腦缺血再灌注損傷分子生物學(xué)機(jī)制及現(xiàn)代中醫(yī)藥治療進(jìn)展

雷夢(mèng)南，李 玉，胡建鵬

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230038）

腦血管?。–VD）泛指腦部血管的各種疾病，是當(dāng)今世界三大疾病之一。缺血性腦血管?。↖CVD）的死亡率在人類疾病中居第二位，約占80%～85%[1]。腦缺血一段時(shí)間后，血供功能不僅不能恢復(fù)，而且還會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的腦功能障礙現(xiàn)象，稱為腦缺血再灌注損 傷（cerebral ischemia-reperfusion injure, CIRI）。CIRI的病理生理過(guò)程屬于一個(gè)多因素參與、多環(huán)節(jié)循環(huán)、多途徑損傷的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)[2]?，F(xiàn)今認(rèn)為CIRI的發(fā)病機(jī)制主要與自由基損傷、興奮性氨基酸中毒、細(xì)胞Ca2+超載及凋亡等方面有關(guān)，且機(jī)制尚未明晰。筆者結(jié)合各種CIRI動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究和CIRI相關(guān)現(xiàn)代中醫(yī)藥防治，為進(jìn)一步探索CIRI的機(jī)制與治療提供了理論依據(jù)。

1 CIRI 分子生物學(xué)機(jī)制

1.1 自由基作用 CIRI產(chǎn)生的主要機(jī)制之一是自由基的作用[3]。自由基是廣泛存在于生物體內(nèi)的“活性氧成分”，主要包括非脂性自由基、脂性自由基、活性氧、其他脂質(zhì)過(guò)氧化物等[4]。大量過(guò)氧化物產(chǎn)生于腦缺血損傷形成過(guò)程中，其中可反映部分細(xì)胞損傷程度的是過(guò)氧化物MDA的過(guò)氧化水平[5]。在腦缺血組織中，大量自由基、活化氧被神經(jīng)元釋放。抗氧化酶類合成發(fā)生障礙無(wú)法清除過(guò)量的自由基，過(guò)多活性氧同樣不能被清除，自由基對(duì)腦組織的損傷逐步上升，主要變現(xiàn)為染色體畸變，核酸堿基改變或DNA斷裂。組織細(xì)胞中開(kāi)始出現(xiàn)線粒體質(zhì)膜損傷，線粒體功能障礙進(jìn)一步加重[5]，細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷隨之加重，一系列生物活性物質(zhì)被釋放造成腦組織細(xì)胞凋亡[6]。

1.2 興奮性氨基酸（excitatory amino acids, EAAs）毒性學(xué)說(shuō) EAAs是指具有2個(gè)羧基和1個(gè)氨基的酸性游離氨基酸，主要包括谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、乙酰膽堿及羧甲基-3-異丙烯基脯氨酸等[7]，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在神經(jīng)元信息傳遞中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下，維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)的是適量EAAs，而EAAs明顯增多在腦缺血形成過(guò)程里，EAAs受體的活化進(jìn)一步增強(qiáng)[8]，過(guò)量的EAAs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)毒性作用，是引起 CIRI 的重要途徑之一[9]。

1.3 細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載 細(xì)胞內(nèi)Ca2+的集聚受鈣通道和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體在內(nèi)的異?；钴S隔離系統(tǒng)的調(diào)控配置[10]。生理狀況下，細(xì)胞外Ca2+濃度高于細(xì)胞內(nèi)約萬(wàn)倍，參與相關(guān)的神經(jīng)調(diào)節(jié)及傳遞。腦缺血時(shí)，由于Ca2+超載，蛋白激酶C被激活，加重了腦缺血缺氧的進(jìn)程，影響DNA 裂解和軸突傳遞的進(jìn)程，造成水腫和腦血管功能障礙等多方面的異常改變，從而導(dǎo)致腦細(xì)胞的不可逆死亡[11]。線粒體內(nèi)鈣超載誘導(dǎo)多種線粒體蛋白的去磷酸化，可抑制ATP合成；線粒體功能障及酶的活化作用及不可逆的神經(jīng)細(xì)胞損傷的出現(xiàn),是鈣超載影響 CIRI 的主要因素[12]。

1.4 血-腦脊液屏障（blood brain barrier, BBB）的破壞 位于腦室脈絡(luò)叢的上皮細(xì)胞、基底膜及星形膠質(zhì)細(xì)胞共同組成了血-腦脊液屏障，其中的腦毛細(xì)血管基底層主要由Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等構(gòu)成，是維持BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[14]；進(jìn)而選擇性通透了腦組織液和腦脊液之間的物質(zhì)交換，腦內(nèi)外機(jī)制環(huán)境得以保持穩(wěn)定[13]。腦缺血再灌注后，大量的白細(xì)胞浸潤(rùn)及蛋白水解酶的產(chǎn)生，損傷了微血管內(nèi)皮細(xì)胞的密切連接，升高基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，改變了BBB 通透性,致使腦缺血再灌注損傷的進(jìn)一步加重[15]。同時(shí)，ATP的不足、細(xì)胞內(nèi)K+水平增加、乳酸酸中毒、細(xì)胞外谷氨酸的釋放等因素均使 BBB 的破壞加劇[16]。

1.5 神經(jīng)細(xì)胞凋亡 凋亡是CIRI神經(jīng)元損傷的形式之一，是體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序受多種相關(guān)基因的影響而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其具體的機(jī)制尚未完全清楚。資料表明細(xì)胞色素C、Bcl-2家族、P53蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶、組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等相關(guān)調(diào)控基因與細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切[17]。腦缺血發(fā)生時(shí)，由缺血所引起的Fas信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常 、產(chǎn)生增多的Tat蛋白、EAAs 等使凋亡基因的表達(dá)升高，造成腦細(xì)胞的凋亡[18]。

2 CIRI現(xiàn)代中醫(yī)藥療法

2.1 中藥 近年研究顯示，多種中藥及其有效成分提取物對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)機(jī)制，主要表現(xiàn)為減緩細(xì)胞膜損傷，降低Ca2+超載造成的細(xì)胞不可逆損傷、抑制白細(xì)胞的聚集、清除過(guò)量的自由基、抑制中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的交互作用，影響基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡調(diào)控等方面。

2.1.1 單味中藥及提取物 1）夏天無(wú)注射液（ICDP）。徐祖才等[19]應(yīng)用TTC染色檢測(cè)大鼠腦組織梗死體積，免疫組化技術(shù)測(cè)定腦組織的磷酸化NF-κB表達(dá)水平。TTC檢測(cè)顯示，劑量不同的ICDP都可以降低相應(yīng)組別大鼠的腦梗死的重量百分比；免疫組化染色顯示，磷酸化 NF-κB 主要集中表達(dá)在海馬區(qū)核中，而少量在CA3 區(qū)表達(dá)。結(jié)論： ICDP 能顯著降低缺血區(qū)腦損傷，顯著降低腦組織磷酸化NF-κB 蛋白表達(dá)，其機(jī)制可能與NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的神經(jīng)保護(hù)作用及信號(hào)通路減弱有關(guān)。2）川芎嗪。李鵬飛等[20]采用改良Zea Longa栓線法構(gòu)建大腦中動(dòng)脈梗塞模型，蘇木素伊紅（HE）染色檢查腦組織病理學(xué)改變，TTC染色法檢測(cè)大鼠腦梗死體積，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠梗死側(cè)腦皮層的Bcl-2、腫瘤壞死因子 、白細(xì)胞介素（IL）-1β的表達(dá)水平；免疫組化法驗(yàn)證大鼠梗死側(cè)腦皮質(zhì)核轉(zhuǎn)錄因子及磷酸化NF-κB P65的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明：TMP治療可以改善大鼠神經(jīng)功能，使腦細(xì)胞含水量下降，顯著改善腦水腫、減少腦梗死面積以及改善腦部神經(jīng)組織的損傷，從而表明TMP具有一定保護(hù)腦神經(jīng)的機(jī)制，進(jìn)一步抑制腦缺血的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，降低再灌注所致腦組織結(jié)構(gòu)的損傷可能性。3）無(wú)患子皂苷。劉金林等[21]將大鼠隨機(jī)分組，采用線栓法復(fù)制腦缺血再灌注模型。結(jié)果顯示，無(wú)患子皂苷可降低炎性介質(zhì)血清TNF-α 含量、降低炎癥細(xì)胞的強(qiáng)烈趨化因子IL-1β 含量、降低腦組織細(xì)胞黏附因子 ICAM1 含量，來(lái)抑制腦缺血再灌注損傷過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，以減少腦組織的回流血量，從而減少腦內(nèi)組織自身炎性介質(zhì)的釋放，阻斷再灌注后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，改善缺血后繼發(fā)性腦損傷。

2.1.2 中藥有效成分 1）紅景天苷。王軍等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定受試大鼠腦梗死體積，用PCR法檢測(cè)8-二氧基應(yīng)激產(chǎn)物的表達(dá)水平，用定量RT-PCR測(cè)定提取mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)水平變化。紅景天苷具有清除自由基、保護(hù)受損的腦組織等功能[23]，實(shí)驗(yàn)表明：紅景天苷可提高腦組織中的c-hif-1表達(dá)，對(duì)腦組織缺血再灌注損傷的抗損傷作用，減少再灌注所誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生[24]。2）葛根素。LIU等[25]將行中腦動(dòng)脈閉塞（MCAO）法制備大鼠腦缺血模型，腦部梗死體積由TTC測(cè)定。研究表明，葛根素對(duì)大鼠缺血性腦損傷部分神經(jīng)元細(xì)胞有保護(hù)機(jī)制，可降低缺血性腦梗死體積，改善腦后神經(jīng)缺損缺血/再灌注，降低了白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素- 6和腫瘤壞死Factor-α的表達(dá)，從而能有效促進(jìn)大腦抵抗腦缺血再灌注損傷，并抑制炎癥反應(yīng)。3）黃芪甲苷和三七。黃小平等[26]將大鼠隨機(jī)分組，采用RT-PCR方法測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋基因和腦組織蛋白質(zhì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪、三七活性成分能顯著改善腦缺血再灌注損傷后腦能量代謝，顯著提高缺血腦組織能量物質(zhì)利用率。經(jīng)配伍后，缺血后組織能量代謝有良好的調(diào)節(jié)作用。

2.1.3 中藥復(fù)方及中成藥 1）補(bǔ)陽(yáng)還五湯。關(guān)莉等[27]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可預(yù)防大鼠腦缺血再灌注所致的GluR2表達(dá)下降，保護(hù)腦組織，從而抑制腦神經(jīng)元的凋亡。2）清熱化瘀Ⅱ號(hào)方。祝美珍等[28]經(jīng)研究表明，清熱化瘀Ⅱ號(hào)方可能通過(guò)減少TLR4-TRAM信號(hào)通路的傳導(dǎo)途徑，減少神經(jīng)元損傷，減少了其通路的表達(dá)，降低炎癥級(jí)聯(lián)現(xiàn)象。此外，還可保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷的腦細(xì)胞[29]。

2.2 針灸治療 針灸可以減輕腦組織的抗氧化應(yīng)激，使腦血管的舒縮功能得以緩解，使腦缺血再灌注后細(xì)胞壞死與凋亡得到抑制，改變了再灌注的BBB 結(jié)構(gòu)后，疏通腦缺血細(xì)胞的能量供應(yīng)及代謝，保護(hù)再灌注后的腦組織。CHEN等[30]采用針刺百會(huì)和足三里穴位來(lái)檢測(cè)腦缺血再灌注大鼠的外周血清（miRNA124）和層黏連蛋白，整合素β1的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：外周血中（miRNA124）顯著升高，且該作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而更為明顯，層粘連蛋白的表達(dá)在缺血再灌注組要高于假手術(shù)組，整合素β1的水平在針灸組的表達(dá)要低于模型組。針刺百會(huì)和足三里可以緩解大鼠的腦缺血區(qū)域的細(xì)胞損傷，上調(diào)外周血清的（miRNA124）、層黏連蛋白及整合素β1的水平，其炎癥反應(yīng)的介導(dǎo)得到緩解，進(jìn)而發(fā)揮其在腦保護(hù)中的作用[31]。

3 小結(jié)

近年來(lái)，雖然CIRI的預(yù)防和治療得到了較大的改善，但目前來(lái)看，存在以下不足：1）有關(guān)腦缺血再灌注損傷的具體的分子生物學(xué)機(jī)制沒(méi)有得到一致的衡量標(biāo)準(zhǔn)，而實(shí)驗(yàn)測(cè)量方法標(biāo)準(zhǔn)不一，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)無(wú)創(chuàng)新性，而且關(guān)于腦缺血再灌注的模型制備沒(méi)有較為統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；2）中藥復(fù)方的研究中，中醫(yī)藥特色配伍規(guī)律未展現(xiàn)，其配伍優(yōu)勢(shì)沒(méi)有得到良好發(fā)揮。

針對(duì)以上不足，建議：1）在基因分子視點(diǎn)上，深入探究CIRI分子生物學(xué)機(jī)制，采用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)測(cè)量方法，運(yùn)用國(guó)際上較統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備方法；2）在研究單味中藥及其有效成分的作用機(jī)制基礎(chǔ)上，需要加強(qiáng)研究中藥復(fù)方的主要成分間相互影響，從而使君、臣、佐、使在其得到充分的展現(xiàn)，以期在 CIRI分子生物學(xué)機(jī)制的深入研究及現(xiàn)代中醫(yī)藥預(yù)防治療方面細(xì)究具有重要的創(chuàng)新價(jià)值。