牛支原體檢測方法研究進(jìn)展

王桂玲，吳勝昔，梁望旺，馬培杰，曾 政，黃 恒，李 志

（1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054；2.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 401120）

牛支原體（mycoplasma bovis）易引起牛的局部炎癥，如肺、乳房、生殖道、關(guān)節(jié)發(fā)炎甚至引起不孕等疾?。?］。1961年，牛支原體首次從患有乳房炎的奶牛所產(chǎn)的牛奶中分離出來。1976年，研究確定了牛支原體可導(dǎo)致各類呼吸系統(tǒng)疾病［2］。隨即，牛支原體相關(guān)疾病快速蔓延到多個(gè)國家及地區(qū)的牛群，嚴(yán)重制約了畜牧業(yè)和經(jīng)濟(jì)的快速增長。據(jù)報(bào)道，歐洲每年25.1%～33.8%的犢牛感染牛支原體肺炎，損失高達(dá)1.43億～1.93億歐元。英國每年有190萬頭左右的牛感染牛支原體肺炎。在美國，因牛支原體引起的疾病如牛呼吸系統(tǒng)疾病、肺炎等產(chǎn)生的損失高達(dá)1.40億美元。據(jù)報(bào)道，美國牛場的感染率達(dá)到了71%［3］。繼2008年之后，我國的多個(gè)地區(qū)相繼爆發(fā)了由牛支原體引起的傳染病，主要癥狀有發(fā)熱、咳嗽、流鼻涕等。鑒于一般藥物的治療效果不理想，再加上沒有相應(yīng)的疫苗，因而給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

支原體具有高度的傳染性，急需一種快速、有效的診斷方法來預(yù)防和控制該病的爆發(fā)。目前對(duì)牛支原體檢測技術(shù)的研究主要有3個(gè)方面：病原體抗原診斷、血清學(xué)抗體診斷、基因診斷［2，4］。血清學(xué)檢測法更適用于慢性感染病以及注射過抗生素的病例，這是因?yàn)榕Ｖгw能刺激牛脂質(zhì)和蛋白抗原引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體可在血清中存活數(shù)月。在基因診斷方法中，PCR技術(shù)是鑒別牛支原體及牛無乳支原體的一種重要技術(shù)。隨著分子以及各種免疫學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多地應(yīng)用于牛支原體病檢測的新型技術(shù)被相繼報(bào)道。本文對(duì)牛支原體傳統(tǒng)以及新型實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的研究進(jìn)展作簡要綜述［5-28］。

1 病原體抗原診斷

1.1 病原體分離培養(yǎng)檢測法

在無菌的條件下將牛支原體組織樣本接種在固體培養(yǎng)基表面，5%CO2的環(huán)境下培育3～4 d，支原體的菌落呈現(xiàn)出“煎蛋樣”的典型菌落形狀，菌落的外部整齊光滑且呈外薄內(nèi)厚，接種在含有酚紅的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基顏色會(huì)發(fā)生以下變化：紅色變?yōu)辄S色，液體透徹且明亮［5］。鑒于牛支原體的分離鑒定具有難度大、穩(wěn)定性低、靈敏性低以及培養(yǎng)周期長等缺點(diǎn)，故而不能將其作為一種早期檢測技術(shù)。雖然病原分離培養(yǎng)法具有直接簡明的優(yōu)點(diǎn)，但此法會(huì)消耗大量的人力物力，實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣，而且試驗(yàn)周期較長，以致貽誤最佳的治療時(shí)間，因而不能作為一種常規(guī)的檢測方法推廣。

目前對(duì)于分離培養(yǎng)檢測方法有了進(jìn)一步的研究。牛支原體的分離受外界環(huán)境的影響。Thomas等［13］同時(shí)對(duì)牛支氣管肺泡灌洗液和鼻腔的病原體進(jìn)行分離，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，前者的分離率高于后者。得到的新鮮的組織樣品應(yīng)該盡量在1 d內(nèi)通過無菌分離再進(jìn)行培養(yǎng)。通過使用不同的拭子樣品發(fā)現(xiàn)：使用尼龍以及聚酯纖維等的分離率明顯比傳統(tǒng)的棉簽拭子（P＜0.05）要高，分析原因可能是尼龍和聚酯纖維對(duì)病原體產(chǎn)生的毒害作用較棉簽更小，還有可能是前者能夠增加病原體樣本的采集和擴(kuò)大樣本的釋放量［6，10］。經(jīng)證實(shí)，通過濾膜處理后的病原體樣本再進(jìn)行接種可以大大提高牛支原體的分離率［7］。分離培養(yǎng)結(jié)束之后，結(jié)合特定的染色技術(shù)以及相應(yīng)的生理生化反應(yīng)即可初步鑒定牛支原體。

1.2 免疫酶技術(shù)

間接免疫過氧化物酶法以及酶聯(lián)免疫過氧化物（ELIP）能夠用來診斷病牛肺中的牛支原體，此法能有效地克服熒光抗體檢測技術(shù)存在的諸多缺陷：對(duì)于慢性感染的病牛不敏感、對(duì)樣本的新鮮度要求較高、需使用熒光顯微鏡觀察、牛支原體樣本保存周期短等［7］。通過免疫酶技術(shù)對(duì)肺切片進(jìn)行檢測后再涂片，即可明顯觀察到被染成淡紅色的各種大小不同的支原體顆粒，這種檢測方法目前只針對(duì)于豬、羊等肺部的支原體，但在牛支原體的診斷中還比較罕見。

1.3 免疫組化技術(shù)

免疫組化法是一種高特異性、高靈敏性的檢測技術(shù)。免疫組化可實(shí)現(xiàn)對(duì)牛支原體的定位檢測，從而可以得到機(jī)體內(nèi)牛支原體的大致分布狀態(tài)［8，11］。例如，免疫組化技術(shù)檢測到，在干酪狀壞死性支氣管肺炎中的支原體抗原大多存在于壞死灶的四周；抗原集中分布在巨噬細(xì)胞、肺泡以及支氣管管腔的大多數(shù)淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞中。當(dāng)機(jī)體內(nèi)的牛支原體經(jīng)分離培養(yǎng)檢測為陰性時(shí)，可通過免疫組化技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定位和鑒定［9，13，17］。免疫組化技術(shù)具有高特異性和高靈敏性的優(yōu)點(diǎn)，但唯一不足的是此法只能檢測較小的病灶區(qū)域組織，而對(duì)于較大的病灶區(qū)域或者是病變的程度較輕時(shí)，此法就顯得束手無策。

2 血清學(xué)抗體診斷

血清學(xué)檢測法是通過測定體內(nèi)的特定抗體量來診斷出動(dòng)物體內(nèi)的抗體水平，而且還能夠?qū)εＶгw病原的慢性攜帶者進(jìn)行診斷［12］。免疫學(xué)檢測技術(shù)是目前最熱門診斷方法之一，主要有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、花環(huán)試驗(yàn)、生長抑制試驗(yàn)及間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等［14，16］。該方法的檢測機(jī)理是：牛支原體的病原體能夠特異性地結(jié)合相應(yīng)抗體，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，進(jìn)而能夠在機(jī)體早期感染了牛支原體后及時(shí)地做出一種高效以及特異性的診斷。

目前常用的鑒定診斷技術(shù)主要有：生長抑制試驗(yàn)法（GI）、代謝抑制試驗(yàn)（MI）、生物膜形成抑制試驗(yàn)（FI），其中酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)（ELISA）是一種最廣泛的方法［15］。較其他方法而言，ELISA法具有高敏感性和高特異性，能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效準(zhǔn)確的自動(dòng)檢測。通過此法得到的各項(xiàng)檢測結(jié)果能實(shí)現(xiàn)對(duì)牛支原體感染的血清學(xué)流行疾病和暴發(fā)性流行病的測定，還能借此判析牛群的感染狀態(tài)。在歐洲和部分北美國家及地區(qū)早就廣泛使用ELISA法來檢測牛奶中的抗M.bovis含量，這也給了我們一種啟示：ELISA檢測法可能也可用于檢測牛支原體感染的病變部位［19］。國外的研究者花了大量時(shí)間研究ELISA檢測法。初期的ELISA診斷是把全菌滅活之后再進(jìn)行包被，但是出現(xiàn)了非特異性的抗原交叉反應(yīng)，對(duì)診斷結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，因而在當(dāng)時(shí)并沒有引起大眾的關(guān)注［18］。先后有 Howard、Boothby、Byrne以及 Blackburn等利用ELISA法對(duì)組織樣品培養(yǎng)物、血清樣品、奶樣等樣本直接進(jìn)行檢測，從而統(tǒng)計(jì)牛支原體的感染率以及發(fā)病狀況，其有效性和準(zhǔn)確性較傳統(tǒng)的鑒定方法確有提高［21-22］。

近來有報(bào)道稱，牛支原體膜表面可變蛋白Vsp（Variable surface lipoproteins）家族可用于診斷自然感染和人工感染。鑒于此蛋白的表面抗原表位會(huì)隨時(shí)間發(fā)生改變，因此人們嘗試將該蛋白插入到特定基因，結(jié)果顯示產(chǎn)生了穩(wěn)定表達(dá)［23］。由于牛無乳支原體和牛支原體的16SRNA具有極高的同源性，故在外界環(huán)境條件變化而引發(fā)的病理和所表現(xiàn)出來的臨床癥狀都很相像，因此科研學(xué)者們通過將膜表面可變蛋白Vsp上的48基因作為目的基因插入到特異基因中并進(jìn)行表達(dá)，就能用于診斷牛支原體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這種方法的可行性［27］。

Ball等［22］首創(chuàng)了一種夾心 ELISA法診斷技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)目前已經(jīng)成為了一種商業(yè)化診斷產(chǎn)品。首先是建立一個(gè)牛特異性支原體單克隆抗體，再與待測定培養(yǎng)基中的牛支原體抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)從而判定是否含有牛支原體抗原。Ghadersohi等［28］利用單克隆抗體技術(shù)制備了一種阻斷性抗體，構(gòu)建了一種間接阻斷法，用來診斷牛支原體抗體。通過對(duì)比間接阻斷法和PCR診斷法可以發(fā)現(xiàn)：前者在反應(yīng)的特異性和靈敏性上都占有優(yōu)勢(shì)，而且沒有交叉反應(yīng)的影響，因而是一種極具前景性的診斷方法。

目前，血清學(xué)診斷方法是用于檢測牛群感染牛支原體的一種常用技術(shù)，在具有優(yōu)勢(shì)性的同時(shí)，難免有一些缺陷，比如在牛群中存在較高的牛支原體的陽性血清率會(huì)影響檢測結(jié)果，血清中產(chǎn)生的牛支原體抗體滴度的高低和能否患上牛支原體疾病之間不存在直接關(guān)聯(lián)等，這些缺陷都限制了血清學(xué)診斷法的使用范圍，因而使血清學(xué)診斷法不能成為一種常規(guī)的診斷方法而得到進(jìn)一步的發(fā)展和應(yīng)用［25］。

3 免疫印跡法

免疫印跡法（Immunoblotitng）是將免疫覆蓋液作為探針，對(duì)抗體或抗原進(jìn)行印跡分析的統(tǒng)稱［11，26］。通過血清學(xué)診斷技術(shù)與蛋白印跡相結(jié)合的方法，可使試驗(yàn)結(jié)果更加具體可靠。Sachse等利用免疫印跡法對(duì)牛支原體的單抗MAb1E5、4F6以及MAb解析后發(fā)現(xiàn)，8種Vsp蛋白與宿主產(chǎn)生粘附現(xiàn)象的原理。Thomas［13］通過多次試驗(yàn)論證后發(fā)現(xiàn)：幾乎每一株分離后的Vsp蛋白菌株都表現(xiàn)出了較高的特異性。Ghadersohi等［26］通過對(duì)硝酸纖維素膜上的精氨酸支原體、無乳支原體，牛生殖道支原體和牛支原體的完整細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果只出現(xiàn)了牛支原體的49 kDa以及80 kDa兩個(gè)片段，同時(shí)也證明了牛支原體含有唯一的單克隆E4蛋白。

4 基因診斷

4.1 常規(guī)的PCR檢測技術(shù)

在核酸水平檢測牛支原體的技術(shù)中，最普遍的是PCR法。但由于牛無乳支原體和牛支原體的16SRNA具有極高的同源性，故利用PCR擴(kuò)增16 S rRNA難以鑒別牛支原體和牛無乳支原體。針對(duì)uvrC基因設(shè)計(jì)的引物，經(jīng)擴(kuò)增后可直接作用于鼻拭子樣本，還能直接檢測含有防腐劑的牛奶，隨著擴(kuò)增過程中顏色發(fā)生的變化能及早地診斷出牛支原體，此法快速高效且準(zhǔn)確率較高，同時(shí)還能特異性地區(qū)分牛無乳支原體和牛支原體［24］。

Cai等［15］創(chuàng)建了一種擴(kuò)增16srRNA的實(shí)時(shí)PCR法。構(gòu)建原理是基于雜交探針和退火溫度相結(jié)合應(yīng)用的一種檢測方法，此法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)牛乳支原體的快速有效的檢測與鑒定，同時(shí)還具有高特異性和敏感性。此外，以DNA聚合酶Ⅲ和ATP結(jié)合蛋白o(hù)ppD／F基因共同結(jié)合到特定基因，并作為目標(biāo)基因的PCR法已經(jīng)被公認(rèn)為是一種能夠有效區(qū)分感染牛無乳支原體或牛支原體的方式。Foddai［19，21］利用牛支原體的 p81基因設(shè)計(jì)出一種多重的PCR檢測技術(shù)，最后通過PCR-RFLP法對(duì)牛支原體p81基因序測序和分析，此法能極大地提高支原體檢測的特異性。2008年，我國正式開始研究此類病原體，截至目前，已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步。比如李媛等［11］利用牛支原體的oppD基因、F基因的2對(duì)特異性的引物，設(shè)計(jì)了一種高靈敏、高特異性的套式牛支原體PCR檢測法。還有一種針對(duì)牛特異性基因uvrC構(gòu)建的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）高效診斷技術(shù)，該方法靈敏性較高，可達(dá)34 cfu·mL-1。李大偉等［17］創(chuàng)建的一種三重PCR檢測法，實(shí)現(xiàn)一次性測定牛支原體、無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種小克隆，具有高特異性和高靈敏性。

截至目前，我們對(duì)核酸放大技術(shù)（NAATs）有了更深一步的認(rèn)識(shí)，通過大量試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：病原體的存活狀態(tài)、免疫反應(yīng)中抗體生成的時(shí)間以及數(shù)量等因素都不會(huì)對(duì)NAATs的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響［18，26］，這無疑進(jìn)一步提高了牛支原體檢測技術(shù)的高效性。此項(xiàng)檢測方法在抗生素的規(guī)范使用、降低牛支原體病的發(fā)病率和病死率，以及傳染性疾病領(lǐng)域的研究都具有深刻的意義。

4.2 實(shí)時(shí)PCR檢測法

據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道，花菁SYBR綠色染料與所有雙鏈DNA結(jié)合后，在520 nm處產(chǎn)生光發(fā)射，隨著雙鏈DNA數(shù)量的增加，染料發(fā)光量相應(yīng)增加，從而可以實(shí)時(shí)檢測PCR產(chǎn)物［13］。與基于探針的實(shí)時(shí)PCR方法相比，SYBR Green提供了一種成本更低的實(shí)時(shí)PCR分析方法，因?yàn)镾YBR Green不需要合成特定的寡核苷酸序列，因此可以產(chǎn)生更高的背景信號(hào)和較低的特異性。雖然此法不適于貓科動(dòng)物中支原體的檢測，但可用于檢測散裝罐內(nèi)牛奶樣品中的多株支原體［13，21］。此項(xiàng)技術(shù)已被證實(shí)可以對(duì)含有多個(gè)物種的幾個(gè)樣本進(jìn)行生物鑒定。SYBR綠色技術(shù)還被用于開發(fā)一種特異性PCR檢測牛結(jié)膜拭子中的牛分枝桿菌，作為傳染性牛角結(jié)膜炎流行點(diǎn)研究的一部分。

為了獲得更高的特異性，建立了實(shí)時(shí)PCR熒光報(bào)告探針方法，該方法主要將引物雜交，再與引物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的靶區(qū)相結(jié)合［3，15］。由于水解探針與目標(biāo)序列特異性結(jié)合，大大降低了背景信號(hào)，提高了特異性分析。不同的探針也可以與不同的報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)結(jié)合，在一個(gè)單一反應(yīng)中重復(fù)檢測，節(jié)省時(shí)間和試劑。據(jù)報(bào)道，幾種新型的牛分枝桿菌實(shí)時(shí)PCR檢測技術(shù)已經(jīng)研制成功。盡管基于探針的PCR技術(shù)可獲得更高的特異性，但與牛分枝桿菌16 SrRNA基因相結(jié)合時(shí)仍會(huì)產(chǎn)生交叉擴(kuò)增的現(xiàn)象。因此通過對(duì)替代基因的篩查發(fā)現(xiàn)uvrC基因是牛分枝桿菌較好的PCR目標(biāo)，它與包括牛分枝桿菌在內(nèi)的非牛分枝桿菌沒有交叉擴(kuò)增。uvrC基因編碼脫氧核苷化酶，是一種復(fù)制所必需的酶，因?yàn)樗cDNA修復(fù)有關(guān)，因此是一個(gè)高度穩(wěn)定的基因［18，26］。在牛 M.bovis和 M.Agalactiae中，它是一個(gè)非常保守但有顯著差異的基因，這使得它成為比16S rRNA更特異的靶基因，同時(shí)在肺、牛奶、關(guān)節(jié)液、鼻拭子的臨床標(biāo)本上證實(shí)了uvrC基因作為鑒定牛分枝桿菌的靶標(biāo)的可行性。

5 結(jié)束語

支原體在牛群中引起的各類傳染病和嚴(yán)重的相關(guān)疾病已對(duì)我國的經(jīng)濟(jì)和農(nóng)牧業(yè)造成嚴(yán)重的負(fù)面影響?？焖僭\斷有助于疾病的控制和預(yù)防。分離培養(yǎng)法提供了一個(gè)明確的分離物用于DNA的提取和預(yù)防，以調(diào)查感染來源和菌株與其他菌株的相關(guān)性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)提供了一種快速診斷法?？焖僭\斷有助于及時(shí)對(duì)病態(tài)牛作出處理，從而減少疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。血清學(xué)診斷提供了一種可供選擇的評(píng)估法：不同畜群或畜群內(nèi)的特定動(dòng)物群體的接觸情況。綜上，所采用的診斷方法需要考慮遺傳限制、診斷的迫切性，測試可用性、樣本類型和處理?xiàng)l件。每一種檢測方法都有其優(yōu)勢(shì)以及局限性，綜合使用每一種檢測方法將會(huì)對(duì)各自的優(yōu)勢(shì)和不足相互補(bǔ)充。