粉防己堿對(duì)絨癌BeWo細(xì)胞增殖和凋亡的作用

方 靜，薛 艷，安瑞芳

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710061)

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粉防己堿對(duì)絨癌BeWo細(xì)胞增殖和凋亡的作用

方 靜，薛 艷，安瑞芳

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710061)

目的 探討粉防己堿對(duì)人絨癌BeWo細(xì)胞株增殖和凋亡的作用。方法 采用不同濃度的粉防己堿處理人絨癌BeWo細(xì)胞株，在不同的作用時(shí)間采用MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡的變化；Western blot檢測(cè)PCNA和Survivin的表達(dá)。結(jié)果 采用不同劑量的粉防己堿處理BeWo細(xì)胞不同的時(shí)間，細(xì)胞均表現(xiàn)出生長(zhǎng)的抑制，且為劑量及時(shí)間依賴性(P<0.01)。0、5、10、20 μg/mL粉防己堿作用24小時(shí)后，細(xì)胞凋亡的比例依次為3.52%±0.62%、8.32%±2.1%、13.45%±2.7%和27.38%±3.1 %(F=41.616，P<0.01)，PCNA蛋白表達(dá)分別為0.85±0.05、0.53±0.04、0.22±0.01和0.03±0.01(F=244.375，P<0.01)，Survivin蛋白表達(dá)分別為1.06±0.01、0.98±0.06、0.52±0.03和0.39±0.03(F=529.4，P<0.01)。結(jié)論 粉防己堿可以對(duì)絨癌細(xì)胞株BeWo產(chǎn)生時(shí)間及濃度依賴的生長(zhǎng)抑制作用，誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞株的凋亡，有可能成為GTT化療方案的輔助治療藥物。

粉防己堿；絨癌；增殖；凋亡

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(gestational trophoblastic disease，GTD)是一種特殊的妊娠相關(guān)腫瘤，來(lái)源于胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，包括葡萄胎(hydatidiform mole，HM)、侵蝕性葡萄胎(invasive mole，IM)、絨毛膜癌(choriocarcinoma，CC)和胎盤(pán)部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(placental site trophoblastic tumor，PSTT)等。后三者也被稱為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(gestational trophoblastic tmour，GTT)，其中CC是惡性程度最高的腫瘤，侵襲力強(qiáng)，早期發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，自然死亡率高達(dá)90%以上，該疾病嚴(yán)重威脅育齡期婦女的健康狀況[1]。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤源自于滋養(yǎng)細(xì)胞的異常增生，是對(duì)化療敏感的實(shí)體瘤，侵蝕性葡萄胎和絨癌可以通過(guò)化療治愈。但是，藥物抵抗性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤已成為婦科腫瘤專家面臨的挑戰(zhàn)。因此，創(chuàng)新的實(shí)驗(yàn)治療方案有待于研究以突破目前治療的難題。

粉防己堿是從中草藥粉防己的塊莖中提取的雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿，近年來(lái)的研究顯示粉防己堿可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)凋亡，這些腫瘤包括肝癌、膀胱癌、胃癌，肺癌，和白血病[2-5]。粉防己堿介導(dǎo)了參與細(xì)胞死亡及凋亡蛋白的表達(dá)和活化，包括p53、p21、Bax,、PAPR等。粉防己堿同樣也被發(fā)現(xiàn)可以成為聯(lián)合化療，促進(jìn)化療效果的藥物[6]。但是關(guān)于粉防己堿用于GTT的治療效果目前未見(jiàn)報(bào)道。

本研究中采用不同濃度的粉防己堿處理人絨癌BeWo細(xì)胞株，在不同的時(shí)間檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡的變化，同時(shí)檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和Survivin的表達(dá)，旨在探討粉防己堿對(duì)人絨癌BeWo細(xì)胞株增殖和凋亡的作用。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株和試劑

人絨癌BeWo細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC) 細(xì)胞庫(kù)。Ham/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。粉防己堿購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，每次使用前用培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度?？贵wPCNA及Survivin購(gòu)自于Santa Cruz生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人絨癌BeWo細(xì)胞株用含15%胎牛血清的Ham/F12培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以1.25g/L 胰酶和0.2g/L 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)的混合液消化傳代。

1.3 噻唑藍(lán)檢測(cè)

將1×105個(gè)/孔的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，24小時(shí)后更換含有不同濃度的粉防己堿(5、10、20μg/mL)的培養(yǎng)基。24小時(shí)后每天呈色一塊96孔培養(yǎng)板，共進(jìn)行3天。加入噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)MTT(5mg/mL)20μL，培養(yǎng)4小時(shí)后，移去上清，每孔加入DMSO150μL，震蕩10分鐘后，上酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，測(cè)定490nm處各孔光吸光度，然后用公式計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)：IR=(陰性對(duì)照A490值-實(shí)驗(yàn)組A490值)/陰性對(duì)照A490值×100%。

1.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

取BeWo細(xì)胞株常規(guī)消化，制成細(xì)胞懸液，然后以每孔1×107個(gè)細(xì)胞將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BeWo細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，24小時(shí)后更換含有不同濃度的粉防己堿(5、10、20μg/mL)培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞，冰磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細(xì)胞，離心加入1x結(jié)合緩沖液400μL重懸細(xì)胞，加入Annexin-V-FITC 5μL，4℃避光放置15分鐘；加入PI 10μL，4℃避光放置5分鐘，1小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率。

1.5 Western blot檢測(cè)

不同濃度的粉防己堿(5、10、20μg/mL)處理BeWo細(xì)胞株24小時(shí)，提取蛋白。12%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%牛奶室溫封閉1小時(shí)，1抗孵育4℃過(guò)夜，二抗孵育1小時(shí)后采用化學(xué)熒光法顯色。GAPDH用做內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1粉防己堿對(duì)BeWo細(xì)胞株增殖的作用

BeWo細(xì)胞株用遞增濃度的粉防己堿處理24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，然后采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了增殖抑制率。如圖1所示，5、10、20μg/mL粉防己堿作用24小時(shí)后細(xì)胞的增值抑制率依次為17.9±0.8、20.9±1.1、27.0±1.4(F=63.118，P<0.01)，48小時(shí)依次為22.0±1.0、24.9±1.3、39.1±2.0(F=126.123，P<0.01)，72小時(shí)依次為24.9±1.2、29.0±1.3、44.9±2.7(F=129.393，P<0.01)，細(xì)胞的增殖抑制率呈現(xiàn)出濃度及時(shí)間依賴關(guān)系；更高的濃度的粉防己堿伴隨著更高的增殖抑制率(P<0.01)。

圖1 粉防己堿對(duì)BeWo細(xì)胞增殖抑制的作用

Fig.1 Effect of Tetrandrine on the proliferation inhibition of BeWo cells

2.2粉防己堿對(duì)BeWo細(xì)胞凋亡的作用

收集了不同濃度粉防己堿處理24小時(shí)的BeWo細(xì)胞，通過(guò)Annexin V-FITC/PI染色我們檢測(cè)了粉防己堿處理后BeWo細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示隨著粉防己堿濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例也增加，見(jiàn)圖2。對(duì)照組細(xì)胞的凋亡比例為3.52%±0.62%；而相對(duì)的，由5、10、20μg/mL粉防己堿作用24小時(shí)后細(xì)胞凋亡的比例依次為8.32%±2.1%、13.45%±2.7%和27.38%±3.1%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.616，P<0.01)，由此可見(jiàn)絨癌細(xì)胞株BeWo細(xì)胞凋亡數(shù)目的多少與粉防己堿的濃度密切相關(guān)。

圖2 粉防己堿對(duì)BeWo細(xì)胞凋亡的作用

Fig.2 Effect of Tetrandrine on the apoptosis of BeWo cells

2.3 增殖細(xì)胞核抗原和Survivin蛋白表達(dá)的變化

采用Western blot檢測(cè)了粉防己堿處理24小時(shí)后BeWo細(xì)胞株中相關(guān)蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖3。不同濃度的粉防己堿處理24小時(shí)后，PCNA蛋白表達(dá)水平分別為0.85±0.05、0.53±0.04、0.22±0.01、0.03±0.01(F=244.375，P<0.01)，Survivin蛋白表達(dá)水平分別為1.06±0.07、0.98±0.06、0.52±0.03、0.39±0.03(F=529.4，P<0.01)，均明顯降低。

圖3 PCNA和Survivin蛋白表達(dá)的變化

Fig.3 Expression changes of PCNA and Survivin

3討論

雖然大多數(shù)GTT患者對(duì)化療敏感，大約90%以上的患者可以通過(guò)化療治愈，但是臨床上仍有10%的患者對(duì)化療耐藥，因此針對(duì)化療耐藥患者，探索新的二線治療藥物就顯得極為重要。

3.1粉防己堿對(duì)絨癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的臨床應(yīng)用歷史悠久，粉防己堿(分子式C38H42N2O6)是粉防己的塊莖中提取的一種生物堿，被認(rèn)為是一種較為安全的藥物。最近的研究發(fā)現(xiàn)粉防己堿具有抗腫瘤作用，其抗腫瘤的機(jī)制主要是抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。但是關(guān)于粉防己堿對(duì)于絨癌細(xì)胞株的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。我們的研究結(jié)果顯示粉防己堿可以抑制絨癌細(xì)胞株BeWo的增殖，并且促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，而且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)及濃度的增加效果更加明顯。這些關(guān)于粉防己堿誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡相關(guān)的數(shù)據(jù)顯示隨著治療時(shí)期的延長(zhǎng)，粉防己堿的血清水平在微摩爾范圍內(nèi)已經(jīng)表現(xiàn)出用于絨毛膜癌的潛在治療價(jià)值。

3.2粉防己堿對(duì)絨癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制

為了探討粉防己堿抑制絨癌細(xì)胞株生長(zhǎng)及促進(jìn)凋亡的機(jī)制，我們研究了與癌細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。相應(yīng)于癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物誘導(dǎo)的抑制，哺乳動(dòng)物細(xì)胞常常通過(guò)激活不同的細(xì)胞增殖檢查點(diǎn)，從而對(duì)藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制做出反應(yīng)。長(zhǎng)期以來(lái)PCNA一直被認(rèn)為是直接反映細(xì)胞增殖能力的指標(biāo)[9]，PCNA 在細(xì)胞的G1 期合成逐漸增加，S 期達(dá)高峰，G2 期又開(kāi)始下降，其表達(dá)量與DNA 合成量變化一致，在細(xì)胞增殖周期中起著重要作用。Survivin 是凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族的成員，具有很強(qiáng)的抑制凋亡的作用。Cai等[10]的研究結(jié)果表明，抑制Survivin 的表達(dá)有效遏制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。本研究結(jié)果顯示粉防己堿可以下調(diào)PCNA和Survivin的表達(dá)量，提示粉防己堿可能通過(guò)調(diào)控上述基因而抑制絨癌細(xì)胞株生長(zhǎng)及促進(jìn)凋亡。

綜上所述，本研究表明粉防己堿在微摩爾濃度范圍內(nèi)可以表現(xiàn)出對(duì)絨癌細(xì)胞株BeWo的抗增殖活性，誘導(dǎo)凋亡。在這一過(guò)程中，與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)聯(lián)的重要調(diào)控因子PCNA和Survivin的表達(dá)量發(fā)生了下調(diào)。這些數(shù)據(jù)顯示粉防己堿有望成為GTT化療方案的輔助治療藥物，用于絨毛膜癌的治療。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：楊文方]

Effects of Tetrandrine on proliferation and apoptosis of human choriocarcinoma BeWo cells

FANG Jing, XUE Yan, AN Rui-fang

(Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

Objective To study the effects of Tetrandrine on proliferation and apoptosis of human choriocarcinoma BeWo cells. Methods BeWo cells were treated with various concentrations of Tetrandrine. MTT and flow cytometry were used to detect the proliferation and apoptosis of BeWo cells at different time. Western blot was used to detect the expressions of PCNA and Survivin. Results After treatment with Tetrandrine in BeWo cells, a concentration- and time-dependent inhibition of cell growth was observed (P<0.01). After 24h treatment of 0, 5, 10 and 20μg/mL Tetrandrine, the apoptosis rate of BeWo cells was 3.52%±0.62%, 8.32%±2.1%, 13.45%±2.7% and 27.38%±3.1%, respectively (F=41.616,P<0.01), the expression of PCNA was 0.85±0.05, 0.53±0.04, 0.22±0.01, 0.03±0.01, respectively (F=244.375,P<0.01), and the expression of Survivin was 1.06±0.01, 0.98±0.06, 0.52±0.03 and 0.39±0.03, respectively (F=529.4,P<0.01).Conclusion Tetrandrine could produce concentration- and time-dependent inhibition and induce apoptosis in human choriocarcinoma BeWo cells, which may service as a cancer chemo-preventive agent for gestational trophoblastic tumor (GTT).

Tetrandrine; choriocarcinoma; proliferation; apoptosis

2016-10-19

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃國(guó)際合作項(xiàng)目(2013KW-27-01)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(XJJ2015094)

方 靜(1972-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事婦科腫瘤的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.014

R737.3

A

1673-5293(2016)12-1472-03