維生素B12檢測方法研究進展

祖新，李瀟玲，焦成瑾

（1.甘肅省食品檢驗研究院，甘肅蘭州730030；2.甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室，甘肅蘭州730030；3.天水師范學院生物工程與技術學院，甘肅天水741001）

維生素B12是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)最晚的一種B族維生素，別名鈷胺素、氰鈷胺、動物蛋白因子等。維生素B12與人類健康息息相關，它以輔酶形式參與各種代謝過程，促進甲基的形成和轉(zhuǎn)移，參與某些化合物的異構化作用、維持巰基的還原狀態(tài)，促進DNA和蛋白質(zhì)的合成，促進細胞的成熟，維持神經(jīng)組織的正常功能。缺乏VB12不僅會導致貧血，還會引起心臟病、神經(jīng)紊亂、生育與出生缺陷以及癌癥等。作為維持人體正常代謝和機能不可缺少的微量營養(yǎng)素，維生素B12受到了人們越來越多的關注。

1 維生素B12的結構特點和來源

維生素B12是一類含有鈷離子的咕啉類化合物總稱，呈類八面體結構，主要由以下3個部分組成。首先，其中心4個吡咯（parolee）以4個N原子與中心金屬鈷離子相連，形成了一個平面咕啉環(huán)（corrin ring）；其次，5，6-二甲基苯并咪唑 （5，6-dmiethylbenzmi idazole，DMBI）以N-7原子與鈷離子相連成為維生素B12分子的低位配基，同時DMBI通過磷酸基團和氨丙醇（aminopropanol）相連，氨丙醇則與吡咯環(huán)上的丙酸側(cè)鏈通過共價鍵相連；此外，腺苷（adenosyl group）或甲基（methyl group）與鈷離子相連組成維生素B12分子的上位配基；此外，母核中還有9個不對稱碳原子。咕啉環(huán)軸向上方的配基不同，形成了不同類型的維生素B12類物質(zhì)。羥基與咕啉環(huán)中的鈷離子相連形成羥基鈷胺（hydroxycobalamin），同樣，脫氧腺苷（5′-deoxyadenosyl）、甲基、氰基與鈷離子相連分別生成腺苷鈷胺（deoxyadenosylcobalamin）、甲基鈷胺（methylcobalamin）和氰鈷胺（cyanocobalamin）等[1]。維生素B12至少有5種相似結構分子，一般所稱維生素B12是指分子中鈷和氰（CN）結合的氰鈷胺素（cyanocobalamin），維生素 B12在人體內(nèi)因結合的基團不同，可有多種存在形式，其中甲鈷胺素（mecobalamine）和 5′-脫氧腺苷鈷胺素（5′-deoxyadenosy lcobalamin），是維生素B12的活性型，也是血液中存在的主要形式[2]。

植物和動物均不能自身合成維生素B12，絕大部分的維生素B12來源是肉類和海產(chǎn)品類，小部分來源于奶蛋及發(fā)酵產(chǎn)品。自然界能夠產(chǎn)生維生素B12的生物目前發(fā)現(xiàn)只有各類微生物如放線菌和細菌，霉菌中的米根霉菌也能合成。動物由于腸道內(nèi)共生的細菌種類繁多，其中部分細菌（如干酪乳桿菌）具有合成維生素B12的能力，所以在腸道內(nèi)眾多種類細菌的作用下，各類動物能夠產(chǎn)生不同水平的維生素B12[3]。

1976年，美國Woodward研究小組和Eschenmoser研究小組合作完成了人類首次維生素B12的全化學合成。由于維生素B12的結構極為復雜，其化學合成高度繁瑣且昂貴，從肝臟等動物組織提取的效率和效益也十分低下，所以只能通過微生物發(fā)酵法來實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。P.shermanii和P.denitrificans是目前工業(yè)生產(chǎn)維生素B12的主要生產(chǎn)菌種，蔡瑩瀛等[4]采用常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變脫氮假單胞菌（Pseudomonas denitrificans）并從中篩選了高產(chǎn)維生素B12突變株PA320-M4-1B1，在250 mL搖瓶發(fā)酵6 d的條件下，維生素B12產(chǎn)量達到（103.2±2.1）mg/L，較初始菌株PA320的（71.9±1.8）mg/L提高了43.8%，且遺傳性狀穩(wěn)定。

2 維生素B12檢測方法

2.1 液相色譜法

色譜是現(xiàn)代高效分離檢測的重要技術平臺，伴隨現(xiàn)代高效液相色譜的發(fā)展，高靈敏度、高分辨率、高通量和自動化等特點使之成為維生素B12檢測的優(yōu)選方法。該方法普遍使用C18色譜柱進行分離，采用三氟乙酸/甲醇[5]、醋酸鈉/甲醇[6]、水/乙腈[7]或甲醇/水[8]作為流動相，經(jīng)梯度洗脫完成維生素B12的分離，聯(lián)合紫外檢測器檢測。該方法操作簡便、線性范圍寬、重復性好，檢測限為2.0 μg/mL，適用于藥品和血液中的維生素B12檢測。

為提高維生素B12的檢出限，許多新型前處理方法被開發(fā)應用，免疫親和柱是使用廣泛且比較成功的，其凈化柱上固定的生物酶可以有效釋放樣品在凈化階段被結合的維生素B12，從而使食品中的維生素B12得以萃取濃縮，因此檢出限普遍可以達到0.01 μg/mL，以適用于嬰幼兒乳粉或功能性飲料中維生素B12的測定[9-11]。

Paula等[12]開發(fā)的基于親水離子液體（il）1-己基-3-甲基二氮氯化物，平均萃取效率為97%。只需要5.0 mL的樣品和單一的水解、脫蛋白和提取步驟，然后將富含維生素B12的上層相直接注射到高效液相色譜法系統(tǒng)中進行測定，探測極限為0.09 μg/mL，這種綠色分析方法在尿液等高度復雜基質(zhì)樣品分析中得到了實際應用。

聯(lián)用質(zhì)譜儀的液相色譜具有強大的組分分離與鑒定能力，成為檢測復雜有機物的有效手段，而且方法簡便、準確，在最短6 min內(nèi)就能完成保健食品或運動飲料中包括維生素B12在內(nèi)的多種水溶性維生素的同時檢測，該方法在較寬范圍內(nèi)線性關系良好（r≥0.997），檢出限 0.10 μg/g[13-14]。

在實際醫(yī)療診斷中，同型半胱氨酸、維生素B6、B9和B12常作為一組相關指標需同時測定，Shaik等[15]開發(fā)的快速分辨液相色譜法可同時測定人血清中的這四類物質(zhì)。流動相由甲醇和1-七磺酸鈉鹽（33∶67）與0.05%三乙胺的混合物組成，整個混合物的pH值調(diào)整為2.3，流速為0.5 mL/min，使用保持在28℃的C18柱（5 μm；150 mm×4.6 mm）在一個柱爐中分離，并在210 nm處進行檢測，該方法對四類物質(zhì)檢測范圍均為50 ng/mL～1 600 ng/mL，同型半胱氨酸、維生素 B6、B9和B12的檢測限值分別為 5、5、10、10 ng/mL，方法達到了良好的精度和準確性，并符合食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的要求。

2.2 微生物檢測方法

維生素B12具有多種分子構造和差異化的生物效價，微生物可有效識別，檢測方法具有結果可靠，檢出限低等優(yōu)點。沈泓等[16]利用萊士曼氏乳酸桿菌對維生素B12極高的靈敏性和特異性，通過控制該菌的繁殖程度，采用抗生素光度測量儀實時測控培養(yǎng)以及智能終點判斷，大大減少人工操作，提高了準確性，實現(xiàn)對維生素B12的定量檢測。微生物培養(yǎng)法適用于檢測食品中的微量維生素B12，在0.001 ng/mL～0.010 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好[17]。

微生物培養(yǎng)法操作繁瑣，步驟冗長等缺點限制了方法的實際應用范圍，為此多家公司開發(fā)了微孔板式微生物法定量檢測試劑盒，方法以Tris緩沖液稀釋樣品，加入凍干的萊士曼氏乳酸桿菌測試菌球，采用Costar 3599細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使用酶標儀測定結果，該方法回收率為89.9%～110.2%，定量檢測限為0.01 ng/g（mL）[18]。相比于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法，微孔板形式的微生物試劑盒法優(yōu)勢明顯，它不僅容易操作，而且數(shù)據(jù)更精準穩(wěn)定，平行性更好[19]。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked iImmunosorbent assay，ELISA）是在免疫酶技術的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術，是目前分析化學領域中的前沿課題之一。

李江等[20]使用60%甲醇-水對嬰幼兒配方奶粉樣本進行提取，通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定了樣本中的維生素B12。采用的維生素B12ELISA檢測試劑盒酶標板，包被有維生素B12抗原，并保持免疫活性，受檢樣品中的維生素B12與抗原反應后形成抗原抗體復合物，洗滌分離其他物質(zhì)后，加入酶反應底物，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標品中維生素B12的量直接相關，根據(jù)顏色反應的深淺進行定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度，實際檢測表明，該方法線性相關系數(shù)大于 0.996，范圍在 3 μg/kg～243 μg/kg，與高效液相色譜法檢測結果的相對標準偏差小于10%，方法操作簡便，準確靈敏。

Kong等[21]開發(fā)了一種間接競爭性酶聯(lián)免疫吸附法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，IC-ELISA）檢測不同食品中維生素B12的4種主要形式氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲鈷胺的方法，其檢測極限為0.065 ng/mL。檢測維生素片、能量飲料和嬰兒奶粉樣本中的維生素B12，采用IC-ELISA方法的回收率在81%～122%之間，因此，這種敏感且快速的方法，適合現(xiàn)場檢測和快速篩選大量樣本。

2.4 原子吸收光譜法

原子吸收光譜法是重要的維生素B12檢測方法，其原理主要利用了維生素B12中獨有的配位金屬元素鈷。Adolfo等[22]基于特定的Co譜線的相對豐度值，用高分辨率連續(xù)源原子吸收光譜法測定維生素B12樣品中的鈷，從而間接的測定樣品中維生素B12的含量，檢測限度為3.64 mg/L，用該方法檢測液體生物制劑時，甚至不需要對樣品做前期處理，非常方便實用。

2.5 電感耦合等離子檢測法

電感應耦合等離子體（inductively coupled plasma，ICP）是原子發(fā)射光譜的新型光源，可形成10000K溫度的等離子焰炬。用它做激發(fā)光源具有檢出限低、線性范圍廣、電離和化學干擾少、準確度和精密度高等分析性能。

王國玲等[23]建立了電感耦合等離子體質(zhì)譜（induc tively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS） 法間接測定B族維生素片中維生素B12含量的方法，樣品經(jīng)微波消解后，采用在線加入內(nèi)標校正基體效應，用ICP-MS測定鈷離子濃度間接測定樣品中維生素B12的含量。方法在 1.0 μg/L～100.0 μg/L線性范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.17%～3.03%，方法檢出限為0.014 mg/kg，適用于食品中維生素B12的測定。

聯(lián)用高效液相色譜的（high performance liquid chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）更方便了樣品的前處理，適用于各類配方食品或復雜基質(zhì)中維生素B12的測定。劉杰[24]將樣品經(jīng)0.01 mol/L鹽酸液化定容后，在HLB固相萃取小柱上分別用7%和25%乙腈溶液淋洗和洗脫樣品，高效液相色譜C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，3μm）進行分離，甲醇-8mmol/L乙酸銨水溶液（19∶81，體積比）為流動相，等度洗脫，用ICP-MS測定鈷離子濃度并間接測定樣品中維生素B12的含量。試驗結果表明，在7 min內(nèi)可完成化合物的分析，目標化合物出峰峰型較好，維生素B12在0.1 μg/L～500 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)為0.999，檢出限為0.02 μg/kg，高效液相色譜的引入使（HPLC-ICP-MS）檢出能力明顯優(yōu)于（ICP-MS）。

2.6 電化學傳感器方法

在過去的幾十年里，電化學傳感器是研究人員最感興趣的話題之一。他們在食品質(zhì)量的確定、臨床問題的控制和診斷以及代謝控制等方面被廣泛應用。

Yang等[25]利用單分子修飾電極建立了半衍生伏安法檢測維生素B12。維生素B12在0.01 mol/L HCl溶液中，以100 mV/s為單位，在自行組裝的亞硫代乙酸修飾金電極上，通過CN-裂化完成的單電子轉(zhuǎn)移，將主要的Co（iii）形式直接還原為0.21 V，而后一種物種則與basing-B12r相平衡，其在0.16 V時立即被還原為B12s。維生素B12的擴散會控制陰極的峰值電流，0.21 V的半導伏安度峰值電流與維生素B12的含量在4.0×10-9mol/L～4.0×10-5mol/L 之間呈線性關系，檢測極限為1.0×10-9mol/L。該方法成功地應用于藥物制劑中維生素B12含量的測定。

Nisansala等[26]創(chuàng)造了一種用于食品和醫(yī)藥產(chǎn)品中維生素B12檢測的簡單、靈敏、低成本微流體紙質(zhì)電化學傳感裝置。分別用銀導電油墨和石墨粉制作了參考電極和反電極，以200mV/s的掃描率，5 mmol/L～25 mmol/L濃度的維生素B12在+2V時的循環(huán)伏安圖電流具有線性關系。

Moazeni等[27]在金電極表面組裝了一維形態(tài)的D-苯丙氨酸，通過循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）、電化學阻抗譜法（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）和差分伏安圖（differential pulse voltammetry，DPV）研究了改性電極的電化學性能。最后，通過測量不同濃度的維生素B12，得到此生物傳感器的檢測限為 1.6 μmol/L。

診斷工具中納米材料的使用和進步，通過提高傳感器的性能創(chuàng)造了一個極好的檢測前景。Parvin等[28]在三嗪樹狀聚合物（ferromagnetic nanoparticles/triazine dendrimer，F(xiàn)MNPs@TD）的存在下，對金電極（Au）加入鐵磁性納米顆粒，通過吡咯（Py）的電聚合，構建了一種對維生素B12高靈敏度和選擇性的新型電化學傳感器。金/聚吡咯/鐵磁性納米顆粒/三嗪樹狀聚合物電極對丁烷-羅賓遜緩沖液中的維生素B12還原具有電催化活性。由此產(chǎn)生的傳感器在具有較寬的測定線性范圍（2.50 nmol/L～0.5μmol/L）和高重現(xiàn)性響應（RSD2.3%），該傳感器應用于食品樣品中維生素B12的測定時，還具有低干擾和長期穩(wěn)定性。

2.7 表面離子共振方法

表面等離子共振（surfaceplasmonresonance，SPR）是一種光學現(xiàn)象，可被用來實時跟蹤在天然狀態(tài)下生物分子間的相互作用。先將一種生物分子（靶分子）鍵合在生物傳感器表面，再將含有另一種能與靶分子產(chǎn)生相互作用的生物分子（分析物）的溶液注入并流經(jīng)生物傳感器表面。生物分子間的結合引起生物傳感器表面質(zhì)量的增加，導致折射指數(shù)按同樣的比例增強，生物分子間反應的變化即被觀察到。這種方法對生物分子無任何損傷，且不需任何標記物。

孫明君等[29]利用表面等離子共振技術，建立了快速定量測定牛奶中維生素B12的方法。將鈷胺素共價偶聯(lián)到表面等離子共振芯片CM5表面，并對競爭結合的維生素B12結合蛋白的結合濃度進行優(yōu)化，成功檢測了牛奶產(chǎn)品中維生素B12含量。結果表明，制備的芯片穩(wěn)定，50個循環(huán)相對標準偏差（RSD）小于10%，方法的檢測限為0.006 μg/100 g，回收率為92.1%～104.1%。所建立的方法可以在6 h內(nèi)完成樣品的前處理和檢測，是一種簡便、快捷的定量檢測方法。

2.8 熒光分子探針法

熒光分子探針檢測的最大特點是設備簡單、操作簡便、分析速度快及靈敏度高，近年來成為化學檢測領域的持續(xù)熱點。

Selvakumar等[30]建立了一種基于dipstick的免疫化學發(fā)光生物傳感器，該方法是一種直接競爭型格式，將維生素B12抗體固定在硝化纖維素膜上，然后用維生素b12-堿性磷酸酶結合維生素B12以便于競爭反應。用底物 2-氯-5-（4-甲氧基螺）{1，2-二氧基環(huán)-3，2 美分-（5美分-氯基）三環(huán)[3.3.1.13]decan}-4-YL）-1-苯基磷酸（cdp-star）進一步處理，生成化學發(fā)光，所產(chǎn)生的光子數(shù)量與維生素B12濃度成反比。經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化后，檢測的極限為1 ng/mL。該方法適用于能量飲料樣品中維生素B12的準確、敏感和高通量篩選。

其它多種構建方式的熒光分子探針也用于維生素B12的檢測，如：基于RNA核酸適配體的金納米粒子比色傳感器[31]，納米級的氧化石墨烯[32]以及熱還原碳點（t-cd）熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器[33]等。

最新型的熒光分子探針材料是碳量子點（carbon quantum dots，CQDs），CQDs作為一種新興的 0 維碳納米材料，自從2006年第一次被發(fā)現(xiàn)以來，一直受到廣泛的關注并迅速發(fā)展成為一種優(yōu)良的熒光納米材料，賀平等[34]介紹了其中紅色熒光碳量子點的光譜特性。

Li等[35]以硝酸硫胺（TN）為單體材料，采用一鍋水熱法制備了量子產(chǎn)率為10.4%的氮硫共摻雜碳量子點（N，S-doped carbon quantum dots，N，S-CQDS）。隨著維生素B12濃度的增加，N、S-CQD（作為供體）向維生素B12/酒石酸（作為受體）的能量轉(zhuǎn)移速率和效率也會增加，并且會隨著激發(fā)波長的變化而變化（從338 nm到408nm）?；诖嗽碓O計的一種多功能熒光探針，用于維生素B12的檢測限為15.6 nmol/L，回收率97.5%～104.2%。

Wang等[36]通過對聚胱氨酸二磷酸膽堿（cdpc）和乙二胺的熱解，開發(fā)了一種綠色、低成本、直接的合成高熒光仿生碳量子點（bioinspired carbon quantum dots，B-CQDs）。在450 nm波長下發(fā)射強的熒光對維生素B12具有高選擇性的超聲波敏感能力，測定發(fā)現(xiàn)維生素B12的檢測限值低至 81 nmol/L。同時，3-（4，5）-二甲基硫亞氮（-z-y1）-3，5-苯基四氮酰胺（mtt）、溶血測定和紅細胞形態(tài)表征的結果證實了（B-CQDs）良好的低毒性和生物相容性，可以作為一種有效的熒光傳感探針，用于生物樣品中維生素B12的無標簽敏感和選擇性檢測。人類宮頸癌細胞（hela）的成像試驗證明，（BCQDs）已成功應用于活細胞中維生素B12的檢測，并具有在人體內(nèi)擴大應用的潛力。

相比于傳統(tǒng)染料分子和半導體材料，CQDs除了具有良好的抗光閃爍性和抗光漂白性，還具有杰出的低毒性和生物相容性[37]，這使得近些年CQDs在生物成像和光學探針等領域得到了廣泛研究，CQDs熒光分子探針對維生素B12檢測已達到生物學意義的水平。

2.9 其他檢測方法

在多學科技術進步的引領下，現(xiàn)代檢測技術已經(jīng)進入了全面開花的時代。Gustavo等[38]使用流動式膜透析分析系統(tǒng)，實現(xiàn)了牛奶中維生素B12的在線監(jiān)測。首先用三氯乙酸和離心法對牛奶樣品進行預處理，以消除蛋白質(zhì)和脂肪，然后使用透析器結合流動連續(xù)歧管，對維生素B12進行透析，并在361 nm對其進行分光光度監(jiān)測。該方法適用于不同種類的牛奶（脫脂牛奶和半脫脂牛奶、淡奶、無乳糖牛奶、液體和全粉牛奶）的快速在線檢測，方法的相對標準差為0.45%，透析率為5.8%。

光在發(fā)生拉曼散射后其頻率會發(fā)生變化，不同原子團振動的頻率是惟一的，因此拉曼光譜被稱為“指紋光譜”，可以照此原理鑒別出組成物質(zhì)的分子種類，表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman scattering，SERS）結合了分子指紋特異性和潛在的單分子敏感性，使拉曼光譜分析技術出現(xiàn)了質(zhì)的飛躍，Radu等[39]使用SERS技術實現(xiàn)了食品中維生素B2和維生素B12的同時檢測。

Li等[40]使用硼酸仿射導向表面印跡制備了維生素B12的分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）。首先將維生素B12模板共價固定在硼酸功能磁性納米粒子表面，隨后通過水聚合形成聚苯胺乙醇的薄印跡涂層來覆蓋基板表面，去除模板后，在印跡層中形成與模板分子大小和形狀互補的三維腔體。印跡涂層親水性強，殘留硼酸有限，避免了非特異性結合。制備的MIP微粒子具有良好的特異性和較高的結合強度，成功地應用于牛奶中維生素B12的分析。

3 總結與展望

本文綜述了目前人類血液、血清、尿液、體細胞、食品和藥品中維生素B12的測定。其中以光譜學為重點的現(xiàn)行方法是主要檢測方式，包括原子吸收，電感耦合等離子發(fā)射光譜，熒光分子探針為主的化學發(fā)光測量，表面等離子體共振和拉曼光譜等，以對維生素B12超高的靈敏度成為近年來的研究熱點和前沿領域，適用于食品、生物以及醫(yī)學監(jiān)測領域。電化學傳感器則以出色的自動監(jiān)控功能在食品質(zhì)量的確定、臨床問題的控制和診斷以及代謝控制等方面被廣泛應用。液相色譜為代表的色譜和質(zhì)譜技術作為現(xiàn)代實驗室的主流分析設備，以其通用性強而被檢測工作者廣泛接受。微生物檢測法雖然程序繁瑣，但作為獨特的活性維生素B12生物識別方法，成為嬰幼兒食品以及部分國家的法定方法組成。酶聯(lián)免疫吸附測定法則是成功的快檢方法，適合現(xiàn)場檢測和大量樣本快速篩選。隨著維生素B12認知的不斷提高，以上這些有發(fā)展前途的技術，會在增強方法靈敏度和使用途徑上不斷發(fā)展，以提高維生素B12檢測的重現(xiàn)性、選擇性和速度。