上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化促肺纖維化機(jī)制及藥物干預(yù)治療的研究進(jìn)展*

王 源，李萬(wàn)成

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科 (成都 610500)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是各種間質(zhì)性肺疾病(如過(guò)敏性肺炎、石棉沉著病、 肺淋巴平滑肌瘤病)的最終病理表現(xiàn)[1]。其中，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchyma transition，EMT)被認(rèn)為在PF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2]。EMT是指在特定的生理及病理?xiàng)l件下，上皮細(xì)胞失去極性，上皮細(xì)胞形態(tài)改變，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘素(E-Cadherin)等丟失或表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)上調(diào)，最終使得細(xì)胞黏附能力減弱，增殖和遷移能力增強(qiáng)[3]。在 PF病理過(guò)程中，EMT的發(fā)生發(fā)展受到多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，多種抑制或逆轉(zhuǎn)EMT的藥物有利于改善PF，其有望成為PF藥物治療的重要研究方向。

1 EMT參與調(diào)控PF的相關(guān)信號(hào)通路

1.1 Wnt信號(hào)通路

目前，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路主要有3條傳導(dǎo)途徑，包括經(jīng)典通路: Wnt /β-鏈蛋白(β-catenin)信號(hào)通路，非經(jīng)典傳導(dǎo)通路: Wnt /JNK 信號(hào)通路和Ca2+介導(dǎo)的Wnt /Ca2+途徑[4]。 研究[5]發(fā)現(xiàn)，包括有Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a在內(nèi)的19種Wnt蛋白，其中參與 Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的種類有 Wnt2、Wnt3、Wnt8b 等，而參與非經(jīng)典信號(hào)通路的種類有Wnt6、Wnt7b、Wnt10a等。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控 EMT 發(fā)生發(fā)展的重要信號(hào)通路。其構(gòu)成包括: 分泌蛋白Wnt家族，分泌型卷曲蛋白相關(guān)蛋白( secreted frizzled-related protein， sFRP) 、家族蛋白激酶 2A(protein phosphatase 2A，PP2A)、跨膜受體(Frizzled 家族分子 Fz)、酪蛋白激酶(casein kinase 1，CK1)、Dickkopf 蛋白( DKK) 家族、糖原合成酶激酶-3β( Gsk-3β)、β-catenin以及結(jié)腸腺瘤息肉蛋白 (adenomatous polyposis coli，APC)[6]。其調(diào)控機(jī)制為:1)當(dāng)Wnt被激活時(shí),Wnt受體Fz的胞外區(qū)與 Wnt 結(jié)合，通過(guò)下游信號(hào)傳導(dǎo)，使得β-catenin 無(wú)法在細(xì)胞質(zhì)中被降解，此時(shí)β-catenin作為運(yùn)載體介導(dǎo)E-Cadherin與α-catenin 形成復(fù)合物，抑制E-Cadherin活性表達(dá)；2)積聚到一定程度后，β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(TCF /LEF) 形成復(fù)合物，激活下游靶基因如 Snail、Slug轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn) EMT 發(fā)生[7]；3)Wnt信號(hào)活化后，抑制GSK-3β活性，使得β-catenin分解減弱，高濃度的β-catenin將誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)改變，從而調(diào)節(jié)EMT[8]。

1.2 Rho-Rock 信號(hào)通路

Rho-Rock 信號(hào)通路是機(jī)體各器官組織中普遍存在的一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Rho家族蛋白具有三磷酸鳥(niǎo)苷 (guanosine triphosphate, GTP)酶活性，又稱為Rho GTPase，屬于Ras超家族中的GTP結(jié)合蛋白。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，存在有20余種不同Rho蛋白。Rho在細(xì)胞內(nèi)與GDP/GTP結(jié)合態(tài)之間相互轉(zhuǎn)化[9]。目前，研究[10]認(rèn)為，Rho家族蛋白，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，影響細(xì)胞骨架形成，改變細(xì)胞形態(tài)，影響細(xì)胞增殖、黏附能力，進(jìn)而發(fā)揮其多種生物學(xué)效應(yīng)。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase，Rock)為Rho下游靶效應(yīng)分子，接受Rho傳遞的活化信號(hào)，完成自身氨基酸結(jié)構(gòu)域磷酸化改變，介導(dǎo)下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)過(guò)程，從而影響細(xì)胞形態(tài)及功能。

1.3 TGF-β/Smads通路

TGF-β超家族包括25 種相關(guān)蛋白，主要包括 TGF-βs、活化素(activins)、抑制素(inhibins)、生長(zhǎng)分化因子(growth differentiation factors，GDFs)等，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分裂、器官形成、組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。TGF-β為其中最重要亞型，在多種器官組織中表達(dá)，可由內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌，起著細(xì)胞分裂、增殖、分化、凋亡、遷移、刺激細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix, ECM)產(chǎn)生和促使ECM 降解等廣泛的生物學(xué)作用[11]。

TGF-β受體( transforming growth factor-β receptor，TβR)廣泛表達(dá)于各種組織中，TβR有3 種亞型(TGF-β1、TGF-β2 、TGF-β3型)，其中β1型和β2型為信號(hào)傳遞受體，其結(jié)構(gòu)由膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)組成[12]。TβR膜外區(qū)均富含半胱氨酸[13]，被活化的TGF-β與TGF-β2結(jié)合后，磷酸化TβRI的甘氨酸-絲氨酸富集區(qū)域(GS序列)與配體結(jié)合，從而將生物信息向下游傳導(dǎo)[14]。

Smad蛋白為 TGF-β 超家族轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)因子，存在于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，介導(dǎo)TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞核。目前，研究[15]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)存在有9 種Smads 蛋白，分為3大亞型：1)膜受體調(diào)控型 Smads(R-Smads)，包括有Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和 Smad8，其中 Smad2 和 Smad3 與 TGF-β1結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，與下游靶基因的特定部位結(jié)合，參與TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；2)共同通路型 Smads(Co-Smads)：Smad4、Smad10, 其中Smad4 與R-Smad 結(jié)合后形成異源復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄；3)抑制型Smads(I-Smads)：Smad 6、Smad 7，對(duì) TGF-β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起負(fù)性調(diào)控作用。TGF-β 信號(hào)通路包括經(jīng)典Smad信號(hào)通路和非經(jīng)典Smad 信號(hào)通路。經(jīng)典Smad信號(hào)通路是TGF-β發(fā)揮致纖維化作用的主要途徑，TGF-β其他信號(hào)通路包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、JNK、PI3K激酶等。經(jīng)典Smad信號(hào)和非Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間相互作用影響。

2 抑制或逆轉(zhuǎn)EMT為治療靶點(diǎn)的藥物

2.1 Wnt 通路抑制劑

Wnt 信號(hào)通路抑制劑在治療PF中發(fā)揮重要作用，主要機(jī)制為阻斷Wnt 信號(hào)通路激活及抑制下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)。Wnt 信號(hào)通路的抑制劑包括分泌蛋白家族 (the secreted frizzled related proteins，sFRp)、Wnt 抑制蛋白(wnt inhibitory protein，WIF)、Wnt ibitoryfactor-1(WIF-1)、Cerberus(CER)、Dickkopf(Dkk)蛋白家族。 Dkk-1 為 Dkk 蛋白家族中一員，是一種 LRP5/6 拮抗配體。Sun等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Dkk-1 可以抑制 Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)通路，促使肺間充質(zhì)干細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，修復(fù)受損的肺上皮細(xì)胞，延緩大鼠肺纖維化進(jìn)程。依那西普是人源腫瘤壞死因子(TNF-α)拮抗劑，它被廣泛用于風(fēng)濕性疾病，是炎癥因子靶點(diǎn)。動(dòng)物模型研究[16]顯示，給予依那西普干預(yù)后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠Wnt1、Wnt3a、Wnt4表達(dá)下調(diào)，表明依那西普可以抑制PF進(jìn)展。在博來(lái)霉素導(dǎo)致PF模型中，以馬提尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，可減少β-catenin表達(dá)，上調(diào)GSK-3β表達(dá)，從而抑制纖維化發(fā)生[17]。Tang等[18]研究吡非尼酮治療PF，結(jié)果顯示，治療后肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，浸潤(rùn)面積縮小，肺泡灌洗液中IL-1 、SMA、Fn、FSP1 等標(biāo)志物濃度下降，PF癥狀明顯改善。

2.2 Rho-Rock 信號(hào)通路抑制劑

張冬梅等[19]研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA 可緩解 BLM 誘導(dǎo)的肺組織膠原蛋白沉積和M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，增加肺組織上皮E-cadherin表達(dá)，降低肺成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞 Rho A、Rho C、Rock1水平，表明丹參酮ⅡA可通過(guò)阻斷 Rock信號(hào)通路的活化，抑制肺纖維細(xì)胞增殖和活化，減少ECM沉積，緩解BLM所致的大鼠PF改變。此外，Jiang 等[20]通過(guò)建立BLM誘導(dǎo)PF模型發(fā)現(xiàn)，法舒地爾是一種人工合成的異喹啉磺胺衍生物,可通過(guò)抑制Rho/Rock信號(hào)通路的激活改善博來(lái)霉素導(dǎo)致的PF小鼠肺泡炎性滲出程度。解宏權(quán)[21]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，體外培養(yǎng)細(xì)胞液中RhoA、RhoC、Rock1表達(dá)豐度增加，1型膠原、LN和FN大量沉積，而用絲/蘇氨酸激酶抑制劑(TGF-β/Smad)處理后，RhoA、Rock1、Smad2 mRNA 表達(dá)下降，說(shuō)明TGF-β1可介導(dǎo)Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，表明兩條信號(hào)通路之間存在交叉作用。在博來(lái)霉素致PF模型中，Y-27632(Rock特異性抑制劑)作用于Rho/Rock 信號(hào)通路，抑制肺成纖維細(xì)胞遷移，減少肺組織ECM沉積，從而改善博來(lái)霉素導(dǎo)致的肺成纖維細(xì)胞增生和膠原蛋白沉積[22]。

2.3 TGF-β/Smads通路抑制劑

2.3.1 藥物治療 TGF-β通路在PF產(chǎn)生發(fā)展中起重要作用。吡非尼酮是一種人工合成的吡啶酮化合物。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[23]表明，吡非尼酮通過(guò)抑制TGF-β活化而發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用，是目前被批準(zhǔn)用于臨床治療特發(fā)性PF(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)的藥物。吡非尼酮抗纖維化具有廣譜性，尤其對(duì)PF、腎小球纖維化具有明顯治療效果，因其具有良好的安全性和耐受性，是改善IPF患者臨床癥狀的靶向藥物之一[24]。Chen等[25]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組加入吡非尼酮后可有效減少TGF-β1 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi) FN1、HSP47 mRNA 和HSP47蛋白表達(dá)量，減少了細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。同時(shí)證明，吡非尼酮可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。尼達(dá)尼布是另一種TGF-β抑制劑，通過(guò)與生長(zhǎng)因子受體三磷酸腺苷競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、分化、遷移。Wollin等[26]研究表明，尼達(dá)尼布抑制肺成纖維細(xì)胞增殖，減少α-SMA 表達(dá)量，緩解炎癥纖維化程度，改善患者預(yù)后。Wuyts等[27]研究發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素不僅能夠明顯減少肺組織膠原蛋白、羥脯氨酸含量 ，而且可增加大鼠肺活量，改善大鼠肺通氣，其機(jī)制可能與下調(diào)β-catenin 表達(dá)有關(guān)。Xiang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)， 使用新對(duì)葉百部堿干預(yù)博來(lái)霉素(bleomycin， BLM)，誘導(dǎo)VC，可降低膠原Ⅰ、α-SMA和 TGF-β1水平，且TGF-β1水平與新對(duì)葉百部堿濃度呈劑量依賴關(guān)系。維生素D治療可減少肺組織中羥脯氨酸含量，減少促纖維因子TGF-β表達(dá)，抑制肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，阻斷EMT發(fā)生，有效緩解BLM誘導(dǎo)的PF[29]。秦靜等[30]研究顯示，早期應(yīng)用丹參素可以增加肺組織超氧化物歧化酶活性，減少丙二酸、羥脯氨酸含量，減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠PF程度。其可能機(jī)制為下調(diào)TGF-β1、Smad3 mRNA和促進(jìn)Smad7 mRNA的表達(dá)。

2.3.2 基因及細(xì)胞因子治療 miR-326首次發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)在神經(jīng)元，具有抗神經(jīng)衰老作用。在NIH/3T3細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)研究[31]中發(fā)現(xiàn)， miR-326通過(guò)影響TGF-β1表達(dá)，上調(diào)MMP-2、MMP-9等抑纖維化基因表達(dá)。說(shuō)明miR-326可以抑制TGF-β1活性，控制細(xì)胞形態(tài)改變，作為一種新型的抗纖維制劑。miR-21是最早發(fā)現(xiàn)的一種致癌性miRNA，可以影響包括PTEN基因在內(nèi)的多種腫瘤抑制基因活性。最近，在IPF小鼠的肺肌成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-21表達(dá)是高度上調(diào)的。Yang等[32]在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠PF中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用miR-21抑制劑下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的COL1、COL3和α-SMA的表達(dá)。用miR-21前體干預(yù)TGF-β1作用的MRC5細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)FN、α-SMA轉(zhuǎn)錄，尤其是誘導(dǎo)Smad2磷酸化和Smad7表達(dá)減少，說(shuō)明miR-21在PF中也起到重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal-loproteinases，MMPs)/金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metallopmteinase，TIMPs)是降解ECM、抑制促炎因子表達(dá)和減輕PF程度的一類重要蛋白酶。其表達(dá)受多種細(xì)胞因子調(diào)控，如TGF-β下調(diào)MMP-1、 MMP-3和TIMP-2表達(dá)，促進(jìn)MMP-2和 TIMP-1表達(dá)。研究[33]發(fā)現(xiàn)，MMP-2和TIMP-1主要降解Ⅳ型膠原、α-SMA、波形蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，而肺基膜的損傷則可促進(jìn)PF發(fā)展。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)是作為一種能刺激肝細(xì)胞增殖的物質(zhì)而被提純發(fā)現(xiàn)，是一種能刺激多種細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖以及分化的多功能細(xì)胞因子，HGF可以抑制TGF-β的表達(dá)，通過(guò)減少ECM產(chǎn)生和促進(jìn)降解，進(jìn)而減輕BIM誘導(dǎo)PF小鼠呼吸困難癥狀[34]。

3 小結(jié)

PF是各種慢性肺部疾病的終末期病理改變，目前仍無(wú)有效治療藥物。各種細(xì)菌、真菌、病毒感染、化學(xué)中毒、免疫損傷等物理、化學(xué)因素，使肺泡組織增殖、分化受到影響，肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，轉(zhuǎn)化為肺成纖維細(xì)胞，成為ECM的重要來(lái)源。多種信號(hào)通路相互作用，共同參與EMT的發(fā)生、發(fā)展，明確EMT具體發(fā)生機(jī)制，研究針對(duì)不同信號(hào)通路的靶向藥物，成為治療PF藥物遴選和研發(fā)的重要研究方向。目前，EMT機(jī)制研究還僅限動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，其具體機(jī)制未完全闡明，需要進(jìn)一步研究，以研發(fā)更具有療效的抗纖維藥物。