昆蟲抗藥性產(chǎn)生機(jī)制

吳有剛， 金 京， 楊勝祥， 吳 屏， 胡 琴， 杜永斌， 樊建庭?

1北京市延慶區(qū)林業(yè)保護(hù)站，北京102100； 2浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州311300； 3武漢市江夏區(qū)青龍山林場，湖北 武漢430000

在農(nóng)業(yè)及公共衛(wèi)生健康上，殺蟲劑的使用是害蟲防治的有效途徑之一。 但隨著殺蟲劑長期和廣泛的使用，昆蟲種群對各種殺蟲劑的敏感性降低，產(chǎn)生了抗藥性，有時(shí)甚至是交互抗性，嚴(yán)重限制了殺蟲劑的使用，降低了害蟲防治的效果。 因此，理解害蟲的抗性機(jī)制對其防治十分重要。

1 常見殺蟲劑及作用機(jī)制

一般來說，殺蟲劑是指對害蟲有毒殺作用的化學(xué)物質(zhì)。 目前使用廣泛的化學(xué)殺蟲劑，多為人工合成有機(jī)物或經(jīng)化學(xué)修飾的天然產(chǎn)物，也包括生物制劑。 化學(xué)殺蟲劑按照來源可分為有機(jī)氯殺蟲劑、有機(jī)磷殺蟲劑、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、新煙堿類、阿維菌素類、昆蟲生長調(diào)節(jié)劑和生物殺蟲劑等。

有機(jī)氯殺蟲劑(organochloride)是較早投入使用的有機(jī)殺蟲劑。 其化學(xué)構(gòu)成以碳?xì)浠衔餅榛炯軜?gòu)，并有氯原子連接在碳原子上，主要包括滴滴涕(DDT)型和氯化酯環(huán)(chlorinated alicyclics)型化合物。 DTT 型化合物主要作用于周圍神經(jīng)系統(tǒng)軸突上的鈉離子通道，而氯化酯環(huán)型化合物主要抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的γ-氨基丁酸氯離子通道的GABAA 受體(Coats，1990)。 有機(jī)氯殺蟲劑控制瘧蚊等昆蟲非常有效，但在動(dòng)植物中可長期殘留，因?qū)Νh(huán)境污染較大而被禁止或限制使用(Dunlap，2017)。

有機(jī)磷殺蟲劑(organophosphates)是一類含磷的有機(jī)合成殺蟲劑，主要包括毒死蜱(chlorpyrifos，CPF)、敵敵畏(dichlorvos，DDVP)、馬拉硫磷(malathion)、敵百蟲(trichlorfon)、氧化樂果(omethoate)、倍硫磷(fenthion)、對硫磷(parathion)、久效磷(monocrotophos)和對氧磷(paraoxon)等。 其主要靶點(diǎn)為乙酰膽堿酯酶，可使傳導(dǎo)昆蟲神經(jīng)沖動(dòng)的乙酰膽堿無法水解，在突觸處大量積累，從而干擾神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳導(dǎo)(Chambers ＆ Levi，1992)。 有機(jī)磷殺蟲劑具有廣譜殺蟲作用，對蚊、蠅、蜱、螨、虱、臭蟲Cimex lectularius L.等均有高效的觸殺、胃毒、內(nèi)吸和熏蒸殺滅作用，對人畜的毒性也較大。 但因害蟲對其抗藥性發(fā)展較緩慢，目前仍大量使用(Kumaer et al.，2010)。

另外一類作用于乙酰膽堿酯酶的殺蟲劑是氨基甲酸酯類(carbamate)，這是一類基于蔓生豆科植物毒扁豆中毒扁豆堿的結(jié)構(gòu)而合成的化合物，主要包括滅多威(methomyl)、硫雙威(thiodicard)、抗蚜威(pirimicard)等。 氨基甲酸酯對害蟲具有不同程度的觸殺、胃毒和內(nèi)吸作用，毒性較強(qiáng)，比有機(jī)磷類殺蟲劑作用迅速(Fukuto，1990)。

為了替代DDT，20 世紀(jì)60 年代，研究者從除蟲菊屬Pyrethrum 植物中提取的除蟲菊酯(pyrethrin)合成衍生出擬除蟲菊酯類(pyrethroids)殺蟲劑，包括溴氰菊酯(deltamethrin)、氰戊菊酯(fenvalerate)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、芐氯菊酯(permethrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、高效氟氯氰菊酯(lambadacyhalothrin)等(Class ＆ Kintrup，1991； Elliott，1989)。 擬除蟲菊酯主要作用于軸突膜上的電壓門控的鈉離子通道，對害蟲具有觸殺和胃毒作用，對人畜基本沒有毒害，目前廣泛用于防治家蠅Musca domestica L.、棉鈴蟲Helicoverpa armigera Hubner 及伊蚊等疾病媒介昆蟲(Soderlund et al.，2002)。

新煙堿類(neonicotinoid)是于20 世紀(jì)70 年代合成的一類殺蟲劑，其來源是煙葉中提取的活性成分煙堿經(jīng)修飾而成的化合物，主要包括吡蟲啉(imidacloprid)、啶蟲脒(acetaniprid)、烯啶蟲胺(nitenpyram)、環(huán)氧蟲啶(cycloxaprid)、噻蟲胺(clothianidin)、噻蟲嗪(thiamethoxam)等(Yamamoto ＆ Casida，1999)。 主要作用于煙堿型乙酰膽堿受體，具有觸殺和胃毒作用，高效低毒，尤其對刺吸式口器害蟲如同翅目蚜蟲、半翅目飛虱防治有效，特異性強(qiáng)，對人畜無害，但對蜜蜂等傳粉昆蟲危害較大(Tomizawa ＆ Casida，2005)。

從土壤阿維鏈霉菌Streptomyces avermitilis 中提取的大環(huán)內(nèi)酯類(macrocyclic lactone，MLs)化合物，是一種對害蟲有觸殺和胃毒作用的殺蟲劑。 包括阿維菌素(abamectin，AVM)、伊維菌素(ivermectin，IVM)、多拉菌素(doramectin)、塞拉菌素(selamectin)、米 貝 爾 肟(milbemycin oxime)、 奈 馬 菌 素(nemadectin)、莫西菌素(moxidectin)、普菌素(eprinomectin)8 種抗人畜寄生蟲如線蟲的藥物，又統(tǒng)稱為阿維菌素類(avermectins，AVMs)殺蟲劑(Campbell，2012)。 其中，AVM 和IVM 又被發(fā)展成為殺螨劑和殺蟲劑。 AVMs 殺蟲劑主要激活存在于無脊椎動(dòng)物中的谷氨酸門控氯離子通道(GluCls)，同時(shí)可作用于其他具半胱氨酸環(huán)的離子通道，如GABAA受體、甘氨酸受體、煙堿型乙酰膽堿受體等，但均不如GluCls 敏感(Dermauw et al.，2012； Wolstenholme＆ Rogers，2005)。 AVMs 具有觸殺和胃毒作用，可防治螨類、鞘翅目、同翅目、雙翅目、直翅目、等翅目、膜翅目及鱗翅目等節(jié)肢動(dòng)物(Chaccour et al.，2013； Putter et al.，1981)。

昆蟲生長調(diào)節(jié)劑是近年來新興的殺蟲劑，其作用機(jī)制是通過干擾蛻皮過程而阻礙昆蟲的成熟，因此，對于在幼蟲期為害的害蟲如鱗翅目昆蟲有特別防效，對環(huán)境昆蟲和有益昆蟲毒害較小，但較傳統(tǒng)殺蟲劑起效慢，對家蠶高毒。 昆蟲生長調(diào)節(jié)劑分為昆蟲激素類和幾丁質(zhì)合成抑制劑，前者包括保幼激素、蛻皮激素的類似物，后者包括苯甲酰脲類殺蟲劑(benzoylurea)，如滅幼脲(chlorbenzuron)和除蟲脲(diflubenzuron)等(Oberlander ＆ Silhacek，2000)。

除了上述化學(xué)殺蟲劑，殺蟲劑還包括生物殺蟲劑。 該類殺蟲劑因其靶標(biāo)特異性和高效性也在害蟲防治方面得到廣泛應(yīng)用，包括昆蟲病原真菌和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)等。 常用的昆蟲病原真菌主要是隸屬于子囊菌門的白僵菌和綠僵菌，它們不僅可以在昆蟲體內(nèi)大量繁殖，而且可分泌多肽、卵孢霉素等毒素來降低害蟲生存。昆蟲病原真菌大部分營專性寄生，可用于防治蝗蟲、蠐螬、葉蟬、飛虱以及鱗翅目害蟲(Fernandes et al.，2012)。 Bt 是一類產(chǎn)晶體的芽孢桿菌，可產(chǎn)生內(nèi)毒素(伴孢晶體)和外毒素，通過胃毒作用使害蟲停止取食，因饑餓死亡。 Bt 可用于防治直翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目多種害蟲，尤其是鱗翅目低齡幼蟲。 Bt 轉(zhuǎn)基因作物可以成功抵御害蟲，目前已在全球范圍廣泛種植(Kumar et al.，1996)。

2 殺蟲劑抗性機(jī)制

盡管殺蟲劑的類型很多，但害蟲對殺蟲劑抗性主要通過3 個(gè)方面產(chǎn)生：修飾殺蟲劑靶標(biāo)；提高相關(guān)解毒酶活性；減少進(jìn)入體內(nèi)的殺蟲劑或增加體內(nèi)殺蟲劑的排出(Hemingway et al.，2004； Perry et al.，2011； Rinkevich et al.，2013； Scott，2017)。

2.1 靶標(biāo)抗性

靶標(biāo)抗性是指與殺蟲劑作用的靶標(biāo)分子發(fā)生突變或者表達(dá)水平的改變，減少了與殺蟲劑的親和位點(diǎn)，從而降低了對藥物的敏感性而產(chǎn)生抗性。 殺蟲劑作用的靶標(biāo)主要包括電壓門控鈉離子通道(Vssc)、 乙 酰 膽 堿 酯 酶( acetylcholinesterase，AChEs)、煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)、受體門控的氯離子通道等。

Vssc 的突變可以增加昆蟲對DTT 和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性。 家蠅和埃及伊蚊Aedes aegypti(L.)抗性品系中Vssc 的L1014F、V1016G、F1534C突變可發(fā)生擊倒抗性(knockdown resistance，kdr)，降低了Vssc 對DDT 和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的敏感程度(Rinkevich et al.，2013； Smith et al.，2016)。

乙酰膽堿酯酶的突變可以增加昆蟲對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑抗性。 AChEs 可以水解乙酰膽堿來終止神經(jīng)信號的傳遞(Russell et al.，2004)。 昆蟲中存在2 種不同的AChEs 基因：AChE1 和AChE2，AChE1 是昆蟲中主要的水解酶。褐飛虱Nilaparvata lugens (St?l) 毒死蜱抗性品系中AChE1 的G119S、F331C 位點(diǎn)的點(diǎn)突變導(dǎo)致對毒死蜱不敏感，從而引發(fā)抗性(Zhang et al.，2017b)。 毒死蜱對AChEs 氨基酸的選擇效應(yīng)也有可能導(dǎo)致靶標(biāo)抗性的產(chǎn)生，如Wang et al. (2018b)在對龜紋瓢蟲Propylea japonica (Thunberg) AChEs 的測序中發(fā)現(xiàn)，毒死蜱抗性品系在F358S 結(jié)構(gòu)域上與敏感品系存在5 個(gè)氨基酸的差異，可能和抗性有關(guān)。

煙堿型乙酰膽堿受體的突變可以增加昆蟲對新煙堿類殺蟲劑的抗性。 通過藥物壓力篩選的灰飛虱Laodelphax striatellus (Fallén)的環(huán)氧蟲啶抗性品系中，環(huán)氧蟲啶的靶標(biāo)蛋白nAChR 的Lsα1 和Lsβ1 亞基的表達(dá)量分別比野生型降低了9.6和3.36倍(Zhang et al.，2018)。

GABAA 受體門控的氯離子通道突變可增加環(huán)戊二烯類殺蟲劑、大環(huán)內(nèi)酯類及苯基吡唑(phenylpyrazole)類殺蟲劑的抗性。 線蟲GABA 受體的堿基突變或谷氨酸氯離子通道的配體結(jié)合域GLC-1的氨基酸缺失，導(dǎo)致受體結(jié)構(gòu)變化，因而不能與阿維菌素結(jié)合，降低了對阿維菌素的敏感性(Blackhall et al.，2003； Ghosh ＆ Kruglyak，2012) 。

GluCls 的突變可增加大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑的抗性。 如小菜蛾P(guān)ultella xylostella L. GluCl(PxGluCl)的跨膜結(jié)構(gòu)域A309V 突變基因或二斑葉螨Tetranychus urticae Koch GluCl(TuGluCl3)的G315E 突變基因可以使爪蟾卵母細(xì)胞對阿維菌素的敏感度分別下降4.8 或493 倍(Wang et al.，2017)。

Liu et al. (2014)發(fā)現(xiàn)四跨膜蛋白Tetraspanin的T92C 點(diǎn)突變導(dǎo)致棉鈴蟲對Bt 蛋白Cry1Ac 產(chǎn)生顯性抗性，將T92C 點(diǎn)突變敲入敏感品系，其抗性增加125 倍。

2.2 代謝抗性

代謝抗性是通過體內(nèi)解毒酶系如細(xì)胞色素P450 氧化酶系(CYP)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、羧酸酯酶(CarE)或膽堿酯酶等酯酶表達(dá)量或活性的增加，提高昆蟲對殺蟲劑的降解能力。

P450 解毒酶在很多殺蟲劑的抗性中具有重要的作用。 灰飛虱的毒死蜱抗性品系中解毒酶基因CYP6AY3v2、CYP306A2v2 和CYP353D1v2 表達(dá)量均提高(Elzaki et al.，2018)。 搖蚊Chironomus tentans Fabricius 中的19 種P450 中，CtCYP6EX3 在毒死蜱向毒死蜱氧化物的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。 用RNAi敲除CtCYP6EX3 后，搖蚊幼蟲對毒死蜱的敏感性下降(Tang et al.，2017)。 二斑葉螨Tetranychus urticae Koch P450 中的CYP392A16 可以催化ABM 的羥基化而降低其毒性(Riga et al.，2014)。 灰飛虱的CYP6CW1 在吡蚜酮和稻虱凈的抗性品系中過表達(dá)，RNAi 抑制CYP6CW1 后，灰飛虱對吡蚜酮和稻虱凈的敏感性增加(Zhang et al.，2017a)。 Wang et al. (2018)證實(shí)棉鈴蟲CYP6AE 基因簇編碼的P450對殺蟲劑的解毒代謝能力，利用CRSPR/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除該基因可提高棉鈴蟲對順式氰戊菊酯和茚蟲威的敏感性，最終確定體外表達(dá)CYP6AE的代謝抗性與5 個(gè)P450 基因有關(guān)。

GSTs 在殺蟲劑抗性的發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要作用。 朱砂葉螨Tetranychus cinnabarinus (Boisduvals) ABM 抗性品系和甲氰菊酯抗性品系的GST活性比敏感品系分別上升了3.4 和2.8 倍，GST 抑制劑順丁烯二酸二乙酯可部分抑制上述2 種品系分別對ABM 和甲氰菊酯抗性(He et al.，2009)。 煙粉虱Bemisia tabaci Gennadius 的吡蟲啉抗性品系中的GST-d7 的表達(dá)量相對于敏感品系上調(diào)了4.39倍，敲減GST-d7 后，使用50 μg·mL-1的吡蟲啉處理，抗性品系的致死率可從11.83%提高到25.49%，敏感品系的致死率從51.17%提高到80.60%(He et al.，2018)。 棉鈴蟲GST-8 可以有效分解有機(jī)磷類農(nóng)藥如毒死蜱和敵敵畏，并大幅降低水溶液中氯氰菊酯的含量(Labade et al.，2018)。

另外，羧酸酯酶與昆蟲的抗性有關(guān)。 在褐飛虱中，羧酸酯酶在CPF 抗性品系中高表達(dá)，該基因的RNAi 顯著提高了對CPF 的敏感性(Lu et al.，2017)。 朱砂葉螨ABM 抗性品系的羧酸脂酶上升了2.7 倍，水解酶抑制劑磷酸三苯酯可部分抑制其對ABM 的抗性(He et al.， 2009)。

2.3 穿透抗性

穿透抗性是通過昆蟲的滲透屏障(昆蟲表皮、消化道圍食膜、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的血腦屏障)結(jié)構(gòu)和成分的改變，減少殺蟲劑在體內(nèi)的滲透率和殘留量，緩解體內(nèi)解毒作用的壓力。 主要分為減少進(jìn)入體內(nèi)的殺蟲劑(表皮的滲透)及增加殺蟲劑的排出(ABC 蛋白的運(yùn)輸)。

2.3.1 表皮與殺蟲劑抗性 表皮作為昆蟲的最外層結(jié)構(gòu)，是殺蟲劑進(jìn)入昆蟲體內(nèi)的第一道屏障。 昆蟲可通過表皮結(jié)構(gòu)和成分變化，阻礙殺蟲劑在血淋巴中擴(kuò)散的速率并延長殺蟲劑降解時(shí)間，從而減緩藥物在靶標(biāo)細(xì)胞的積累(O′Brien ＆ Izuru，1970)。

研究表明，在家蠅中注射AVM 僅能獲得35 倍的抗性倍數(shù)，是點(diǎn)滴法的1/600(Clark et al.，1995)。 在黑腹果蠅Drosophila melanogaster Meigen抗性品系中注射ABM，LD50為43 ng·頭-1，是點(diǎn)滴法的1/1700(Konno ＆ Scott，1991)。 電鏡觀察顯示，催命按蚊Anopheles funestus Giles 的擬除蟲菊酯抗性品系雌蟲的表皮顯著增厚，并對卡氯菊酯的敏感性降低。 臭蟲溴氰菊酯點(diǎn)滴的抗性倍數(shù)是表皮下注射的105 倍，并且表皮蛋白基因、幾丁質(zhì)合成酶基因、幾丁質(zhì)脫乙酰酶在抗性品系中高表達(dá)。 在敏感品系中過表達(dá)這些基因可以使表皮增厚或重構(gòu)，從而降低殺蟲劑的穿透速率(Dang et al.，2017)。 以上研究均提示殺蟲劑在表皮穿透力降低是昆蟲的一種很重要的抗性機(jī)制。

昆蟲的表皮是上皮細(xì)胞的分泌物質(zhì)，由上表皮、原表皮2 個(gè)部分組成。 上表皮主要成分為蠟質(zhì)和碳?xì)浠衔?Girotti et al.，2012)，原表皮由結(jié)構(gòu)復(fù)合物表皮蛋白(CPs)和幾丁質(zhì)相連的基質(zhì)組成(Moussian，2016)。 這2 種成分本身的結(jié)構(gòu)及兩者的相互作用決定了表皮的物理特性。 表皮對于維持昆蟲的內(nèi)環(huán)境十分關(guān)鍵，在應(yīng)對環(huán)境脅迫時(shí)，可以保護(hù)昆蟲免于脫水和病原體及殺蟲劑的侵害(Budke et al.，2013；Liang et al.，2015)。 研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲表皮的各個(gè)組成成分都有可能參與昆蟲對殺蟲劑的抗性，如脂類上升(Qiu et al.，2012)、幾丁質(zhì)含量變化(Plapp ＆ Hoyer，1968)、漆酶基因轉(zhuǎn)錄變化(Pan et al.，2009)、表皮蛋白轉(zhuǎn)錄變化(Snyder et al.，1981)等。

橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsali (Hendel)氯氰菊酯抗性品系比敏感品系表皮厚，內(nèi)表皮幾丁質(zhì)層更致密，結(jié)構(gòu)更清晰，表皮細(xì)胞間隙更大。 此外，溴氰菊酯在抗性品系的滲透速率更慢(Lin et al.，2012)。藥物壓力法篩選的果蠅ABM 抗性品系中，抗性品系果蠅幼蟲的體壁厚度是敏感品系的2 倍，其中幾丁質(zhì)層的厚度是敏感品系的2 ～3 倍(Chen et al.，2016)。 近期研究表明，幾丁質(zhì)參與的穿透抗性與幾丁質(zhì)合成酶關(guān)系密切。 甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hubner 飼喂幾丁質(zhì)合成酶后，雙鏈RNA 能導(dǎo)致其化蛹過程中死亡率上升35%，并且使3 齡幼蟲對球孢白僵菌Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 更敏感(Lee et al.，2017)。 二斑葉螨野外種群的乙螨唑抗性與幾丁質(zhì)合成酶CH1 羧基端的非同義突變有關(guān)系。 其他的幾丁質(zhì)合成抑制劑的作用方式也有可能通過與幾丁質(zhì)合成酶的直接作用來實(shí)現(xiàn)(Leeuwen et al.，2012)。 小菜蛾芐基脲抗性品系和紅蜘蛛Panonychus ulmi (Koch)乙螨唑抗性品系的CH1 有共同的突變位點(diǎn)。 用CRISPR/CAS 9將果蠅CH1 的該位點(diǎn)突變，可使果蠅對芐基脲、乙螨唑和CH1 抑制劑噻嗪酮產(chǎn)生較高的抗性。 說明上述3 種藥物的作用方式都是與CH1 結(jié)合(Douris et al.，2016)。 除了CH1，果蠅的CH2 也參與幾丁質(zhì)和其他分子(如Obst-A)的結(jié)合，對幾丁質(zhì)層的成熟和維持至關(guān)重要。 CH2 在表皮、消化道和器官都有分布，并在細(xì)胞上表面和致密幾丁質(zhì)層中富集。CH2 的敲減使得組裝區(qū)域退化，阻礙表皮和管道的形成。 CH2 較保守的序列相似性暗示了在昆蟲中可能具有相似的功能(Pesch et al.，2017)。

昆蟲表皮的組織特異性和物種特異性大多是因?yàn)楸砥さ鞍讟?gòu)成的差異導(dǎo)致。 作為前表皮的另一類重要分子，表皮蛋白也參與了昆蟲抗藥性。 在中華庫蚊Culex sinensis Theobald 基因組中鑒定出來自11 個(gè)家族的238 種表皮蛋白，其中CPR 和CPAP3 家族中的CPR123 和CPAP3-E 在中華庫蚊溴氰菊酯抗性品系中上調(diào)，而CPLCP23 下調(diào)，提示表皮蛋白與昆蟲的抗性相關(guān)(Zhou et al.，2017)。褐飛虱中鑒定出來自8 個(gè)家族的106 種表皮蛋白，這些表皮蛋白表現(xiàn)出齡期、組織和功能的特異性，并且有17 種表皮蛋白RNAi 敲除后其表皮變薄或排布發(fā)生變化(Pan et al.，2018)。 淡色庫蚊Culex pipiens pallens Coquillett 溴氰菊酯抗性品系的2 種表皮蛋白CpCPR63 和CpCPR47 比敏感品系有更高的表達(dá)水平。 用dsRNA 將CpCPR 敲低后成蟲的死亡率升高，說明表皮蛋白有可能參與淡色庫蚊對溴氰菊酯的抗性(Sun et al.，2017)。 另一種表皮蛋白CPLCG5 在淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系也比敏感品系有更高水平的表達(dá)。 SiRNA 敲低抗性品系CPLCG5 的表達(dá)量可以使外表皮變薄(Yun et al.，2018)。 此外，參與調(diào)控表皮蛋白表達(dá)的microRNA與昆蟲殺蟲劑抗性相關(guān)。 Hong et al. (2014)在尖音庫蚊Culex pipiens complex 溴氰菊酯敏感和抗性品系中發(fā)現(xiàn)了28 個(gè)差異表達(dá)的microRNAs。 其中，miR-92a 和miR-932 在抗性品系的含量比敏感品系顯著升高，miR-92a 和miR-932 分別與表皮蛋白CpCPR4 和CpCPR5 的3′-UTR 區(qū)結(jié)合抑制其表達(dá)，miR-94a 抑制劑通過上調(diào)CPR4 的水平，使抗性品系對溴氰菊酯的敏感性上升，而miR-932 的過表達(dá)通過下調(diào)CPR5 的水平，使敏感品系對溴氰菊酯的敏感性下降(Kai et al.，2016； Liu et al.，2016)。

除了幾丁質(zhì)和表皮蛋白，外表皮的成分如碳?xì)浠衔镆矃⑴c了表皮抗性。 研究發(fā)現(xiàn)，外表皮(角質(zhì)層)在岡比亞按蚊Anopheles gambiae Giles 的擬除蟲菊酯抗性中發(fā)揮作用，C14標(biāo)記的溴氰菊酯內(nèi)化速率在抗性品系中明顯慢于敏感品系。 角質(zhì)層的電鏡分析及脂質(zhì)提取的特征表明，抗性蚊有較厚的上表皮層且表皮碳?xì)浠衔锏暮匡@著上升，而升高的碳?xì)浠衔锖渴怯纱呋浜铣傻腜450 酶CYP4G16 的表達(dá)水平上升導(dǎo)致的(Balabanidou et al.，2016)。

2.3.2 ABC(ATP-binding cassette)運(yùn)輸?shù)鞍着c殺蟲劑抗性 ABC 運(yùn)輸?shù)鞍资且活惸そY(jié)合蛋白，可分為8 個(gè)家族：ABCA-ABCH，ABCH 目前僅存在于果蠅等節(jié)肢動(dòng)物和斑馬魚內(nèi)，而植物、酵母、線蟲和哺乳動(dòng)物中尚無發(fā)現(xiàn)(Dean ＆ Annilo，2005； Popovic et al.， 2010)。 ABC 家族成員通常包含2 個(gè)高度可變的跨膜域(TMDs)來進(jìn)行底物的識別，2 個(gè)高度保守的核苷酸結(jié)合域(NBDs)用于水解ATP，產(chǎn)生能量攝入或排出底物(Zolnerciks et al.，2011)。 在包括從微生物到人類的各個(gè)物種中，ABC 蛋白均發(fā)揮著很重要的作用，如無機(jī)鹽運(yùn)輸、視色素沉積、尿酸攝入、環(huán)化GMP、脂類修飾的多肽信息素和生物胺等運(yùn)輸、異源物質(zhì)代謝和排出及抗性等(Dean ＆ Annilo，2005； Higgins，1992； Hollenstein et al.，2007)。

昆蟲可以通過ABC 運(yùn)輸?shù)鞍妆磉_(dá)量的增加，將與之結(jié)合的殺蟲劑從體內(nèi)組織中排出或增加排出的速率，從而減少殺蟲劑與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合，增加對殺蟲劑的抗性(Dermauw ＆ Van Leeuwen，2014； Merzendorfer，2014)。 ABCB、ABCC 和ABCG家族的成員已被證明參與多種殺蟲劑的排出，因此在昆蟲殺蟲劑抗性發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用。

ABCB1 又稱為P-糖 蛋 白(P glycoprotein，Pgp)。 P-gp 包含2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及2 個(gè)ATP 結(jié)合位點(diǎn)，利用水解ATP 產(chǎn)生的能量，可以排出細(xì)胞內(nèi)各種不同結(jié)構(gòu)的化合物(Shannon et al.，2013)。 Pgp 最先在煙草天蛾Manduca sexta 的血腦屏障(blood brain barrier，BBB)中發(fā)現(xiàn)，并被證明與飲食中尼古丁的耐受有關(guān)(Murray et al.，1994)。 之后研究人員在黑腹果蠅、尖音庫蚊、長紅獵蝽Rhodnius prolixus Stal 等昆蟲中發(fā)現(xiàn)1～4 種與P-gp 同源的蛋白。 P-gp 可以與很多藥物、殺蟲劑和金屬相互作用(Bain ＆ LeBlanc，1996； Buss ＆ Callaghan，2008；Schinkel et al.，1994)，參與昆蟲的抗性產(chǎn)生。 煙青蟲Heliothis virescens Fabricius 對擬除蟲菊酯、有機(jī)磷和氨基甲酸酯有抗性的一種品系中，當(dāng)使用verapamil、quinidine 等P-gp 的抑制劑與硫雙威同時(shí)作用后，可以提高抗性品系對其的敏感性(Lanning et al.，1996)。 在SF9 細(xì)胞系中，CPF 處理顯著提高了P-gp ATP 酶活性(Lanning，1996)。 Srinivas et al.(2004)在對多種殺蟲劑均表現(xiàn)抗性的棉鈴蟲一種品系中，發(fā)現(xiàn)了P-gp 的過表達(dá)。 Aurade et al.(2010)對P-gp 進(jìn)行純化后進(jìn)行體外檢測，確定了其結(jié)合氯氰菊酯、氰戊菊酯、硫丹、對硫磷、久效磷和對氧磷的能力，并發(fā)現(xiàn)這些殺蟲劑在一定濃度時(shí)均可以增加20%～40%的ATP 酶活性，其中甲基對硫磷在高濃度時(shí)還會(huì)抑制其ATP 酶活性。 敲除甜菜夜蛾的P-gp 基因，其對阿維菌素和艾瑪菌素的敏感性分別增加2.73 和3.09 倍(Zuo et al.，2018)。雙硫磷處理埃及伊蚊幼蟲后，其P-gp 的表達(dá)量上調(diào)8 倍，與verapamil 聯(lián)合處理后，雙硫磷的毒性上升了24%，RNAi 敲除P-gp 后，可增加57%的雙硫磷毒性(Figueira-Mansur et al.，2013)。 在另一種伊蚊Aedes caspius Pallas 中，殺蟲劑與亞致死濃度的verapamil 聯(lián)用可以提高雙硫磷和伏蟲脲的毒力3.5和16.4 倍(Porretta et al.，2008)。 將verapamil 和殺蟲劑同時(shí)使用，可增加尖音庫蚊敏感品系和抗性品系4 齡幼蟲對硫丹、阿維菌素和氯氰菊酯的敏感性(Buss et al.，2002)。 德國小蠊Blattella germanica L. CPF 抗性品系中，CPF 處理24 h 可以顯著增加P-gp 表達(dá)和ATP 酶的活性(Hou et al.，2016)。

用馬拉硫磷、阿維菌素和氯氰菊酯處理東方果實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)后，分別有4、10 和14 種ABC 蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)，RNAi 干擾ABCB7 后可增加其對馬拉硫磷的毒性(Xiao et al.，2017)。 埃及伊蚊的2 個(gè)擬除蟲菊酯抗性品系(Cayman 和Cuba)中ABCB4 的表達(dá)量分別上升5.13和2.60 倍(Bariami et al.，2012)。

除了ABCB 家族的蛋白，ABCC 和ABCG 家族在昆蟲抗性中也發(fā)揮重要作用。 ABCC 蛋白中的MRPs(multidrug resistance proteins)蛋白與P-gp 有相似的結(jié)構(gòu)，并有15%的相同氨基酸(Cole et al.，1994)。 在腫瘤細(xì)胞中，MRPs 參與多種藥劑的耐藥性，但與P-gp 的底物略有不同，MRPs 對連接有谷胱甘肽的化合物有較高的親和力，可運(yùn)輸有機(jī)陰離子，及可與谷胱甘肽形成復(fù)合物的重金屬(Zaman et al.，1995)。 一般通過機(jī)體的解毒過程才會(huì)將異源物質(zhì)與谷胱甘肽連接，產(chǎn)生的產(chǎn)物親水性更強(qiáng)，因此，需要相應(yīng)的運(yùn)輸?shù)鞍讓⒋祟愇镔|(zhì)排出細(xì)胞(Ishikawa，1992)。 岡比亞按蚊、黑腹果蠅、人疥螨Sarcoptes scabiei var. hominis Raspail 中有很多ABCC 家族的基因，包括與人MRP1 同源的很多蛋白。 ABCG 蛋白大小是P-gp 和MRP 蛋白的一半，只有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)ATP 結(jié)合位點(diǎn)(Doyle et al.，1998)。 這些單體可以和自身或ABCG 家族的其他單體形成同二聚體或異二聚體，但尚不完全確定此過程是否是底物運(yùn)輸?shù)那疤?Mitomo et al.，2003)。黑腹果蠅和岡比亞按蚊分別有15 和12 種ABCG。人源的ABCG 蛋白只有5 種，其中人源ABCG2 參與藥物的抗性，但目前關(guān)于其在昆蟲對殺蟲劑抗性中的作用報(bào)道很少。

在爪蟾卵母細(xì)胞中插入家蠶Bombyx mori L.的BmABCC2 基因可以提高其對蘇云金桿菌的抗性(Tanaka et al.，2016)。 與敏感品系相比，ABCB/C/G 家族的基因在灰飛虱CPF、溴氰菊酯和吡蟲啉3種抗性品系均有高表達(dá)。 用verapamil 與殺蟲劑聯(lián)合處理后，殺蟲劑對各抗性品系的毒性增強(qiáng)，CPF、β-溴氰菊酯和吡蟲啉的LD50分別下降3.02、2.24 和1.52 倍，但在敏感品系中無變化，說明過表達(dá)的ABC 蛋白與抗性的產(chǎn)生相關(guān)(Sun et al.，2017b)。

埃及伊蚊擬除蟲菊酯抗性品系(Cayman 和Cuba)的Cayman 品系中ABCG3 表達(dá)量上升2.19 倍，Cuba 品系中ABCC2 表達(dá)量上升3.53 倍(Bariami et al.，2012)。 岡比亞按蚊溴氰菊酯抗性品系中幼蟲AGAP008436-RA 的表達(dá)量比敏感品系高2.88 倍，DTT 抗性品系中ABCC8 的表達(dá)量上升(Bonizzoni et al.，2012)。 斯氏按蚊Anopheles stephensi Liston 的幼蟲用LD50劑量的芐氯菊酯處理后，ABCG4 的表達(dá)量上升，芐氯菊酯和verapamil 聯(lián)用可以增加5.48倍的芐氯菊酯的毒性(Epis et al.，2014)。 用RNAi的方法敲減體虱中ABCC4，可增加其對IVM 的抗性。 臭蟲溴氰菊酯、氯氰菊酯的抗性品系中ABC8和ABC9 高表達(dá)，RNAi 敲除基因后，可以增加其對氯氰菊酯的敏感性(Yoon et al.，2011)。

3 總結(jié)與展望

昆蟲殺蟲劑抗性的產(chǎn)生是昆蟲與不良環(huán)境因素長期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。 通過自身靶標(biāo)突變、解毒酶系活性提高和表皮結(jié)構(gòu)和成分的改變，減少或降低殺蟲劑等不良因素的影響，是昆蟲適應(yīng)環(huán)境不斷進(jìn)化的重要方式。 近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使研究者更深入地研究殺蟲劑抗性產(chǎn)生的關(guān)鍵通路，為制定合理的抗性控制策略奠定了理論基礎(chǔ)。RNAi 技術(shù)和P-gp 抑制劑的應(yīng)用可能成為未來抗性逆轉(zhuǎn)的重要途徑。 昆蟲殺蟲劑抗性機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的工程，隨著基因組學(xué)的發(fā)展，可以更好地從多基因間的相互作用去理解昆蟲抗藥性的進(jìn)化，不斷深入研究和探索昆蟲抗性產(chǎn)生的機(jī)制，對于新型殺蟲劑的研發(fā)和指導(dǎo)害蟲控制策略都具有重要的理論和實(shí)際指導(dǎo)意義。