蘇云金芽胞桿菌生產(chǎn)菌種的篩選

李 梅

(浦城縣投資開發(fā)公司，福建 浦城 353400)

蘇云金芽胞桿菌簡稱Bt，它可以用于森林、棉花、玉米、蔬菜、水果以及茶、麻、煙葉等作物害蟲，也可用于貯藏害蟲和環(huán)境害蟲的防治，對蔬菜、茶等害蟲的防治效果達(dá)90%以上，且符合國家食品A級標(biāo)準(zhǔn)，是目前全世界公認(rèn)明有效、最有前途的生物農(nóng)藥。Bt是目前我國生產(chǎn)和銷售量最大的一種生物殺蟲劑。

Bt菌種在長期的生產(chǎn)過程中經(jīng)常會出現(xiàn)退化導(dǎo)致減產(chǎn)，選育高產(chǎn)高效的生產(chǎn)菌種是每一個Bt生產(chǎn)單位菌種科室的首要任務(wù)。本文以用凝膠電泳法檢測毒素蛋白為初篩條件進(jìn)行大量初篩，再以小菜蛾生物檢測的效價進(jìn)行復(fù)篩。

1 材料和方法

1.1 菌種

WE-2015-1。

1.2 培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏6%、蛋白胨10%、氯化鈉0.1%、瓊脂2% 1.0 MPa滅菌20 min制成肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2天后檢查無雜菌，接入菌種培養(yǎng)28℃兩天制成出發(fā)菌種備用。

搖瓶培養(yǎng)基：花生粉1.0%、黃豆餅粉3.6%、淀粉：0.5%、酵母粉0.5%、硫酸鎂0.1%、碳酸鈣0.1%、氯化鋅0.05%、磷酸二氫鉀0.1%1.0 MPa滅菌30 min。

1.3 紫外線處理

將培養(yǎng)好的肉湯菌種刮入裝有生理鹽水的平皿中，用功率15 W、波長256 nm的紫外燈距離30 cm處照射1 min，然后進(jìn)行稀釋10-8稀釋自然分離，挑單菌落轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)。

1.4 菌種初篩

第一步初篩：將經(jīng)過紫外線處理并經(jīng)過自然分離的菌株培養(yǎng)于肉湯斜面28℃培養(yǎng)2天，用品紅染色液涂片染色鏡檢伴孢晶體的形態(tài)。保留伴孢晶體形態(tài)規(guī)則、一致、個體較大的或者有特點的菌株進(jìn)行下一步篩選。

第二步初篩：經(jīng)過第一步初篩過的選出的菌株，接入搖瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)40 h后用品紅染色液涂片鏡檢生長較好并且用凝膠電泳法檢測毒素蛋白高于出發(fā)菌株10%的菌種保留進(jìn)行下一步的復(fù)篩。

1.5 菌種復(fù)篩

第一步復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)40 h后鏡檢生長正常，用小菜蛾做生物檢測毒力效價高于原出發(fā)菌株10%的菌株保留進(jìn)行下一步的復(fù)篩。

第二步的復(fù)篩：將第一次復(fù)篩得到的菌株接入100 L的中試罐中培養(yǎng)基中30℃、180 r/min通氣量1∶1條件下培養(yǎng)40 h鏡檢生產(chǎn)正常，用小菜蛾做生物檢測毒力穩(wěn)定的菌株作為生產(chǎn)菌種或者作為下一步選育的出發(fā)菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

經(jīng)過紫外線誘變處理后，挑單菌菌傳斜面培養(yǎng)鏡檢菌株共2100個，第一步初篩留 種率控制在25%左右，第二步初篩留種率控制在30%左右，最后共挑選150個菌落進(jìn)入復(fù)篩。經(jīng)過兩次復(fù)篩，選擇了WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968用于生產(chǎn)和下一步的選育。

2.2 篩選效果

第一步復(fù)篩150個菌株發(fā)酵平均效價3860 IU/mL，比對照3199 IU/mL高20.66%。

第一步復(fù)篩150個菌株中，有15株發(fā)酵效價比對照的低15%，占總數(shù)的10%；有30株發(fā)酵效價比結(jié)照的高20%以上，占總數(shù)的20%；有52株的發(fā)酵效價比對照的高10%以上，占總數(shù)的33.66%。

從上述的結(jié)果可以看出，初篩得到的菌株大部分是正突變。經(jīng)過初篩可以大大減少生物檢測量。

2.3 WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968菌株在生產(chǎn)應(yīng)用

經(jīng)過多次復(fù)篩，得到的菌株WE-2015-1-156、WE-2015-1-899、WE-2015-1-1968 ，在生產(chǎn)中應(yīng)用WE-2015-1-156共生產(chǎn)120批，平均效價4560 IU/mL，高于去年平均3920 IU/mL，提高了16.07%；WE-2015-1-899生產(chǎn)99批，平均效價4490 IU/mL，比去年提高了14.54%，WE-2015-1-1968生產(chǎn)80批，平均效價4450 IU/mL，比去年提高了13.52%。

3 討論

初篩和復(fù)篩各進(jìn)行兩步，初篩的兩步主要是考慮固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時其伴孢晶體可能不一致，初篩采用凝膠電泳法檢測毒素蛋白，是因為此方法快速簡便。能在短時間內(nèi)處理大量的菌株。

復(fù)篩分兩步主是減少生物測定的工作量，用中試罐進(jìn)行第二次復(fù)篩是因為搖瓶與生產(chǎn)的條件存在差異，用小菜蛾進(jìn)行生物毒力效價測定是為了保證用于生產(chǎn)的菌種銜定用高產(chǎn)。

綜上所述，以伴孢晶體的形態(tài)和毒素蛋白的含量為指標(biāo)，進(jìn)行固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩次初篩，以搖瓶發(fā)酵液和中試罐發(fā)酵液小菜蛾做生物毒力測定進(jìn)行復(fù)篩，以提高正突變被選 中概率、提高菌種的選育效率，是Bt生產(chǎn)單位菌種選育的一種較好可行的方法。