不同小麥品種(系)的存放種子活力比較研究

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(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

種子是作物生產(chǎn)的基本材料，高質(zhì)量種子是保障作物高產(chǎn)的關(guān)鍵因素[1]。種子活力是綜合反映種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，決定種子在多變的田間條件下快速均勻出苗和發(fā)育的潛力，是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一。大田生產(chǎn)條件下,高活力種子出苗整齊一致，出苗速度快，確保了苗齊苗壯，為高產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，同時有利于遏制雜草滋生。低活力種子則出苗不齊，出苗速度慢，易造成缺苗斷壟，致使作物減產(chǎn)。種子活力不僅影響作物田間的成苗與生長情況，也反映了種子對不良環(huán)境因子的適應(yīng)能力[2]。喬燕祥等[3]研究發(fā)現(xiàn)同一種作物不同品種的種子活力差異明顯，抗老化和耐貯性各異。

種子活力的評價方法可分為直接法和間接法兩類。直接法是觀測種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)和幼苗質(zhì)量等形態(tài)特征。間接法則是測定種子浸出液的電導(dǎo)率、丙二醛含量、抗氧化酶活性和淀粉酶活性等與種子活力相關(guān)的生理生化指標(biāo)。《國際種子檢驗規(guī)程》對這些方法進(jìn)行了描述和推薦[4]，為準(zhǔn)確進(jìn)行不同作物的種子活力檢測提供了標(biāo)準(zhǔn)。

小麥?zhǔn)俏覈谌蠹Z食作物，2017年全國小麥種植面積約為0.24億hm2。小麥產(chǎn)量的多少直接關(guān)系到我國的糧食安全。篩選和應(yīng)用高種子活力小麥品種對確保小麥田間出苗率，提高小麥產(chǎn)量具有重要意義。本研究以置于常溫種子庫老化6年的180個小麥品種(系)的種子為材料，分別進(jìn)行了發(fā)芽率、電導(dǎo)率、含水量和籽粒品質(zhì)性狀的測定，對電導(dǎo)率、含水量、總蛋白和淀粉含量與發(fā)芽率之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，并對種子活力高低差異顯著的6個品種進(jìn)行了內(nèi)源激素含量的測定和分析，以期揭示不同小麥品種(系)間種子活力差異及其內(nèi)在生理原因，為小麥種子活力的研究和高活力品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為本實驗室保存的180個不同小麥品種(系)的種子，這些品種(系)主要來自陜西、河南、山東和江蘇等省份。2009年10月將180個小麥材料播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)楊凌試驗農(nóng)場，每個材料種2行，行長1 m，株距5 cm，行距25 cm，期間進(jìn)行防病、防蟲處理，2010年6月各材料單收單脫后進(jìn)行充分晾曬，直至種子含水量降至10%左右。種子過8目種子篩，去除破損籽粒和雜質(zhì)后裝入紙質(zhì)種子袋，置于木質(zhì)種子柜中室溫貯藏6年。

1.2 種子發(fā)芽率的測定

2016年10月，用2%次氯酸鈉(NaClO)對貯藏6年的種子進(jìn)行消毒處理，置入鋪有2層濾紙作發(fā)芽床的發(fā)芽盒(規(guī)格為：11.5 cm×11.5 cm×5 cm)中，將發(fā)芽盒放入RXZ型智能人工氣候室中進(jìn)行萌發(fā)實驗，人工氣候室設(shè)定溫度為22 ℃，濕度60%。發(fā)芽試驗設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)100粒，發(fā)芽過程中適時補(bǔ)水，發(fā)芽第7天統(tǒng)計發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(第7天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.3 種子電導(dǎo)率測定

采用雷磁DDS-307電導(dǎo)率儀進(jìn)行測定，以蒸餾水為空白對照(L0)，每個品種(系)隨機(jī)選取50粒均勻完整的種子稱重(m)，用蒸餾水沖洗3次，放入含有250 mL蒸餾水的燒杯中，20 ℃浸泡24 h后測定其電導(dǎo)率(L1)，100 ℃處理30 min，待冷卻后補(bǔ)充蒸餾水至原來位置，再次測定其電導(dǎo)率(L2)。分別按以下公式計算電導(dǎo)率、相對電導(dǎo)率、絕對電導(dǎo)率：

1.4 種子含水量和籽粒品質(zhì)性狀測定

用Perten DA 7250谷物近紅外分析儀測定180個小麥品種(系)的種子含水量、蛋白質(zhì)和淀粉含量，每個品種(系)取10 g干種子，進(jìn)行3次重復(fù)試驗。

1.5 種子激素含量測定

根據(jù)發(fā)芽率測定結(jié)果從180個小麥材料中篩選種子活力最高和最低的小麥品種各3個，分別取3粒種子放入研缽中磨碎，稱取0.1 g樣本，加入1 mL預(yù)冷的80%甲醇，4 ℃浸提過夜(12 h)。4 ℃，8 000 g條件下離心15 min，取上清液置于4 ℃保存。殘渣再用0.5 mL預(yù)冷的80%甲醇浸提2 h，再次離心15 min(4 ℃，8 000 g)后取上清液，合并2次上清液。并在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)至不含有機(jī)相(約剩0.3 mL水溶液)，加入0.1 g PVPP吸附酚類及色素，并于4 ℃下振蕩1 h，以8 000 g/min離心10 min，棄去雜質(zhì)。以2 MHCl 調(diào) pH值至2.5，用等體積乙酸乙酯萃取3次，將有機(jī)相(即乙酸乙酯相)轉(zhuǎn)移至新的離心管中，氮吹至干，加入0.5 mL甲醇溶解,用0.45μm濾膜的針頭式過濾器過濾于液相樣品瓶內(nèi)待測。

表1 供試小麥品種(系)

激素含量測定采用安裝有Kromasil C 18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)的Rigol L 3000高效液相色譜儀進(jìn)行測定，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10μL，流速為0.8 mL/min；用甲醇和0.6%冰醋酸作流動相進(jìn)行梯度洗脫；走樣時間為30 min，檢測波長為UV 254 nm；定量方法為外標(biāo)校準(zhǔn)曲線法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各項測定結(jié)果采用Excel 2016軟件進(jìn)行計算，用R(version 3.5.0)對發(fā)芽率結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并聚類分析，利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析、線性回歸分析和獨立樣本T檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同小麥品種(系)間種子自然老化后的種子活力分析

發(fā)芽率與種子活力呈正相關(guān)關(guān)系，是反映種子活力最為直接的指標(biāo)。因此，以常溫種子庫老化6年的種子發(fā)芽率為指標(biāo)來評價種子活力的高低。種子發(fā)芽率測定表明，經(jīng)過6年的自然老化后，180個小麥品種(系)的平均發(fā)芽率降低至11.16%。不同小麥材料之間的發(fā)芽率存在較大差異，64.64%的品種(系)發(fā)芽率降低至10%以下，其中35個材料(接近1/5比例)完全喪失發(fā)芽能力，發(fā)芽率在50%以上的僅有7個品種，僅占總數(shù)的 3.87%，其中豫麥18的發(fā)芽率(92%)最高，種子活力最強(qiáng)，其次是西農(nóng)3517(76%)和瀏虎98(72%)。

圖1 180個小麥品種(系)發(fā)芽率的頻率分布

以貯藏6年后的種子發(fā)芽率為指標(biāo)，運用R語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用層次聚類法對180個樣品(系)進(jìn)行聚類分析(圖2)。180個小麥品種(系)被聚成兩大類群，第Ⅰ大類群由14個品種(系)組成，其種子發(fā)芽率較高，發(fā)芽率分布范圍為42%～92%，這一類群又細(xì)分為2個亞類，豫麥18、西農(nóng)3517和瀏虎18共3個品種發(fā)芽率最高，為Ⅰa亞類，其他為Ⅰb亞類；第Ⅱ大類群共166個品種(系)，這些品種(系)種子發(fā)芽率較低，種子活力較低，其中以19%的發(fā)芽率為界線分為Ⅱa和Ⅱb 2個亞類。

續(xù)表1

編號品種(系)名 編號品種(系)名 編號品種(系)名 編號品種(系)名 9307-804115遠(yuǎn)豐139137豫同69159XN10-29407-423116西農(nóng)1376138TM3698160周黑麥1號9504-0502117西農(nóng)386139西農(nóng)0210161周麥2496西農(nóng)2001118綿陽35140鄭育麥9987162周992339703-4083矮119遠(yuǎn)豐175141關(guān)東107163濟(jì)麥229802-1090120周98165142加豐164濟(jì)麥209903-4083121周17143中4165周麥25100鄭麥366122美麥DNS144科農(nóng)181166武農(nóng)986101R112304Rd-1145西農(nóng)4211167西農(nóng)886102花培5號124周麥16146加大穗168XN10-1103N9820125J-1B147西農(nóng)198169A189104衡562126豫麥18148日本百火170A323105衡5127秦農(nóng)126149山農(nóng)18171豐收60106N9817128陜556150山農(nóng)14172皖麥9908107衡5364129西農(nóng)837151陜糯1號173淮麥0308108衡矮130西農(nóng)3399152西農(nóng)939174阜98-46109早熟6061131煙農(nóng)19153豫農(nóng)94917580909110西農(nóng)501132小偃270154泰山23176陜319111LK78-3R133R164155342177咸陽2344112A177134濮麥9號156陜墾99178陜354113分33135陜麥94157384179陜農(nóng)28114225-21136澳標(biāo)白麥158116-422180陜農(nóng)33

2.2 種子活力與電導(dǎo)率間的相關(guān)分析

發(fā)芽率與電導(dǎo)率的相關(guān)分析表明，發(fā)芽率與電導(dǎo)率和絕對電導(dǎo)率分別呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)(表2)，說明電導(dǎo)率的測定可以較好地評估小麥種子活力。由于相對電導(dǎo)率與萌發(fā)率相關(guān)不顯著，僅對電導(dǎo)率和絕對電導(dǎo)率與發(fā)芽率進(jìn)行了線性回歸分析。

表2 小麥種子發(fā)芽率與電導(dǎo)率的相關(guān)性

注：“*”表示在0.05水平上顯著相關(guān)，“**”表示在0.01水平上極顯著相關(guān)。下同。

根據(jù)電導(dǎo)率與發(fā)芽率的散點分布，電導(dǎo)率最高為16.454μS/m，最低為3.558μS/m。不同小麥品種(系)在6年自然老化條件下，品種差異雖然明顯，但普遍集中于一個區(qū)域，即在電導(dǎo)率4～10μS/m之間，發(fā)芽率在20%以下；而絕對電導(dǎo)率最高可達(dá)29.219μS/m，最低為5.062μS/m，點富集在電導(dǎo)率5～20μS/m之間，20%的發(fā)芽率以下。兩者的線性回歸方程說明了不同小麥品種(系)間電導(dǎo)率、絕對電導(dǎo)率和發(fā)芽率的顯著負(fù)相關(guān)性。發(fā)芽率越低，電導(dǎo)率和絕對電導(dǎo)率越高，說明老化種子發(fā)芽率降低可能是由于細(xì)胞膜在貯藏過程中氧化受損導(dǎo)致的。

2.3 種子活力與含水量、籽粒品質(zhì)性狀間的相關(guān)分析

對貯藏6年的180個小麥品種(系)進(jìn)行發(fā)芽率與含水量、籽粒品質(zhì)性狀間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率與種子淀粉含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到r=-0.356(p<0.01) ，與水分含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0.183(p<0.05)，而與種子蛋白質(zhì)含量相關(guān)不顯著。

表3 小麥種子萌發(fā)與含水量、籽粒品質(zhì)性狀間的相關(guān)分析

圖2 180個小麥品種(系)發(fā)芽率的聚類分析圖

將聚類分析的Ⅰ和Ⅱ兩類群品種籽粒的水分、蛋白質(zhì)和淀粉含量進(jìn)行獨立樣本T檢驗，發(fā)現(xiàn)不同類群間品種種子的水分和蛋白質(zhì)含量差異不顯著，但淀粉含量存在極顯著差異。

2.4 種子活力與內(nèi)源激素含量間的關(guān)系

種子內(nèi)源激素是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素，為了進(jìn)一步揭示造成種子活力變化的內(nèi)在生理基礎(chǔ)。從180個小麥品種(系)中挑選出種子活力最高和最低的小麥品種各3個進(jìn)行GA3和ABA激素含量測定， 結(jié)果表明，3個高活力品種種子的GA3含量均明顯高于低活力種子的，不同品種間種子ABA含量與種子活力間無明顯對應(yīng)關(guān)系；但GA3/ABA比值在種子活力高、低不同的品種間差異明顯，3個高活力品種種子的GA3/ABA比值均大于0.9，而3個低活力種子的GA3/ABA比值則分布在0.5～0.7之間，后者明顯低于前者，另外，3個高活力品種發(fā)芽率的高低排序與GA3/ABA比值的高低排序也一致，如，豫麥18發(fā)芽率最高，GA3/ABA比值也最高，然后依次為西農(nóng)3517和瀏虎98(表4)。以上結(jié)果表明，小麥品種種子的GA3含量和GA3/ABA比值對種子萌發(fā)影響較大，這與前人研究相一致。

圖3 不同小麥品種(系)的種子電導(dǎo)率與發(fā)芽率的線性回歸圖

圖4 不同小麥品種(系)的種子絕對電導(dǎo)率與發(fā)芽率的線性回歸圖

表4 種子活力高、低不同小麥品種間種子發(fā)芽率和相關(guān)激素含量比較

注：小寫字母表示在0.05水平上顯著性差異，大寫字母表示在0.01水平上極顯著性差異。

3 討 論

成熟干燥種子的代謝處于相對停滯狀態(tài)，但一旦受到發(fā)芽誘導(dǎo)則細(xì)胞代謝被重新激活，最終促成種子萌發(fā)，因此種子內(nèi)必然存在長期維持這種低代謝活性狀態(tài)的機(jī)制[5]。種子的代謝活動受到自然氧化環(huán)境的影響會發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，其中包括ROS和有毒物質(zhì)的積累、蛋白質(zhì)的氧化和核酸的損傷、合成及修復(fù)能力的降低等[6]。種子活力的形成和維持既受遺傳因素的影響，也受環(huán)境因素及貯藏條件的影響。種子在老化過程中會發(fā)生一系列劣變，如細(xì)胞膜在自然氧化下受到損傷、發(fā)芽遲緩、發(fā)芽率下降、萌發(fā)過程中對逆境的耐受性下降等[7]，氧化損傷的不斷積累和種子抵抗和修復(fù)損害的能力變?nèi)酰罱K會導(dǎo)致種子活力的喪失[8-9]。本研究中，180個小麥品種(系)經(jīng)過6年自然老化，大部分種子的活力明顯下降，平均發(fā)芽率僅為11%，有近五分之一品種的種子完全喪失萌發(fā)力，但也有少數(shù)品種仍表現(xiàn)出較高的種子活力。由此可見，經(jīng)自然老化后品種間的萌發(fā)率差異顯著，這主要是由于品種間的遺傳與生理上的差異造成的。

種子在老化過程中，細(xì)胞膜氧化受損，通透性增大導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)滲出[10-11]，影響種子壽命，壽命較長的種子其細(xì)胞膜趨于更穩(wěn)定[12]。種子吸脹初期，細(xì)胞膜重建和損傷修復(fù)的能力影響電解質(zhì)和可溶性物質(zhì)外滲的程度，膜修復(fù)越快，外滲物質(zhì)越少，電導(dǎo)率也越低。因此種子浸出液的電導(dǎo)率能較好地評價種子的質(zhì)量和耐貯性。隨著老化時間的加長，種子的細(xì)胞膜受損加重，種子浸出液的電導(dǎo)率都會出現(xiàn)不同程度的持續(xù)上升現(xiàn)象，但不同基因型小麥品種間差異較大[13-15]。本研究對自然老化后的180個不同小麥品種(系)的種子浸出液進(jìn)行電導(dǎo)率、相對電導(dǎo)率和絕對電導(dǎo)率的測定，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率與電導(dǎo)率呈極顯著負(fù)相關(guān)，與絕對電導(dǎo)率呈顯著負(fù)相關(guān)，而與相對電導(dǎo)率相關(guān)不顯著。對同一品種隨老化程度加劇電導(dǎo)率的變化尚待進(jìn)一步研究。

水分是影響種子生化老化反應(yīng)的主要因素之一[16]，本研究發(fā)現(xiàn)，6年自然老化后小麥品種(系)的種子水分含量與發(fā)芽率呈顯著負(fù)相關(guān)，隨著老化后種子含水量的增加，種子壽命顯著縮短。在成熟的干燥種子中發(fā)現(xiàn)，種子含水量低導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)高度粘稠[17]，代謝減少，呼吸作用微弱，大部分酶處于鈍化狀態(tài)，生理活動受到抑制，能量消耗維持在較低水平[18]；種子含水量高且處于有氧條件下會引起一系列的代謝變化，例如呼吸增加、活性氧積累、膜完整性喪失和儲備物質(zhì)(蛋白質(zhì)和糖含量)消耗加快，從而導(dǎo)致種子活力降低[19-20]，本研究證實了這些結(jié)果。

種子老化后其發(fā)芽率與淀粉含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，而與蛋白質(zhì)含量相關(guān)不顯著。Rajjou等研究表明，盡管干燥種子的代謝相對靜滯，但是在成熟種子的貯藏期間會發(fā)生分子和代謝變化[6]。在長期自然老化過程中，小麥種子貯藏物質(zhì)如糖類、蛋白質(zhì)代謝經(jīng)歷了動態(tài)變化的過程，這兩者對種子的萌發(fā)都有著極其重要的作用。根據(jù)前人的研究，種子中淀粉和蛋白質(zhì)含量會隨著老化程度的加深而減少[21-22]。小麥種子經(jīng)過6年貯藏，高活力種子中淀粉含量明顯低于小麥種子正常的淀粉含量范圍(57%～75%)[23]，失活種子的代謝終止，淀粉消耗停止，而未失活的種子仍維持著休眠狀態(tài)的呼吸，淀粉含量隨老化時間加長而明顯減少，因而在貯藏6年的小麥品種(系)中淀粉含量與發(fā)芽率呈負(fù)相關(guān)，說明儲藏物質(zhì)代謝的維持對小麥種子壽命起重要作用。

植物的生長發(fā)育受多種激素之間復(fù)雜的相互作用調(diào)控，其中包括種子的休眠與萌發(fā)。赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)是調(diào)控該相關(guān)生理過程的的兩大關(guān)鍵激素，兩者拮抗互作介導(dǎo)種子的休眠和萌發(fā)過程[24]。GA3能打破種子休眠，提高種子體內(nèi)IAA的含量從而誘導(dǎo)α-淀粉酶的活性，加速胚乳中淀粉水解，促進(jìn)種子發(fā)芽。而ABA通過抑制吸水從而抑制細(xì)胞壁松動來限制胚的生長潛力，這是誘導(dǎo)種子休眠并限制萌發(fā)的關(guān)鍵步驟[25]。GA3與ABA的合成及信號傳導(dǎo)并非獨立，而是彼此互作。實質(zhì)上，控制種子休眠和萌發(fā)并非取決于GA3和ABA激素的絕對含量，而是取決于兩者的相對含量[26-27]。對種子活力高低差異明顯的兩組小麥品種進(jìn)行了GA3和ABA的含量測定，發(fā)芽率高的品種中GA3/ABA明顯高于發(fā)芽率低的品種，其中豫麥18的發(fā)芽率最高，GA3/ABA值也相應(yīng)最高。

綜上，本試驗研究了不同小麥品種(系)在自然老化6年后的活力差異及與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性，試圖對種子活力差異的內(nèi)在生理原因進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)不同品種間的種子活力存在較大變異，這為品種遺傳改良提供了可能。種子的休眠、萌發(fā)和種子活力的維持是一個相互關(guān)聯(lián)的、極其復(fù)雜的生理生化過程，要真正了解種子活力的本質(zhì)，必須從激素調(diào)控、核酸修復(fù)、代謝水平和環(huán)境影響等各方面進(jìn)行系統(tǒng)研究。目前關(guān)于種子活力的調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，了解和理解控制其復(fù)雜機(jī)制將具有非常重要的生態(tài)、農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)意義。