TGF-β1與自噬基因Beclin1、LC3在椎間盤退變組織中的表達(dá)*

蘇程果， 趙小艷，劉華輝，盧群文，袁 曄，羅才貴，朱明雙△

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(成都 610075)；2.四川寶石花醫(yī)院 (成都 610213)

椎間盤退變是腰腿痛的重要誘因，而腰腿痛嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也為患者、患者家庭、社會帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。目前椎間盤退變的機(jī)制和治療方法仍需進(jìn)一步研究。相關(guān)研究[1]表明，炎性反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)的分解、纖維環(huán)的破裂、椎間盤細(xì)胞的死亡等在椎間盤的退行性變過程中起關(guān)鍵作用。其中椎間盤髓核細(xì)胞數(shù)量的減少是椎間盤退變的關(guān)鍵因素，而細(xì)胞自噬對髓核細(xì)胞死亡有著重要的調(diào)控作用[2-3]，Beclin1與LC3均為自噬相關(guān)基因，參與自噬體的形成[4]。TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長因子, 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化，與椎間盤退變關(guān)系密切。本研究主要觀察兔椎間盤退變組織中TGF-β1與Beclin1、LC3的表達(dá)，亦進(jìn)一步探討椎間盤退變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物為4月齡新西蘭大白兔20只，體重為2.0～2.5 kg，購買于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號為: SCXK(川) 2018-17，研究符合動物實(shí)驗(yàn)倫理許可。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

RNA提取液(武漢Servicebio),三氯甲烷(上海國藥集團(tuán))；無水乙醇(上海國藥集團(tuán))；HyPure TMMolecular Biology Grade Water(美國HyClone) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo)FastStart Universal SYBR Green Master(美國Roche)引物(成都生工)；新型脫鈣液(北京索萊寶)；氫氧化鈉(上海滬試)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)器械

臺式高速冷凍離心機(jī)(DragonLab)；熒光定量PCR儀(ABI)；超微量分光光度計(jì)(Thermo)；標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀(青島富勒姆)；勻漿儀(AKI生物)；超低溫冰箱(海爾)；TIP頭(Axygen Biosciences)；脫水機(jī) (武漢俊杰電子有限公司) ；包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；凍臺(武漢俊杰電子有限公司)；攪拌(DRAGONLAB)；恒溫?fù)u床(BLabotery)；電子秤(Electronic)；18 G穿刺針。

1.4 方法

1.4.1 造模 借鑒黃杰烽等[5]的穿刺纖維環(huán)法制作椎間盤退變模型。20只白兔隨機(jī)分成兩組，空白組和模型組，每組10只。兔腰椎節(jié)段共7節(jié)，L1至L7的椎體和其間的椎間盤漸漸變大，腰椎的橫突與脊柱成銳角，向白兔頭側(cè)發(fā)出，且橫突長度從L1至L7漸漸增大；兔腰椎間盤位于橫突起點(diǎn)前上方2.0～3.0 mm處[6]，呈乳白色。模型組按3 mL/kg耳緣靜脈注射10%水合氯醛麻醉，俯臥位固定好，備皮消毒，髂棘高點(diǎn)平對 L6椎體，用筆依次標(biāo)記各段腰椎。然后觸摸L5、L6的橫突，左手拇指定位在兩橫突末端連線中點(diǎn)，右手持針在定位點(diǎn)上方約1 cm處與地面水平破皮，然后針向頭側(cè)略傾斜即刺入 L4-5椎間盤，此時(shí)針下會有滯澀沉緊感。再穿刺L3-4、L5-6椎間盤，左右各1次。術(shù)后連續(xù) 3 d肌注青霉素40萬U/只?？瞻捉M不予特殊處理。

1.4.2 標(biāo)本采集 6周后截取白兔第L3至L6腰椎及其間的椎間盤組織，每組隨機(jī)選6個(gè)椎間盤放入-80°冰箱保存；另外每組隨機(jī)選8個(gè)椎間盤放入體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中固定24 h，預(yù)備做石蠟切片。

1.4.3 觀察與檢測 1)蘇木精-伊紅(HE)染色檢測椎間盤組織形態(tài)學(xué)變化。標(biāo)本24 h固定后，用新型脫鈣液脫鈣2個(gè)月，脫鈣液更換周期為2～3 d。然后依次梯度酒精進(jìn)行脫水，75%酒精2 h，85%酒精2 h，90%酒精1.5 h，95%酒精2 h ,無水乙醇Ⅰ 2 h，無水乙醇Ⅱ 2 h，醇苯40 min，二甲苯Ⅰ 40 min，二甲苯Ⅱ 40 min，65°融化石蠟Ⅰ 0.5 h，65°融化石蠟Ⅱ 1 h，65°融化石蠟Ⅲ 2.75 h。再進(jìn)行石蠟包埋、以4 μm厚度切片，切片在攤片機(jī)40 ℃ 溫水上將組織展平，載玻片將組織撈起，60 ℃ 烘箱內(nèi)烤干。水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笤诠忡R下觀察椎間盤組織形態(tài)學(xué)變化，根據(jù)Han等[7-8]從髓核形態(tài)、髓核中細(xì)胞和基質(zhì)形態(tài)、纖維環(huán)形態(tài)、纖維環(huán)中細(xì)胞的基質(zhì)形態(tài)、纖維環(huán)和髓核的分界來評價(jià)椎間盤退變程度，分值5～15分，5分為正常椎間盤，15分為嚴(yán)重退變椎間盤。2 )RT-PCR檢測TGF-β1與beclin1、LC3的表達(dá)。先抽提總RNA，取100 mg組織加入到含有1 mL，離心的Trizol Reagent勻漿管中充分研磨，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心半徑5.5 cm，離心10 min，取上清；加入250 μL三氯甲烷后離心取上清，加入0.8倍體積的異丙醇離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA；加入15 μL無RNA酶的水溶解RNA，55 ℃孵育5 min；使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度。取2 μg RNA按照試劑盒操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和定量PCR，結(jié)果處理采用ΔΔCT法計(jì)算TGF-β1與beclin1、LC3的表達(dá)量。引物序列如下表(表1)。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組椎間盤組織形態(tài)學(xué)評分

空白組椎間盤組織的軟骨樣基質(zhì)中分布著形態(tài)一致的髓核細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)排列均勻，髓核與纖維環(huán)分界清晰，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整，排列清晰。模型組髓核細(xì)胞大量減少，髓核形狀不規(guī)則，間質(zhì)排列紊亂，局部纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂；纖維環(huán)和髓核界限多不清晰?？瞻捉M和模型組組織形態(tài)學(xué)評分分別為(5.25±0.46)、(10.25±1.75)分，模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明穿刺纖維環(huán)法促進(jìn)了椎間盤的退變(圖1)。

圖1 HE染色結(jié)果

注： A:髓核細(xì)胞較少，髓核與纖維環(huán)界限不清(黑色箭頭)，纖維環(huán)內(nèi)層可見少量嗜酸性小碎片(紅色箭頭)；B：髓核內(nèi)纖維結(jié)締組織輕度增多(黃色箭頭)。C、D：空白組大小形態(tài)相似的的圓形髓核細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)均勻一致，髓核與纖維環(huán)分界清晰，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整，排列清晰

2.2 椎間盤組織中TGF-β1、Beclin1、LC3的mRNA表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)6周后，相對于空白組，模型組TGF-β1、Beclin1、LC3的mRNA表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

組別TGF-β1Beclin1CL3空白組1.78±0.471.03±0.411.70±1.44模型組26.22±10.7913.53±3.2116.86±8.26t5.549.454.43P<0.001<0.0010.006

3 討論

TGF-β是一種具有多種生物功能的蛋白多肽細(xì)胞因子,由正常組織細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生,且TGF-β1有廣泛的生物學(xué)作用，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的活力與程序性細(xì)胞死亡[9]。TGF-β1具有促進(jìn)椎間盤間充質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的作用,對機(jī)體脊柱中椎間盤的生長、發(fā)育及分化方面起重要作用。椎間盤退變與TGF-β1的表達(dá)有密切聯(lián)系。Tolonen等[10]通過ELISA及PT-PCR實(shí)驗(yàn)證明了，TGF-β1可在椎間盤退變細(xì)胞高度表達(dá),且TGF-β1與椎間盤退變程度呈顯著正相關(guān)[11]。而椎間盤細(xì)胞的自噬和程序性細(xì)胞死亡與椎間盤的退變過程緊密關(guān)系,TGF-β1 作為調(diào)控脊柱發(fā)育及穩(wěn)態(tài)維持的重要因子，可能參與椎間盤的自噬及退變過程[8]。

自噬目前被認(rèn)為是與年齡有關(guān)的疾病或變性疾病的重要保護(hù)機(jī)制，是一種細(xì)胞分解代謝途徑，導(dǎo)致溶酶體降解以及蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的再循環(huán)[12]。而LC3和Beclin 1為自噬小體標(biāo)志物，常用以評價(jià)細(xì)胞自噬的程度[13]。LC3分Ⅰ型和Ⅱ型，當(dāng)自噬發(fā)生，Ⅰ型 LC3經(jīng)泛素樣加工修飾過程與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合， 變成Ⅱ型 LC3，Ⅱ型 LC3蛋白結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量與自噬泡數(shù)目呈正相關(guān)[4]。Beclin1為哺乳動物酵母Atg6基因的同源物，其通過與Ⅲ 型磷脂酰肌醇激形成復(fù)合物參與募集其他蛋白質(zhì)，促進(jìn)自噬體膜的形成，并引導(dǎo)其他Atg蛋白定位于自噬體膜[14]。LC3、Beclin1的表達(dá)可明確細(xì)胞內(nèi)自噬水平。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，自噬的活性隨年齡和早期變性而降低。但也有相互矛盾的結(jié)果，非退行性成年大鼠的髓核細(xì)胞中可觀察到低水平的自噬[16]，而退行性大鼠髓核細(xì)胞中自噬水平顯著增加[2]。幾種可能的原因可解釋自噬活性的組織差異。首先，實(shí)驗(yàn)椎間盤可能處于椎間盤退變過程的不同時(shí)期；再者，可能與干預(yù)措施有關(guān)，且自噬和程序性細(xì)胞死亡可并存[12]。

本研究HE染色結(jié)果顯示，模型組的椎間盤組織形態(tài)發(fā)生一定的變化，表明穿刺纖維環(huán)促進(jìn)了椎間盤的退變。RT-PCR結(jié)果表明，模型組椎間盤中TGF-β1、Beclin1、LC3的mRNA相對表達(dá)量均顯著升高。正常椎間盤中TGF-β1的低含量表明，TGF-β1對正常的椎間盤有調(diào)節(jié)作用，而退變椎間盤中髓核細(xì)胞的改變可能刺激TGF-β1高表達(dá)，TGF-β1的增高可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞活力、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝和細(xì)胞自噬等相關(guān)。空白組中的椎間盤中有低水平自噬，亦表現(xiàn)了自噬在正常椎間盤髓核細(xì)胞中的生物學(xué)作用，而模型組椎間盤中退變椎間盤自噬基因Beclin1、LC3表達(dá)量均顯著增高。而自噬作為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡發(fā)生在組織和器官的發(fā)育過程中，自噬既能發(fā)揮保護(hù)作用，也能促進(jìn)細(xì)胞死亡，細(xì)胞自噬亦有助于防止髓核細(xì)胞退變[17]。

綜上所述，本研究模型組退變椎間盤中TGF-β1、細(xì)胞自噬的表達(dá)增加，推測是對白兔退變椎間盤的一種調(diào)節(jié)機(jī)制。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于進(jìn)一步了解椎間盤退變的機(jī)制，TGF-β1與自噬基因Beclin1、LC3相互關(guān)系還需進(jìn)一步研究。