HPLC法測(cè)定遠(yuǎn)志橙皮口服液中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和橙皮苷的含量

趙 麗，王顯鳳

1．成都市第七人民醫(yī)院 藥劑科(成都 610041)；2. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院 藥學(xué)部(重慶 400042)

遠(yuǎn)志橙皮口服液是由遠(yuǎn)志酊、橙皮酊等組成的鎮(zhèn)咳祛痰復(fù)方制劑，臨床主要針對(duì)上呼吸道感染及肺炎所致的咳嗽、咯痰等癥狀，其療效肯定。遠(yuǎn)志酊是遠(yuǎn)志流浸膏加60%乙醇混合去除不溶性雜質(zhì)制成的酊劑[1]，對(duì)痰不易咳出的咳嗽效果明顯；橙皮酊是以橙皮為原料提取加工制成的酊劑[2]，對(duì)痰多引起的咳嗽效果明顯。目前，由于該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚缺乏對(duì)遠(yuǎn)志酊和橙皮酊的含量測(cè)定，影響了其臨床應(yīng)用。本研究擬采用HPLC法對(duì)遠(yuǎn)志橙皮口服液中遠(yuǎn)志酊所含細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和橙皮酊所含橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定[3-4]，在確保臨床用藥安全有效的同時(shí)進(jìn)一步加強(qiáng)其質(zhì)量穩(wěn)定可控。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Agilent 1200系列安捷倫高效液相色譜儀(Agilent Chemstation工作站，安捷倫科技有限公司)； 賽多利斯 BT25S 電子天平[Max 21 g,d=0.01 mg,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；KQ-500E型超聲波清洗器(頻率：40 kHz，超聲電功率：500 W，清洗容量：22.5 L,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.1.2 試劑 國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷(使用前不需要干燥處理，2～10 ℃保存，批號(hào)：100033-201308，特性量值：含量以91.6% 計(jì)，規(guī)格：20 mg/支)和橙皮苷(使用前不需要干燥處理，2～10 ℃保存，批號(hào)：110721-201115，特性量值：含量以96.1%計(jì)，規(guī)格：20 mg/支)均由其研制發(fā)行單位中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇為B&J ACS/HPLC溶劑，磷酸、鹽酸、正丁醇等均為AR試劑，水為超純水；遠(yuǎn)志橙皮口服液 (自制，批號(hào)：150506-S1、150506-S2和150506-S3)。

1.2 方法

1.2.1 遠(yuǎn)志橙皮口服液細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量測(cè)定 1)色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.05%磷酸溶液(62∶38)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL。2)對(duì)照品溶液制備：打開(kāi)1/10萬(wàn)天平，預(yù)熱穩(wěn)定30 min，取潔凈的10 mL容量瓶放進(jìn)電子天平，待讀數(shù)穩(wěn)定后調(diào)零，加入國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷適量，記錄好稱(chēng)量數(shù)據(jù)，加色譜甲醇超聲使溶解并定容制成0.840 g/L的溶液，再精密吸取適量加色譜甲醇稀釋至濃度為每mL含0.420 mg的溶液，即得。3)供試品溶液制備：精密量取搖勻的遠(yuǎn)志橙皮口服液20 mL置圓底燒瓶中，蒸干，冷至室溫，加入10%NaOH溶液20 mL于容器中，用電熱套加熱回流2 h， 冷至室溫，用滴液管加入HCl試液，搖勻，用潔凈棉簽另一端浸蘸試液在精密試紙(pH 0.5～5.0)上，待試紙顯色在pH值4.0～5.0后，每次用20 mL水飽和正丁醇振搖提取3次，分取正丁醇液，蒸干，放至室溫，加色譜甲醇分次溶解洗脫并轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中定容，搖勻，即得。4)陰性對(duì)照溶液制備：取缺遠(yuǎn)志酊的陰性樣品(按照遠(yuǎn)志橙皮口服液工藝制備)，按“1.2.1.3)”項(xiàng)下同一方法制備，即得。

1.2.2 遠(yuǎn)志橙皮口服液橙皮苷含量測(cè)定 1)色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.1%醋酸溶液(37∶63)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量體積為10 μL。2)對(duì)照品溶液制備：打開(kāi)1/10萬(wàn)天平，預(yù)熱穩(wěn)定30 min，取潔凈的10 mL容量瓶放進(jìn)電子天平，待讀數(shù)穩(wěn)定后調(diào)零，加入國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)橙皮苷適量，記錄好稱(chēng)量數(shù)據(jù)，加色譜甲醇超聲使其溶解并定容制成濃度為0.200 2 g/L溶液，再精密吸取適量加色譜甲醇稀釋至濃度為4.0 mg/L溶液，即得。3)供試品溶液制備：用計(jì)量檢定合格的單刻度胖度移液管吸取搖勻的遠(yuǎn)志橙皮口服液10 mL，加入計(jì)量檢定合格的25 mL棕色容量瓶中，加色譜甲醇至刻度線(xiàn)，超聲10 min， 靜置5 min，取上清液，即得。4)陰性對(duì)照溶液制備：取缺橙皮酊的陰性樣品(按照遠(yuǎn)志橙皮口服液工藝制備)，按“1.2.2.3)”項(xiàng)下方法制備，即得。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分別對(duì)3批遠(yuǎn)志橙皮口服液中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和橙皮苷的含量結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程及其他描述性分析(均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%)采用Excel軟件處理，RSD%值應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2015年版四部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則相關(guān)要求。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說(shuō)明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)志橙皮口服液細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量測(cè)定

2.1.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 按“1.2.1.1)”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定結(jié)果顯示供試品色譜中的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷色譜峰與其他成分色譜峰達(dá)到基線(xiàn)分離，且缺遠(yuǎn)志酊陰性對(duì)照色譜圖中相應(yīng)位置未出現(xiàn)細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷干擾色譜峰(圖1)。

圖1 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品(A)、供試品(B)、陰性樣品(C)HPLC圖

2.1.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別自動(dòng)吸取濃度為0.840、 0.630、0.504、0.420、0.336、0.210和0.042 g/L的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品溶液各10 μL，按“1.2.1.1)”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其峰面積，通過(guò)Excel軟件得到回歸方程為A=3 112.7C-0.142 9，r=0.999 9 (n=7)。結(jié)果表明，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷進(jìn)樣濃度在0.042～0.840 g/L呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品溶液連續(xù)6次進(jìn)樣測(cè)得的峰面積RSD為0.48%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份遠(yuǎn)志橙皮口服液(批號(hào)：150506-S2)，平行測(cè)定每一份樣品的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量，通過(guò)Excel軟件計(jì)算平均含量為0.165 3 g/L，RSD為0.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、1、4、8、12和24 h測(cè)定重復(fù)性項(xiàng)下同一供試品溶液中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰面積的RSD為0.82%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 回收率試驗(yàn) 取搖勻的遠(yuǎn)志橙皮口服液(批號(hào)：150506-S2)，精密量取10 mL，共9份。前3份按80%比例、中間3份按100%比例、后3份按120%比例分別精密加入國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷適量，加水補(bǔ)足至20 mL，按“1.2.1”項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定其含量，通過(guò)Excel軟件計(jì)算細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的回收率，其平均加樣回收率為101.12%，RSD為1.14%(表1)。

表1 遠(yuǎn)志橙皮口服液中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.1.7 含量測(cè)定 取本品3批，每批各3份，搖勻，按“1.2.1”項(xiàng)下細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量測(cè)定方法測(cè)定其含量，結(jié)果顯示3批遠(yuǎn)志橙皮口服液中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 3批遠(yuǎn)志橙皮口服液中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.2 遠(yuǎn)志橙皮口服液中橙皮苷含量測(cè)定

2.2.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按“1.2.2.1)”項(xiàng)下色譜條件分別對(duì)“1.2.2.2)、1.2.2.3)、1.2.2.4)”項(xiàng)下溶液進(jìn)行測(cè)定，在該色譜條件下，缺橙皮酊陰性樣品在橙皮苷對(duì)照品色譜峰位置無(wú)陰性干擾，供試品溶液色譜中的橙皮苷色譜峰與其他成分色譜峰達(dá)到良好的基線(xiàn)分離(圖2)。

圖2 橙皮苷對(duì)照品(A)、供試品(B)、陰性對(duì)照(C)HPLC圖

2.2.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別自動(dòng)吸取10 μL濃度為0.6、1.0、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 mg/L的橙皮苷對(duì)照品溶液，按“1.2.2.1)”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其峰面積，通過(guò)Excel軟件得到回歸方程為A=35.159C-1.292 4，r= 0.999 9(n=7)。結(jié)果顯示橙皮苷在濃度為0.6～40.0 mg/L具有良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 連續(xù)6次自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定同一橙皮苷對(duì)照品溶液的峰面積RSD為0.37%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份遠(yuǎn)志橙皮口服液(批號(hào)：150506-S2)，平行測(cè)定每份樣品的橙皮苷含量，通過(guò)Excel軟件計(jì)算平均含量為4.95 mg/L，RSD為0.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、1、4、8、12和24 h對(duì)重復(fù)性項(xiàng)下供試品溶液測(cè)定橙皮苷峰面積的RSD為0.70%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 回收率試驗(yàn) 取搖勻的遠(yuǎn)志橙皮口服液(橙皮苷含量為4.95 mg/L)，精密量取5 mL，共9份。前3份按80%比例、中間3份按100%比例和后3份按120%比例分別精密加入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)橙皮苷適量，加水補(bǔ)足至10 mL，按“1.2.2”項(xiàng)下橙皮苷測(cè)定方法測(cè)定其含量，橙皮苷的平均加樣回收率為101.93%，RSD為1.03%(表3)。

表3 遠(yuǎn)志橙皮口服液中橙皮苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.7 含量測(cè)定 按前述橙皮苷含量測(cè)定方法，分別對(duì)連續(xù)3批遠(yuǎn)志橙皮口服液(每批隨機(jī)抽取3份樣品)進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果采用方差分析，結(jié)果顯示3批遠(yuǎn)志橙皮口服液中橙皮苷含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 3批遠(yuǎn)志橙皮口服液中橙皮苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

遠(yuǎn)志酊是遠(yuǎn)志流浸膏加60%乙醇混合后去除沉淀雜質(zhì)制成的酊劑，其主要有效成分為具有祛痰、鎮(zhèn)咳、抑菌等作用的遠(yuǎn)志皂苷類(lèi)化合物，但此類(lèi)化合物不穩(wěn)定，可經(jīng)過(guò)堿水解轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的“細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷”[5-6]。橙皮酊是以橙皮為原料加60%乙醇采用滲漉法提取制成，其主要有效成分中橙皮苷含量最高。大量研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，橙皮苷具有祛咳平喘、抗炎等功效。研究[2,9]表明，含遠(yuǎn)志酊和橙皮酊的制劑均相應(yīng)以細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和橙皮苷為該制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和橙皮苷的含量來(lái)控制成品的質(zhì)量。

細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷流動(dòng)相主要以乙腈-0.1%磷酸水溶液和甲醇-0.05%磷酸水溶液兩流動(dòng)相系統(tǒng)為主[9-10]，因前者乙腈毒性大、成本高，故本實(shí)驗(yàn)主要選擇后者進(jìn)行了70∶30，65∶35，62∶38篩選。結(jié)果顯示前兩個(gè)比例的流動(dòng)相細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰在分離度、理論塔板數(shù)等指標(biāo)方面均不及后者，故確定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量測(cè)定的流動(dòng)相最佳條件為甲醇-0.05%磷酸水溶液(62∶38)。橙皮苷流動(dòng)相主要以甲醇-水和甲醇-冰醋酸-水系統(tǒng)為主[11]，最初以簡(jiǎn)單的甲醇-水系統(tǒng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)橙皮苷峰形拖尾嚴(yán)重，分離效果不佳，最終以甲醇-冰醋酸-水系統(tǒng)為基礎(chǔ)篩選以甲醇-0.1%醋酸溶液(37∶63)作為橙皮苷含量測(cè)定的流動(dòng)相最佳條件。

在制備細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷供試品溶液中涉及到樣品揮干的操作中，因水浴加熱揮發(fā)太慢，影響操作時(shí)間，采用電熱套加熱，但在加熱過(guò)程中容器壁容易糊化，需注意溫度的把握，同時(shí)在加熱的同時(shí)輕輕搖動(dòng)容器，將附在壁上的殘?jiān)吹轿磽]干的液體中，待液體快全部揮干時(shí)，關(guān)閉電熱套，并及時(shí)移走，以免殘?jiān)?，影響含量結(jié)果；在制備橙皮苷供試品溶液中涉及到樣品加入甲醇的操作中，操作時(shí)應(yīng)邊振搖邊緩緩加入甲醇，避免橙皮苷被包裹在甲醇沉淀物中，影響含測(cè)結(jié)果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和橙皮苷為指標(biāo)建立的含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠，對(duì)進(jìn)一步完善遠(yuǎn)志橙皮口服液的質(zhì)量控制具有一定的參考價(jià)值。但本研究尚有不足之處：細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷供試品溶液制備方法步驟相當(dāng)繁雜，每個(gè)操作環(huán)節(jié)專(zhuān)注度要求極高，因此對(duì)操作者經(jīng)驗(yàn)要求較高；含量測(cè)定指標(biāo)性成分較少，不能充分控制反映制劑有效性和安全性的有效成分含量及比例變化；不同的指標(biāo)成分用不同的色譜條件，增加了質(zhì)量檢測(cè)成本，耗時(shí)長(zhǎng)。在后續(xù)研究工作中，嘗試同時(shí)測(cè)定本制劑多種反映其內(nèi)部質(zhì)量成分的含量，簡(jiǎn)化供試品溶液制備方法，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間和檢驗(yàn)成本；同時(shí)探索建立該制劑的指紋圖譜，更精準(zhǔn)控制藥品的有效成分含量及比例變化。