貓遺傳多態(tài)性的研究進展*

賈松華 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

貓(cat;feliscatus)屬于哺乳綱、食肉目、貓科、貓屬動物。染色體數為2n=38。據考古發(fā)現[1]，人類對貓的馴化可追溯到大約9500年前；之后，Driscoll等[2]和Lipinski等[3]分別對貓的群體結構進行了分子遺傳學分析，發(fā)現人類對貓的馴化始于地中海東部沿岸地區(qū)。過去，由于農業(yè)和交通運輸的需要，人類對牛，羊，馬等進行了馴化。但對人類而言，貓并沒有直接的經濟意義或者社會意義，只是作為驅逐捕殺危害鼠類的工具。所以貓并沒有被完全的馴化，仍保留一定的野性[4-5]。直至一百多年前，人類才根據貓的毛色，毛發(fā)長短，體型等特征進行人工篩選，培育遺傳背景明確的品種貓[6-7]。目前，貓分為家貓和品種貓兩大類。家貓是家庭豢養(yǎng)貓的統(tǒng)稱，一般是隨機交配的貓。品種貓是指經培育而成，每個品種貓都具有特定的遺傳特征[8]。美國兩個最大的貓網站系統(tǒng)CFA(the Cat Fanciers’ Association)，TICA(The International Cat Association)在2018年登記的品種貓種類分別為42種，38種。另外，可將品種貓簡單地分為長毛貓和短毛貓。其中短毛貓宜作為實驗用貓，因為長毛貓易污染實驗環(huán)境、實驗操作不便，且體質較弱，實驗耐受性差[9]。

貓作為實驗用動物始于19世紀末。在神經學，藥理學，心血管系統(tǒng)等研究方面，實驗用貓具有其他實驗動物無法比擬的優(yōu)勢[10]。比如，貓有極其敏感的神經系統(tǒng)，是研究腦神經生理學的絕好實驗動物[8]；它的血壓最為穩(wěn)定，《中國藥典》明確指出貓在藥品檢驗中用于降壓物質的檢查[11]。與鼠科動物模型相比，貓體型大，長壽(一般為12～30年)，具有與人類更相似的生理學特征，這些優(yōu)點使貓更適合檢測某些治療方法的安全性和有效性[9, 12]。隨著人類對品種貓的定向篩選培育，越來越多與人類同源的貓遺傳性疾病被發(fā)現。目前確定的貓遺傳性疾病已超過了250種，其中包括在波斯貓(Persiancats)中發(fā)現的多囊性腎病(PKD)，以及在德文萊克斯貓(DevonRexcats)中觀察到的先天性肌肉萎縮癥。貓為研究人類很多罕見的遺傳疾病提供了寶貴的動物模型[13-16]。同時，患有某些感染性疾病的貓是人類很好的自然動物模型。在研究人類獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)中，轉基因鼠和貓免疫缺陷是目前運用最多的非靈長類動物模型。感染有冠狀病毒(FeCoV)的貓可用于研究SARS的臨床癥狀[12, 17-20]。

綜上所述，貓用于科學實驗具有一定的現實意義。但與此同時，我國也面臨著實驗用貓緊缺的問題[21]。目前我國實驗用貓多數購自市場，經隔離檢疫、嚴格篩選后使用；目前為止，我國90%以上的教學科研實驗用貓都是從商販或“收購型飼養(yǎng)場”購買。其來源混雜，遺傳背景模糊，所攜帶微生物不明等情況，對實驗結果的準確性、科學性以及重現性都有直接影響[5, 21-22]。為了提高實驗用貓的質量，使其更易用于科研和生產，近年來我國一些單位對供實驗使用的貓進行了專門的繁殖飼養(yǎng)。比如，華北制藥廠定向培育成了虎皮貓[23]；自2003年大連醫(yī)科大學也開始了貓的飼養(yǎng)繁育[24]。在對實驗用貓進行專門飼養(yǎng)時，我們有必要對貓的遺傳方面進行一定的檢測。這樣才能合理利用貓資源，為培育實用的實驗貓群體提供科學的依據。本文主要就生化標記和DNA分子標記在貓的遺傳檢測中的現狀以及存在的問題進行了探討。

1 生化標記

生化標記是以生物在蛋白質水平上表現出的遺傳多態(tài)性為依據，分析群體的遺傳結構，進而反映生物的變異程度。此方法的特點是操作簡單、成本低，方法成熟穩(wěn)定。我國已將近交系大、小鼠的生化標記檢測作為常規(guī)監(jiān)測列入國家標準。

關于貓的生化標記研究最早始于Thuline等[25]，觀察到 6-PGD(六磷酸葡萄糖脫氫酶)呈現多態(tài)性，并且Kohn和Tamarin[26]驗證了Thuline的研究結果。隨后的科學研究發(fā)現：GPI(磷酸葡萄糖異構酶)、ESD(酯酶D)在某些品種貓中也具有多態(tài)性[27-29]。Altunok等[30]從Van cats和其他品種貓的對比分析中得到：Van cats的平均雜合度為0.33～0.49；并依據系統(tǒng)發(fā)生樹的結果得出，該貓與暹羅貓、孟買貓存在明顯不同；6-PGD、ME(蘋果酸酶)和ESD在該研究的全部貓中均呈現多態(tài)性，其中PGD的多態(tài)性最強，而ME是該研究最新發(fā)現的多態(tài)性蛋白。

從上述研究現狀看，在用生化標記分析貓的遺傳多態(tài)性時，其多態(tài)性位點極其有限，易受發(fā)育狀況、實驗條件等影響，限制了其在貓中的應用。很有必要開發(fā)其他方法分析貓的遺傳多態(tài)性。

2 DNA分子標記

DNA多態(tài)性是指不同物種或者同一物種不同個體間核苷酸序列的變異，在自然界中廣泛存在。以生物個體之間的DNA差異為標記，即分子生物學標記(簡稱分子標記)。目前，發(fā)現的DNA多態(tài)性包括限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA, STR)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。分子標記已成了近年現代遺傳標記學發(fā)展最快的領域之一。對DNA多態(tài)性的研究，讓我們更加精確直接地分析群體的遺傳多態(tài)性，同時彌補了蛋白質多態(tài)性位點不足的缺點。該研究為生物的物種鑒別、群體多態(tài)性分析、遺傳圖譜構建開辟了一條嶄新的道路。下文對幾種DNA多態(tài)性的研究現狀進行了綜述。

2.1 限制性片段長度多態(tài)性

20世紀80年代初人們便開始了RFLP的研究，該技術以DNA-DNA為基礎的Southem雜交為依托，是遺傳檢測早期應用比較多的方法。Suzuki等[31]用12種限制內切酶分析了西表山貓和豹貓的rDNA，與西表山貓屬于西表島本土貓的假說不同，他認為豹貓是從陸地遷至島上的亞種，與Masuda等[32]的觀點一致。Yuhki和O'brien[33]利用鼠和人的分子探針對貓的MHC基因(即FLA)進行內切酶分析，成功繪制了貓B2染色體上的FLA遺傳圖譜。Kuwahara等借助PCR-RFLP將貓FLA中的DRB基因進行了分型，并以此作為參考標準進行貓的皮膚移植實驗，發(fā)現DRB分型對貓移植免疫反應，自身免疫的易感性等研究具有重要的參考意義[34-35]。RFLP技術的多態(tài)性位點豐富、重復性好且穩(wěn)定性強，是進行群體遺傳多態(tài)性分析的有效工具，但操作繁瑣、需要的樣本量大等缺點制約了它的應用。

2.2 微衛(wèi)星多態(tài)性

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)又稱為短串聯重復序列(short tandem repeat, STR)由核心序列和兩側保守的側翼序列兩部分組成。在微衛(wèi)星中存在的短串聯重復序列(一般重復單位為1～6 bp)構成了核心序列部分，這是STR具有高度多態(tài)性的遺傳基礎；而兩側保守的側翼序列將STR特異性地定位于染色體的固定位置，從而使STR多態(tài)性用于遺傳多態(tài)性分析具有可行性。有關微衛(wèi)星的報道最早見于1974年Skinner等[36]對寄居蟹基因組的研究?？茖W家們之后的發(fā)現表明，微衛(wèi)星DNA在真核生物基因組中廣泛存在，并且?guī)缀醴植加谌旧w的所有區(qū)域。除此之外，STR呈現豐富的DNA多態(tài)性，遵循孟德爾共顯性遺傳，在相關的物種間具有一定的通用性和保守性。進而，微衛(wèi)星DNA在犬，牛，馬，貓等[37-40]動物的科學研究中得到了廣泛應用。

Menotti-Raymond等[41]篩選了11個STR(四核苷酸重復，彼此無連鎖關系，并呈現高度的雜合性)用于識別貓個體，鑒定親子關系。Coomber等[42]認為這組STR體系在法醫(yī)鑒定中具有很好的穩(wěn)定性和可信度。Lyons等[43]在貓B1染色體上找到了8個與虎斑毛色連鎖的STR位點，其中，FCA700的連鎖性最強。Filler等[44]采用38個STR位點，對塞絲克貓群體的觀測雜合度(Ho)、期望雜合度He、近交系數(FIS)等進行了遺傳分析。Filler等認為，賽絲克貓屬于波斯貓品系家族，且該種群的遺傳多態(tài)性豐富。微衛(wèi)星遺傳標記的另一個重要用途即是：貓品系分類。Lipinski等[3]通過38個STR(兩個四核苷酸重復，36個二核苷酸重復)將所研究的貓分成了20個品系；但鑒于該組STR體系分析另外四個種群時缺乏充足的證據，因此本次實驗有四個種群并未進行品系劃分。而Menotti-Raymond[45]用11個四核苷酸重復的STR將1 040只貓分成了17個品系，仍有20個種群因證據不足無法進行品系劃分。不難發(fā)現，四核苷酸重復的STR沒有二核苷酸重復的STR區(qū)分品系的效果好。近年來對STR的科學研究發(fā)現，用微衛(wèi)星多態(tài)性分析遺傳多態(tài)性是一種比較理想的方法，檢測方法方便、省時，但微衛(wèi)星DNA篩選和檢測的復雜過程是研究中很大的制約因素。

2.3 單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是繼RFLP、STR之后的第三代DNA遺傳標記。與之前研究的RFLP、STR不同，SNP不再憑借DNA片段的長度差異反應DNA的多態(tài)性，而是根據基因組水平上單個核苷酸的變異表述DNA的多態(tài)性。SNP是一種二等位基因標記，在群體中只有兩個等位基因的基因，所以可通過簡單的“+/-”進行基因分型，更易于實現其在檢測、分析中的自動化。另外，它的分布密度以及數量都多于STR、遺傳穩(wěn)定性強并具有代表性，從而可以得到更全面、詳細的全基因掃描數據[46]。目前對SNP的研究仍處于探索階段，其應用范圍主要集中于法醫(yī)、疾病和群體遺傳學等方面。

Sato等[47]借助不同動物毛發(fā)的結構特點以及動物的SNP多態(tài)性對不同的動物進行區(qū)分，為法醫(yī)鑒定和瀕危物種的保護提供了新的思路。Peterschmitt等[48]在研究挪威森林貓時，發(fā)現了一個與琥珀毛色連鎖的SNP。家貓對歐洲野貓的基因滲入問題一直備受關注。曾有研究用STR對家貓和野貓的遺傳結構進行了對比分析，但STR在分辨它們的雜交后代時存在局限性[49-51]。Nussberger等[52]利用48個SNP(Fst>0.8)分析了家貓，野貓以及它們的雜種、回交后代的遺傳結構。篩選的48個STR能有效地區(qū)分雜交的F1，F2代；并且對評價野貓的基因滲入率，理解雜交過程均有幫助。Mullikin等[17]繪制了高密度的SNP圖譜，并發(fā)現了94個新的SNPs。

從近年對SNP的研究情況來看，有些SNP的檢測方法成本低、但速度慢、不適合自動化分析；有些方法可實現自動化高通量檢測、但制備探針昂貴、準確度不高。綜上所述，目前我們距離靈敏準確、高通量、簡單易行的SNP檢測方法仍有一段距離要努力探索。

3 結語

貓在生物醫(yī)學研究，制藥業(yè)等研究領域具有舉足輕重的分量。而貓的質量對研究結果的準確性，重復性以及科學性有著重要的影響。在控制實驗用貓質量方面，遺傳質量是最主要，最為本質性的影響因素。定期開展貓的遺傳質量檢測，可有效避免實驗用貓的種質退化、遺傳漂移，減少實驗結果誤差，指導群體的遺傳育種，最大程度地應用貓資源。經歷了50多年的發(fā)展歷程，有關貓的遺傳質量檢測已從染色體水平提升到了DNA分子水平[16]。目前，國外開發(fā)了很多分析貓遺傳性疾病和性狀(比如毛色)的遺傳檢測方法，為貓的育種工作者和獸醫(yī)提供了有效的指導意見。比如，賓夕法尼亞大學等[13]研究機構已將貓的遺傳檢測實現了商業(yè)化應用。但我國目前尚未出臺實驗用貓遺傳質量的國家標準，各地方也沒有成熟的實驗用貓遺傳質量地方標準。隨著國內大專院校，藥品生產企業(yè)以及檢定機構對實驗用貓使用量的增加，建立符合我國目前研究水平和應用要求的實驗用貓遺傳質量標準和遺傳質量檢測方法勢在必行。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，相信我國對貓遺傳結構的檢測分析將會更加完善，更多更有效的分子標記技術將會應用于貓的遺傳質量檢測中。