū)域,形成相互作用和特定的空間構(gòu)型,這種特異性的分子識別能力使NK在復雜體系下能被準確靈敏地捕獲,從而實現(xiàn)高效分離。

雖然基于核酸適配體的蛋白質(zhì)分離分析取得了很大發(fā)展,但仍存在一些問題。由于篩選出的適配體數(shù)目有限,一些目標物并不容易得到,所以可利用核酸適配體親和作用分析分離的目標物還不夠豐富。另外,蛋白質(zhì)和適配體的作用相對復雜,對于蛋白質(zhì)目標物的洗脫往往比較困難,能否找到合適的洗脫溶液還有待于進一步研究。進一步發(fā)展適配體有效的固定化方法,提高制備的效率,減低制備成本及不同檢測技術(shù)的結(jié)合,將更有利于核酸適配體在分離分析中的應用及充分發(fā)揮其獨特優(yōu)勢。