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    生物物證DNA污染的成因與預(yù)防

    2019-02-17 03:55:18張飛黎波
    生物化工 2019年3期
    關(guān)鍵詞:檢材物證試劑

    張飛,黎波

    (新疆警察學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000)

    生物物證作為證據(jù)物證的一種,主要包括人源性生物物證和非人源性生物物證[1]。人源性物證主要包括骨片、毛發(fā)、組織塊、血痕等組織器官,精液(精斑)、唾液(唾液斑)、糞便、尿、羊水、嘔吐物等分泌物和排泄物,此外還有指紋、唇紋、咬痕、足跡(赤足)等。非人源性生物物證主要有動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)和微生物等物證,如某些動(dòng)物的血液(痕)、體液(斑),某些植物的液汁或其斑痕及其提取物等,一些可用以推斷死后間隔時(shí)間和所到區(qū)域的昆蟲(chóng)或土壤中含有的包括各種細(xì)菌、真菌在內(nèi)的微生物等群體。

    生物物證技術(shù)是在傳統(tǒng)法醫(yī)物證檢驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興學(xué)科,廣泛應(yīng)用于刑事、民事案件的偵查檢驗(yàn)、鑒定。該學(xué)科涉及生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)等多門(mén)自然學(xué)科[2]。因此,生物物證在自然科學(xué)技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上,在刑事案件中對(duì)于人源性生物檢材的種屬認(rèn)定起到關(guān)鍵性作用。隨著DNA提取技術(shù)以及二代測(cè)序技術(shù)的不斷完善,高通量測(cè)序在刑事案件人源性生物檢材的分析越來(lái)越受到重視[3-6]。然而,在實(shí)際生物物證DNA的提取和檢測(cè)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生檢材污染的問(wèn)題,無(wú)論是勘查提取人員的污染還是分析檢驗(yàn)人員的污染都不可避免,嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本文針對(duì)DNA樣品提取分析過(guò)程常見(jiàn)的污染進(jìn)行分析討論,并提出可行性建議,以期減少檢驗(yàn)過(guò)程的樣品污染。

    1 生物物證DNA的污染

    造成DNA實(shí)驗(yàn)污染的因素主要分為外因和內(nèi)因,外因主要有:(1)自然形成的污染,主要是生物檢材暴露在環(huán)境中受到雜物的污染;(2)勘察人員在發(fā)現(xiàn)、運(yùn)輸、提取時(shí)造成的污染;(3)發(fā)生在物證流轉(zhuǎn)過(guò)程中導(dǎo)致的污染。內(nèi)因主要有實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用試劑污染、氣溶膠污染、核心設(shè)備污染,此類污染發(fā)生在物證檢驗(yàn)過(guò)程中,不易發(fā)現(xiàn)。

    1.1 環(huán)境對(duì)生物檢材的污染

    環(huán)境對(duì)生物檢材的污染是最普遍也是不可避免的,由于勘查人員勘查的是靜態(tài)的現(xiàn)場(chǎng),是經(jīng)過(guò)作案人干擾過(guò)或作案人處理過(guò)的現(xiàn)場(chǎng),有很多的不確定因素在里面,例如掉在血泊中的煙蒂、帶血的手套、水中的衣物、拋棄在垃圾桶中的物證等等,這些生物檢材在檢測(cè)過(guò)程中都會(huì)受到周圍環(huán)境的污染和干擾。特別是微生物細(xì)胞,或少量的人體脫落細(xì)胞等的污染,研究結(jié)果顯示,至少20個(gè)口腔上皮細(xì)胞或30個(gè)精子細(xì)胞檢測(cè)運(yùn)用Identifiler plus PCR試劑盒(美國(guó)AB公司)檢測(cè),可以獲得全部分型。因此,越微量的物證越容易被污染。此類污染即使是微生物DNA片段在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)也會(huì)被擴(kuò)增出來(lái)無(wú)法去除,導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果從而干擾分析。

    1.2 生物檢材勘查提取過(guò)程造成的污染

    現(xiàn)場(chǎng)勘察人員徒手提取物證,或使用未經(jīng)過(guò)消毒滅菌的器具提取物證,以及未及時(shí)更換一次性手套、剪刀、鑷子等情況都容易使樣品污染,另外勘察人員使用吸附性較好棉手套提取造成的吸附性污染,現(xiàn)場(chǎng)物證在運(yùn)輸時(shí)使用的包裝袋混裝、包裝袋破損泄露、包裝袋反復(fù)使用,物證袋生產(chǎn)環(huán)節(jié)出現(xiàn)污染等因素,都可以使檢材受到干擾,誤導(dǎo)檢驗(yàn)結(jié)果。

    提取過(guò)程造成的污染,主要是生物物證在實(shí)驗(yàn)室提取檢驗(yàn)時(shí),操作人員操作不規(guī)范或者環(huán)境不達(dá)標(biāo)等。例如物證進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后,檢驗(yàn)人員初檢不認(rèn)真,使用不潔器具操作,或者未及時(shí)更換PE離心管、移液槍槍頭等一次性耗材,未清洗或未按規(guī)定更換上樣膠墊等,都容易造成樣本提取時(shí)交叉污染。或者是檢測(cè)人員在檢測(cè)過(guò)程中不小心將自己的唾液或皮屑混入到檢材中,導(dǎo)致“烏龍檢材”的出現(xiàn),也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。

    1.3 DNA純化試劑、氣溶膠的污染

    試劑在配制分裝過(guò)程造成的污染,尤其是移液器操作不當(dāng),最容易造成污染。特別在PCR擴(kuò)增中最容易導(dǎo)致污染,因?yàn)樵赑CR擴(kuò)增過(guò)程中,擴(kuò)增的DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的,經(jīng)過(guò)n個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增,一個(gè)DNA分子的產(chǎn)量便達(dá)到2n個(gè)拷貝。PCR產(chǎn)物一般為 1013拷貝 /mL,取 0.1 mL 即為 109拷貝,而 1 mg人基因組DNA才含1.4×106拷貝的單拷貝基因片段。PCR反應(yīng)具有強(qiáng)大的擴(kuò)增效率,使得極微量的污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

    另一種是氣溶膠的污染,主要是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體,又稱氣體分散體系。分散相為固體或液體小質(zhì)點(diǎn),其大小為10-3~10-7cm,分散介質(zhì)為氣體。氣溶膠污染的一般原因是離心管管蓋松懈導(dǎo)致泄露,在PCR反應(yīng)中,有高溫、低溫的周期性循環(huán),高溫時(shí),擴(kuò)增反應(yīng)液蒸汽溢出,擴(kuò)增儀頂蓋密封不嚴(yán),多次擴(kuò)增不斷累積,達(dá)到足夠濃度時(shí)造成污染。此類污染難以清除,難以預(yù)測(cè)[7]。

    1.4 核心設(shè)備污染

    在提取、純化、擴(kuò)增生物檢材DNA時(shí),常用的儀器設(shè)備有高速冷凍離心機(jī)、恒溫振蕩儀、PCR擴(kuò)增儀、3030XL遺傳學(xué)分析儀等設(shè)備。不按規(guī)定及時(shí)清洗,造成DNA產(chǎn)物分子級(jí)別堆積,形成設(shè)備內(nèi)部污染。比如,有些檢驗(yàn)人員在使用PCR擴(kuò)增儀時(shí),剛擴(kuò)增完成就急于打開(kāi)設(shè)備取樣,由于PCR擴(kuò)增儀溫度還未降下來(lái),反應(yīng)體系也處于高溫狀態(tài)下,高溫膨脹使管蓋蹦出,會(huì)形成交叉污染。

    2 生物檢材DNA污染對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響

    DNA污染可能導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn),干擾DNA分型圖譜的分析,誤導(dǎo)偵查人員。DNA污染可能會(huì)產(chǎn)生原本沒(méi)有的DNA信息,也可能會(huì)抑制、消除或完全覆蓋原有的DNA信息,從而造成嚴(yán)重后果[7]。比如可能在原本沒(méi)有犯罪嫌疑人DNA樣本的檢材上檢測(cè)出他的DNA,錯(cuò)誤地刻畫(huà)犯罪嫌疑人,導(dǎo)致錯(cuò)誤的案件定性,錯(cuò)誤地推斷作案人數(shù)、作案人的性別等。這些都會(huì)誤導(dǎo)偵查方向,延誤破案時(shí)間。

    3 預(yù)防生物檢材DNA污染的策略

    在生物檢材DNA降低污染過(guò)程中,要做好“人防”和“物防”兩方面的工作,“人防”主要指在現(xiàn)場(chǎng)勘查中進(jìn)行生物檢材提取時(shí),勘察人員首先應(yīng)樹(shù)立防污染的意識(shí),首先做好自我保護(hù),做到不污染樣品的同時(shí)也不讓樣品污染自己,勘查提取前先戴好口罩、帽子、防護(hù)服等必要措施,檢查勘查提取工具是否潔凈,確保樣品在源頭無(wú)污染,尤其是防止外來(lái)人源性污染。檢材越微量,越應(yīng)防止外來(lái)人源性污染;因?yàn)闄z材越微量,PCR檢驗(yàn)對(duì)外來(lái)人源性污染越敏感?!拔锓馈敝饕冈趯?shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)程中防止實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、核心設(shè)備等對(duì)樣品的污染。

    3.1 遵守行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),按程序進(jìn)行提取與檢驗(yàn)

    現(xiàn)場(chǎng)勘查人員、檢材送檢人員、物證鑒定人員在生物檢材提取、送檢、檢驗(yàn)過(guò)程中,必須按照中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《法醫(yī)學(xué)物證檢材的提取、保存與送檢》(GA/T169—1997)規(guī)定的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行操作。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中嚴(yán)格按照儀器的操作規(guī)程進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)試劑的使用要符合標(biāo)準(zhǔn),不可使用過(guò)期或污染的試劑。特別是DNA提取過(guò)程使用的試劑,比如酶、超純水、提取液等,都應(yīng)該進(jìn)行分裝和隔離保管。最應(yīng)注意的是移液槍槍頭的使用,必須是一次性的,按照一種試劑一個(gè)槍頭、一個(gè)樣品一個(gè)槍頭的原則,不可重復(fù)使用,交叉使用。

    3.2 做好污染監(jiān)測(cè)設(shè)置對(duì)照

    必須要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè),監(jiān)測(cè)樣品是否受到污染。通過(guò)有效的監(jiān)測(cè),采取正確的相應(yīng)措施,防止或消除污染。另外對(duì)照試驗(yàn)也是監(jiān)測(cè)DNA污染的重要手段,所以無(wú)論是擴(kuò)增還是遺傳學(xué)分析都應(yīng)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照是每次PCR實(shí)驗(yàn)都必須做的,它包括了標(biāo)本對(duì)照與試劑對(duì)照,通過(guò)對(duì)照確認(rèn)樣本和試劑是否受到污染。陽(yáng)性對(duì)照是對(duì)預(yù)期結(jié)果而設(shè)置的,它是PCR反應(yīng)是否成功的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。

    3.3 人才培養(yǎng)與培訓(xùn),提高行業(yè)人員能力

    定期對(duì)相關(guān)人員包括現(xiàn)場(chǎng)勘查人員、檢材送檢人員、物證鑒定人員,進(jìn)行業(yè)務(wù)培訓(xùn)和專業(yè)知識(shí)學(xué)習(xí),提高現(xiàn)場(chǎng)勘查能力和防污染意識(shí),改變以往的“老牌作風(fēng)”和“經(jīng)驗(yàn)主義”,加強(qiáng)規(guī)范操作,確保檢材質(zhì)。

    3.4 實(shí)驗(yàn)室布局與環(huán)境要求要達(dá)標(biāo)

    生物物證受理室要和檢驗(yàn)區(qū)完全隔離開(kāi),初步處理室物品要按照受理順序排好序,并保持潔凈,檢驗(yàn)人員在進(jìn)行物證初級(jí)處理室做好防護(hù),這是保證樣品不污染的第一道程序。原始試劑混配室應(yīng)為正壓間,操作過(guò)程在超凈臺(tái)內(nèi)完成,須防止其他程序功能間對(duì)本操作間的污染[8]。PCR擴(kuò)增室應(yīng)為微負(fù)壓區(qū)域,必須設(shè)置排風(fēng)系統(tǒng),以防止大量擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)散污染其他程序功能間。檢測(cè)室也應(yīng)為微負(fù)壓間,也必須設(shè)置排風(fēng)系統(tǒng),以防止擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳測(cè)序過(guò)程中的擴(kuò)散污染;整個(gè)區(qū)域要注意溫度控制,因?yàn)镈NA分析儀及其他分析設(shè)備散熱量較大,會(huì)提高室內(nèi)溫度3~5 ℃,所以應(yīng)做好溫度檢測(cè)。

    所有實(shí)驗(yàn)區(qū)域要進(jìn)行定期消毒滅菌,紫外燈滅菌在開(kāi)展實(shí)驗(yàn)的2 h前進(jìn)行,檢驗(yàn)區(qū)域溫度控制在23℃左右。定時(shí)清洗維護(hù)核心設(shè)備,確保結(jié)果準(zhǔn)確。

    4 結(jié)語(yǔ)

    生物物證檢材是DNA分析的原材料,避免檢材的污染問(wèn)題必須做好“人防”和“物防”兩方面的工作,這是做好防止污染的第一步,防止DNA檢材污染,必須引起基層公安機(jī)關(guān)物證提取人員的高度重視,這不僅是相關(guān)檢驗(yàn)人員的責(zé)任,也是整個(gè)法庭科學(xué)從業(yè)人員和刑事科學(xué)技術(shù)人員的責(zé)任[9-10]。相關(guān)從業(yè)人員應(yīng)該提高自身技能、積極參加培訓(xùn),在實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)勘查過(guò)程和檢驗(yàn)中,嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作,嚴(yán)控管理實(shí)驗(yàn)室環(huán)境衛(wèi)生,才能保障DNA鑒定結(jié)論的真實(shí)客觀,才能為法庭科學(xué)提供可靠依據(jù)。本文重點(diǎn)介紹了生物物證檢材在現(xiàn)場(chǎng)勘查和分析提取過(guò)程中常見(jiàn)的DNA污染途徑和環(huán)節(jié),并針對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)提出了可行性的建議,有望為檢驗(yàn)人員在生物物證提取、保存、送檢和檢驗(yàn)等過(guò)程中提供參考。

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