細(xì)胞3D打印技術(shù)及應(yīng)用

周為，張誠，趙丹陽

（大連理工大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，遼寧大連 116024）

生物3D打印是一種涉及增材制造、生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、電子信息等多個學(xué)科領(lǐng)域的新興生物制造技術(shù)，它的出現(xiàn)極大地推動了組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。傳統(tǒng)的生物3D打印技術(shù)主要利用不含細(xì)胞的生物材料來制造醫(yī)學(xué)模型、金屬骨骼、生物陶瓷、組織工程支架等生物制品。而隨著進(jìn)一步的發(fā)展，生物3D打印延伸出了新的分支細(xì)胞3D打印技術(shù)（3D Cell Printing）。細(xì)胞3D打印技術(shù)是在3D打印的基礎(chǔ)上，以活細(xì)胞為原料結(jié)合生物材料、生命體材料的拓展延伸，打印活體組織與器官的一種技術(shù)。這種技術(shù)以計(jì)算機(jī)三維模型為基礎(chǔ)，通過離散堆積的方法，將生物材料或細(xì)胞按仿生形態(tài)、生物體功能、細(xì)胞特定微環(huán)境等要求，用增材制造法打印出同時具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)與功能的生物三維結(jié)構(gòu)、體外三維生物功能體等生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品，在骨骼、皮膚、血管、心臟、腎臟、肝臟等組織等再生與重建、藥物篩選等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本文主要從細(xì)胞3D打印技術(shù)的方式及特點(diǎn)、細(xì)胞3D打印的應(yīng)用、細(xì)胞3D打印的發(fā)展前景幾個方面展開簡要綜述。

1 細(xì)胞3D打印技術(shù)的方式和特點(diǎn)

1.1 噴墨細(xì)胞打印技術(shù)

噴墨細(xì)胞打印技術(shù)是最早應(yīng)用于打印細(xì)胞的技術(shù)，由傳統(tǒng)的噴墨打印技術(shù)發(fā)展而來，其原理是利用熱技術(shù)或聲波技術(shù)，促使液體通過受計(jì)算機(jī)控制的噴嘴產(chǎn)生液滴，按照預(yù)先設(shè)定好的三維結(jié)構(gòu)噴射液滴。目前，用于細(xì)胞打印的噴墨打印機(jī)主要采用熱噴墨或聲波噴墨技術(shù)。熱噴墨打印機(jī)通過電加熱打印頭來產(chǎn)生壓力脈沖而使液滴離開噴嘴，其優(yōu)點(diǎn)是打印速度快、成本低和廣泛可用性，但在打印過程中，細(xì)胞和生物材料需要承受高溫及較大的剪切應(yīng)力，并且噴嘴易堵塞、液滴的噴射方向易發(fā)生偏差、液滴尺寸不均勻等；聲波噴墨打印機(jī)使用與超聲場相關(guān)的聲輻射力把液滴從氣液界面處噴射出，通過調(diào)節(jié)聲波參數(shù)來控制液滴的大小和噴射速率，其優(yōu)點(diǎn)是可以避免噴嘴的堵塞，能夠控制液滴的尺寸和噴射方向，并能避免細(xì)胞暴露于高溫和機(jī)械應(yīng)力之下[1]，缺點(diǎn)是對于打印材料的粘度有著嚴(yán)格的限制?？梢姡瑖娔?xì)胞打印的局限性在于其打印的生物材料必須是液態(tài)的，只有在這種情況下才能形成液滴。

1.2 微擠壓細(xì)胞打印技術(shù)

微擠壓細(xì)胞打印技術(shù)是最常見的細(xì)胞3D打印技術(shù)，該技術(shù)利用機(jī)械控制將生物材料通過擠出頭擠出沉積在基底上。目前常用的材料擠出方法有氣動式和機(jī)械式（活塞或螺桿）兩大類。氣動式打印機(jī)的優(yōu)點(diǎn)是其驅(qū)動機(jī)構(gòu)組件簡易，缺點(diǎn)是其擠出力的大小受到系統(tǒng)氣壓的限制、并且容易造成材料控制的延遲；機(jī)械式打印機(jī)的優(yōu)點(diǎn)是其可以更好地實(shí)現(xiàn)空間控制，并且更適用于高粘度水凝膠的打印[2]，缺點(diǎn)是會產(chǎn)生較大的機(jī)械應(yīng)力從而對打印的生物材料造成損傷。與其他兩種技術(shù)不同的是，通過微擠壓細(xì)胞打印技術(shù)將生物材料擠出后會形成連續(xù)的材料絲而不是小液滴，導(dǎo)致生物材料和細(xì)胞承受較大的壓力和剪切應(yīng)力，降低了打印出細(xì)胞的存活率，限制了其在再生醫(yī)學(xué)組織領(lǐng)域方面的應(yīng)用。

1.3 激光輔助細(xì)胞打印技術(shù)

激光輔助細(xì)胞打印技術(shù)是利用聚焦的激光脈沖在色帶吸收層上產(chǎn)生高壓氣泡，將含有細(xì)胞的材料推射到接收基底上，其優(yōu)點(diǎn)是完全避免了其他細(xì)胞打印技術(shù)中細(xì)胞或生物材料堵塞的問題，同時對細(xì)胞的損傷很小，對細(xì)胞活力和細(xì)胞功能的影響可以忽略不計(jì)[3]；缺點(diǎn)是打印效率較低，不適合高通量地在體外構(gòu)建組織或器官，并且成本十分高昂，極大地限制了其在臨床方面的應(yīng)用。

2 細(xì)胞3D打印技術(shù)的應(yīng)用

2.1 組織工程

2.1.1 肝臟組織打印

肝功能衰竭與多器官功能衰竭相關(guān)，是導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率的重要原因，因此肝臟組織工程一直受到廣泛的關(guān)注。Faulkner-Jones等[4]首次使用人類多能干細(xì)胞（hPSCs）進(jìn)行肝組織的細(xì)胞打印，打印完成后人類多能干細(xì)胞經(jīng)過刺激分化成肝細(xì)胞，用于肝臟微器官工程，并且分析細(xì)胞3D打印過程對干細(xì)胞功能的影響。Bertassoni等[5]使用肝癌細(xì)胞（HepG2）、載有成纖維細(xì)胞的明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠和瓊脂糖進(jìn)行細(xì)胞打印，在打印過程中快速降溫使瓊脂糖迅速固化，接著利用UV光使水凝膠完全凝膠后去除瓊脂糖來產(chǎn)生可灌注的通道。由于肝組織對藥物毒性高度敏感，細(xì)胞3D打印的肝臟組織模型在藥物測試和高通量篩選方面具有巨大的應(yīng)用潛力，此外，用于器官移植的肝組織細(xì)胞打印也是未來的重點(diǎn)研究方向。

2.1.2 心臟主動脈瓣膜打印

隨著人口老齡化加重，老年性瓣膜病以及冠心病、心肌梗死后引起的瓣膜病變也越來越常見，而目前人工心臟瓣膜置換或瓣膜成形等手術(shù)治療是心臟瓣膜病的根治方法。細(xì)胞3D打印的心臟主動脈瓣膜可以針對病患心臟特性進(jìn)行私人訂制，提高精確性和穩(wěn)定性，同時可以降低病患身體的排異反應(yīng)，顯著提高瓣膜替換手術(shù)的成功率。Duan等[6]利用載有豬主動脈平滑肌細(xì)胞（SMC）、小葉間質(zhì)細(xì)胞（VIC）的明膠-藻酸混合水凝膠進(jìn)行細(xì)胞3D打印，隨后利用鈣離子化學(xué)交聯(lián)形成完整的主動脈瓣膜。通過細(xì)胞3D打印的主動脈瓣膜在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的瓣膜功能及可兼容性，但是由此誘發(fā)的炎癥性反應(yīng)及移植后鈣化等病理問題需要進(jìn)一步的研究[7]。

2.1.3 骨組織打印

由于人體骨骼形態(tài)不規(guī)則，并且不同性別、年齡、地區(qū)的個體形態(tài)差異較為明顯，細(xì)胞3D打印技術(shù)可以根據(jù)不同人體骨骼的差異來定制化打印人工骨骼，其在醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中有著極其廣泛的需求[8]。Pati等[9]利用來源于人鼻下鼻甲組織中的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞來產(chǎn)生礦化細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），提高了打印的聚己內(nèi)酯（PCL）支架的成骨潛能，經(jīng)過短暫的體外培養(yǎng)后將支架脫細(xì)胞化，與對照組相比，其表現(xiàn)出更強(qiáng)的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)性。Kundu等[10]將載有軟骨細(xì)胞的水凝膠利用細(xì)胞3D打印技術(shù)打印到提前制備好的支撐性結(jié)構(gòu)上，植入人體內(nèi)后生成適合人體的軟骨組織。盡管在骨組織的細(xì)胞打印取得了很大的進(jìn)展，但具有不同結(jié)構(gòu)，不同生物力學(xué)和生物學(xué)特性的骨組織細(xì)胞打印仍是一個巨大的挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步的研究以實(shí)現(xiàn)具有區(qū)域分化的骨組織打印。

2.1.4 血管組織打印

由于血管組織在組織構(gòu)建體中遞送營養(yǎng)物和氧氣、去除代謝殘留物方面具有不可替代的作用，只有在其基礎(chǔ)上才能構(gòu)建出結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、功能更強(qiáng)大的組織和器官，目前血管組織的細(xì)胞3D打印得到了廣泛的關(guān)注。Kolesky等[11]利用載有成纖維細(xì)胞的甲基丙烯酸酐化明膠，結(jié)合經(jīng)過人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）內(nèi)皮化的微直徑管道進(jìn)行細(xì)胞3D打印，可以制備出多細(xì)胞生物構(gòu)建體，將交聯(lián)完畢后的構(gòu)建體迅速降溫至4 ℃以液化去除Pluronic F127，最終形成完整的開放血管通道組織。Norotte等[12]將平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的球狀體利用細(xì)胞3D打印技術(shù)植入支撐性瓊脂糖凝膠的適當(dāng)位置中，經(jīng)過體外的適當(dāng)處理、培養(yǎng)也形成了相應(yīng)的血管組織。通常在傳統(tǒng)的生物3D打印中難以產(chǎn)生血管組織，但是通過細(xì)胞3D打印技術(shù)就可以很好地解決這一難題。

2.1.5 神經(jīng)組織打印

神經(jīng)系統(tǒng)的損傷是一種嚴(yán)重影響人們生活的疾病，帶來沉重的家庭以及社會負(fù)擔(dān)。利用細(xì)胞3D打印技術(shù)不僅可以增強(qiáng)組織工程構(gòu)建體的神經(jīng)支配功能，還能夠直接產(chǎn)生新的神經(jīng)組織，在治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的研究價值。Owens等[13]將分離的小鼠骨髓干細(xì)胞和施萬細(xì)胞分別澆注在微直徑管中后進(jìn)行細(xì)胞3D打印，使用微擠壓細(xì)胞打印技術(shù)將其以離散的管狀形式擠出，被擠出的施萬細(xì)胞被小鼠骨髓干細(xì)胞包裹，最終形成致密的神經(jīng)導(dǎo)管。Pateman等[14]利用細(xì)胞3D打印技術(shù)進(jìn)行基于PEG的神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管打印并用于神經(jīng)修復(fù)的研究，其打印神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管的分辨率與自體移植物對比，具有更好的分辨率。

2.1.6 皮膚組織打印

通過細(xì)胞3D打印技術(shù)構(gòu)建的組織工程皮膚不僅可以應(yīng)用于燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷等造成的皮膚損傷修復(fù)、移植，還可以作為體外模型用于皮膚相關(guān)產(chǎn)品檢測及皮膚疾病機(jī)理研究等。Vivian等[15]使用角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞利用細(xì)胞3D打印技術(shù)分別打印表皮和真皮組織，使用膠原蛋白來替代皮膚的真皮基質(zhì)，優(yōu)化相關(guān)細(xì)胞打印參數(shù)來提高細(xì)胞存活率，同時確定合適的表皮和真皮細(xì)胞密度來模擬人體皮膚的生理相關(guān)環(huán)境。通過組織學(xué)和免疫熒光表征證明其利用細(xì)胞3D打印技術(shù)構(gòu)建的皮膚組織在形態(tài)學(xué)和生物學(xué)上與天然人體皮膚組織類似。Stefanie等[16]利用激光輔助細(xì)胞打印技術(shù)將成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞定位在穩(wěn)定基質(zhì)之上，經(jīng)過體外適當(dāng)培養(yǎng)制備出完全細(xì)胞化的皮膚替代物。

2.2 細(xì)胞傳感器

細(xì)胞傳感器（Cell-based biosensors，CBBs）是利用活細(xì)胞作為分子識別敏感元件，感應(yīng)環(huán)境中的毒性物質(zhì)及污染物的裝置。目前，以原核和真核細(xì)胞為主的細(xì)胞傳感器已成為一種快速檢測工具，其在環(huán)境監(jiān)測、藥品研發(fā)、食品工業(yè)等領(lǐng)域顯示出巨大潛力。

在基于微電極的細(xì)胞傳感器中，為準(zhǔn)確地測定細(xì)胞的電位變化，需要使細(xì)胞固定在細(xì)胞傳感器中的微電極上，這就需要細(xì)胞具有良好的位置穩(wěn)定性。通過細(xì)胞3D打印技術(shù)不僅可以高通量地制備載有細(xì)胞的水凝膠、還可以在微米量級精確控制細(xì)胞的位置[17]。Hui等[18]將苦味受體細(xì)胞（味覺細(xì)胞STC-1和ICR小鼠味蕾細(xì)胞）作為感應(yīng)原件培養(yǎng)在絲網(wǎng)印刷玻碳電極表面，利用阻抗圖譜信號研究促味劑對它的應(yīng)激反應(yīng)作用。pH傳感器廣泛應(yīng)用于以pH值為參照數(shù)的工業(yè)、電力、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、科研和環(huán)保領(lǐng)域，通過細(xì)胞3D打印技術(shù)提高其靈敏度具有極大的研究意義。Bashir等[19]設(shè)計(jì)的細(xì)胞傳感器對pH值變化極其靈敏，通過原子力顯微鏡進(jìn)行偏轉(zhuǎn)測量來測定pH值的變化，其可以測定出最低5×10-5pH的酸堿值變化。

2.3 藥物代謝動力學(xué)和藥物篩選

目前，主要采用體外（in vitro）、體內(nèi)（in vivo）及計(jì)算機(jī)模擬的方法，對先導(dǎo)物的藥物代謝和藥物動力學(xué)特征進(jìn)行早期高通量快速評價。由于人體組織器官的復(fù)雜性，很難通過計(jì)算機(jī)模擬出準(zhǔn)確的藥物代謝過程，通常需要和體外模型結(jié)合起來對藥物進(jìn)行早期的篩選和評價。在藥物實(shí)驗(yàn)室中，通常使用動物體模型來對藥物進(jìn)行篩選和檢測，但是由于動物體的組織器官和人體存在一定的差異性，僅根據(jù)動物體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不足以評價藥物對人體的影響，而且很多病原體對器官的影響具有個異性如丙型肝炎。為了更加準(zhǔn)確、實(shí)時地表達(dá)出藥物對人體的影響，在藥物研發(fā)中構(gòu)建基于人體細(xì)胞的體外模型是十分有必要的，不僅可以準(zhǔn)確地反映出人體對藥物的整個反應(yīng)過程，還可以降低藥物研發(fā)過程的成本。

細(xì)胞3D打印技術(shù)可以將細(xì)胞均勻地沉積在微型器件的表面上，這種均勻性非常適用于測試和篩選細(xì)胞和藥物之間的相互作用。Orive等[20]設(shè)計(jì)了一種仿生細(xì)胞-水凝膠膠囊，可以促進(jìn)封閉環(huán)境內(nèi)細(xì)胞的長期功能表達(dá)、提高受控藥物傳遞膠囊的機(jī)械穩(wěn)定性、治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病等各種病理問題。Chang等[21]開發(fā)了一種氣動式細(xì)胞打印機(jī)，利用載有肝細(xì)胞的水凝膠對肝臟藥物測試平臺進(jìn)行原型設(shè)計(jì)，該平臺可以表達(dá)出不同的藥物代謝水平。細(xì)胞3D打印技術(shù)還可用于在微器件界面的每一側(cè)均勻地接種細(xì)胞層來形成器官芯片，器官芯片可以模擬出器官的局部代謝功能，有助于研究藥物之間的相互作用及其對組織器官的潛在影響。

2.4 腫瘤研究

目前，二維腫瘤模型廣泛應(yīng)用于癌癥研究中，但是由于缺乏細(xì)胞之間的立體相互作用，不能代表腫瘤生存的真實(shí)生理環(huán)境，從而無法準(zhǔn)確、實(shí)時地反映出腫瘤對人體組織器官的具體影響。由于細(xì)胞3D打印技術(shù)可以準(zhǔn)確定位各種細(xì)胞類型從而模擬出近似人體生理環(huán)境的癌癥微環(huán)境，可以為研究癌癥發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供極大的助力，細(xì)胞3D打印技術(shù)對于腫瘤領(lǐng)域方面的醫(yī)學(xué)研究有著巨大的研究潛力。Demirci等[22]利用細(xì)胞3D打印技術(shù)首次打印出體外腫瘤組織模型，使用雙噴頭噴墨細(xì)胞打印機(jī)對人卵巢癌細(xì)胞（OVCAR-5）和成纖維細(xì)胞（MRC-5）進(jìn)行細(xì)胞打印，以高通量和可重復(fù)的打印方式形成多細(xì)胞腺泡，并構(gòu)建出具有空間介導(dǎo)的微腫瘤環(huán)境。Sun等[23]將海拉細(xì)胞（HeLa）包封于明膠-藻酸鹽-纖維蛋白原復(fù)合水凝膠中進(jìn)行細(xì)胞打印來制備宮頸腫瘤模型，其打印的構(gòu)建體中細(xì)胞存活率達(dá)到90%，經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)后海拉細(xì)胞相互遷移并在水凝膠細(xì)絲內(nèi)形成細(xì)胞聚集體，與二維腫瘤模型中培養(yǎng)的細(xì)胞相比，其具有較高的化學(xué)抗性和金屬蛋白酶表達(dá)能力。雖然目前已經(jīng)利用細(xì)胞3D打印技術(shù)成功制造出了簡易的三維腫瘤模型，但未來還需要制造更大的組織模型來研究癌細(xì)胞運(yùn)動和遷移機(jī)制。

3 細(xì)胞3D打印技術(shù)的發(fā)展前景

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多的研究人員預(yù)言未來科學(xué)的重大進(jìn)展將發(fā)生在生命科學(xué)與快速成型技術(shù)、生物制造技術(shù)、生物科學(xué)和材料科學(xué)的交叉領(lǐng)域研究上。因此，有關(guān)細(xì)胞3D打印技術(shù)的研究不僅對生命科學(xué)前沿理論的形成奠定良好的基礎(chǔ)，而且也將極大地促進(jìn)和推動制造科學(xué)、材料科學(xué)等眾多領(lǐng)域的進(jìn)一步深入發(fā)展。

目前，細(xì)胞3D打印技術(shù)的發(fā)展機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，如開發(fā)新型的生物墨水，使其機(jī)械、流變、化學(xué)和生物學(xué)特性達(dá)到所需要打印器官組織的理想要求；標(biāo)準(zhǔn)化生物墨水配方，由于打印功能多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織通常需要進(jìn)行多類型細(xì)胞的同步打印，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的生物墨水無法保證細(xì)胞在同類型打印過程中的存活率，極大地提高了細(xì)胞3D打印的難度；除此之外，生物墨水的保質(zhì)期較短，長期儲存極其困難，也較大地限制了細(xì)胞3D打印的應(yīng)用發(fā)展。種子細(xì)胞的來源是限制細(xì)胞3D打印技術(shù)發(fā)展的另一個主要因素，其原因在于選用來自不同供體的細(xì)胞可能會導(dǎo)致免疫反應(yīng)發(fā)生的危險，并且迄今為止還無法使干細(xì)胞分化成全部的細(xì)胞種類。從細(xì)胞3D打印的工藝上來分析，目前細(xì)胞3D打印的打印精度不能保證細(xì)胞外基質(zhì)和多類型細(xì)胞復(fù)雜微結(jié)構(gòu)的精確成形，并且對打印后的細(xì)胞提供特定生長微環(huán)境并進(jìn)行功能化誘導(dǎo)，使獨(dú)立的細(xì)胞個體融合成有功能的組織也需要進(jìn)一步研究。

在不遠(yuǎn)的將來，隨著多學(xué)科的整合和技術(shù)突破，諸上問題必將一一解決，細(xì)胞3D打印技術(shù)將成為一種主流的生物制造技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)人類在體外制造與人體內(nèi)組織器官類似的三維構(gòu)建體起到巨大的促進(jìn)作用；同時也會成為一種非常簡易、快速的醫(yī)療技術(shù)，達(dá)到臨床上準(zhǔn)確、快速、有效的修復(fù)受損組織和替換病死器官的水平，最終造福于整個人類社會。