羊水細胞染色體核型分析結(jié)合CMA在孕婦產(chǎn)前診斷中的應用分析

曾研章

廣東省陽江市婦幼保健院，廣東陽江 529500

產(chǎn)前診斷在預防出生缺陷胎兒中是一條主要的途徑，羊膜腔穿刺羊水細胞染色體核型分析是用于產(chǎn)前診斷染色體異常的“金標準”，對于非整倍體的檢出率較高，對于10Mb及以上的缺失或重復、胎兒染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常均可作出全面的分析[1]。染色體微陣列分析（CMA）對于出生缺陷、出生畸形與智力低下都有顯著的評估價值[2]?；诖?，本研究選擇2018年4月～2019年3月我院行產(chǎn)前診斷的126例孕婦為研究對象，所有孕婦均接受羊水細胞染色體核型分析，同時接受CMA分析，進一步探討羊水細胞染色體核型分析結(jié)合CMA用于產(chǎn)前診斷的價值，現(xiàn)報道如下。

表1 非整倍體異常檢測結(jié)果

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月～2019年3月我院行產(chǎn)前診斷的126例孕婦為研究對象，所有孕婦均自愿接受羊水細胞染色體核型分析和CMA檢測，均至少滿足以下一個產(chǎn)前診斷指征[3]：（1）35歲及以上高齡孕婦；（2）超聲異常，如羊水過多、羊水過少、胎兒超聲軟標記（胎兒頸項透明層增厚NT≥3mm、雙側(cè)脈絡叢囊腫、側(cè)腦室輕度增寬等）、胎兒發(fā)育異常、可疑畸形、嚴重先天性心臟病、胎兒水腫等；（3）不良妊娠史或夫妻中的一方有家族遺傳病史；（4）孕早期不良接觸史；（5）產(chǎn)前母血清經(jīng)篩查判定為高風險，或經(jīng)無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測（NIPT）判定為高風險或臨界風險；（6）經(jīng)無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測顯示異常，如提示可疑染色體微缺失或重復，可疑21、18和13以外的其他染色體異常者。孕婦年齡22～45歲，平均（32.4±3.3）歲，孕周12～35周，平均（22.4±5.2）周，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有孕婦及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 染色體核型分析：培養(yǎng)基、秋水仙素、KCL溶液、植物血細胞凝集素、胰蛋白酶液、甲醇、冰乙酸、NaOH溶液、細胞培養(yǎng)箱、生理鹽水均由南京道斯夫生物科技有限公司提供、全自動染色體分析儀（美國貝克曼庫爾特）、Giemsa染色液（上海素爾生物科技有限公司），CMA檢測（Affymetrix公司）：DNA提取試劑盒、微陣列芯片、OMIM、ISCA、DGV、UCSC等數(shù)據(jù)庫查詢數(shù)據(jù)。

1.2.2 方法 （1）羊水細胞染色體核型分析：常規(guī)消毒后在超聲引導下進行羊膜腔穿刺術(shù)抽取25mL羊水，分別置入3支無菌離心管，經(jīng)1400r/min離心10min，去除上清液并加入羊水培養(yǎng)基制備細胞懸液，按照三線接種在培養(yǎng)瓶中，放入5%二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，7 ～ 8d換液，培養(yǎng)10d左右根據(jù)細胞的生長情況收獲，常規(guī)制片，CTG-胰酶顯帶，在顯微鏡下進行染色體核型分析，30個分裂相計數(shù)，分析5個核型，存在異常核型時增加計數(shù)量。（2）CMA檢測：羊水10mL送檢，微陣列芯片為Affymetrix公司提供，按照Affymetrix公司流程進行檢測，微陣列芯片包含200 000 SNP標記與550 000 CNV標記，1個標記平均4kb密度分布在人類整個基因組（非全染色體基因組所有位點），對全基因組中有臨床意義的染色體微缺失、微重復、染色體拷貝數(shù)變化、雜合性缺失進行檢測。通過在線公共數(shù)據(jù)庫、醫(yī)院數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 胎兒染色體非整倍體異常

CMA檢測顯示胎兒染色體非整倍體異常與羊水細胞染色體核型分析結(jié)果一致，無差異，見表1；且所有染色體非整倍體異常均檢測出，并且對于核型分析無法確定異常片段來源與性質(zhì)的，CMA檢測顯示了DNA水平的精細結(jié)果，其中47，XN，+mar病例無法確定的標記染色體，經(jīng)CMA檢測確定為22號染色體22q11.1q11.21區(qū)段有1.7Mb片段的2次重復，顯示胎兒為額外idic（22）（q11.2）標記染色體攜帶者。同時，CMA檢測還能夠檢測出額外的、具有臨床意義的基因拷貝數(shù)，如21-三體綜合征的1例胎兒1號染色體1q21.1q21.2區(qū)段存在1.8Mb片段重復，含OMIM基因13個。但CMA檢測無法發(fā)現(xiàn)胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常，如21-三體綜合征的1例胎兒，染色體核型為47，XN，+21，der（21：21）（q10：q10）。

2.2 胎兒染色體不平衡變異

經(jīng)羊水細胞染色體核型分析顯示3例胎兒染色體不平衡易位，對胎兒父母外周血染色體核型進行分析顯示，其中2例為平衡易位攜帶者，另1例經(jīng)高分辨率染色體核型分析顯示父親18號染色體臂間倒位。染色體不平衡變異均來源于遺傳。經(jīng)CMA檢出染色體不平衡變異與染色體核型分析結(jié)果相同，并且更加精確的作出異常定位，顯示亞顯微水平的微缺失與微重復。見表2。

2.3 胎兒染色體嵌合體異常

經(jīng)染色體核型分析顯示，2例胎兒染色體嵌合體異常，其中1例顯示為低水平嵌合，CMA檢測無法完全檢出，另1例染色體核型分析結(jié)果與CMA檢測一致，并且CMA檢測顯示出更為精確的異常位點，見表3。

2.4 羊水細胞染色體核型分析正常但CMA異常的結(jié)果

經(jīng)羊水細胞染色體核型分析顯示有3例正常胎兒經(jīng)CMA檢測為異常，檢出拷貝數(shù)變異片段大小為496.8kb、827.2kb、16.7Mb，見表4。經(jīng)多個數(shù)據(jù)庫的分析顯示，片段內(nèi)涉及的OMIM基因均與胎兒表型疾病相關，因此本次受檢孕婦中3例羊水細胞染色體核型分析正常但CMA異常的胎兒拷貝數(shù)具有致病性，CMA技術(shù)檢出率比羊水細胞染色體核型分析提高2.38%（3/126）。

表2 胎兒染色體不平衡變異檢測結(jié)果

表3 胎兒染色體嵌合體異常檢測結(jié)果

表4 羊水細胞染色體核型分析正常但CMA異常的結(jié)果

3 討論

產(chǎn)前診斷的對象主要為35歲以上的高齡產(chǎn)婦，以及母血清學篩查高風險、產(chǎn)前超聲異常的孕婦等[4]，染色體核型分析技術(shù)與細胞培養(yǎng)均是傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方式，但羊膜腔穿刺是一種有創(chuàng)操作，孕婦的接受度較差，因此產(chǎn)前診斷醫(yī)師對于羊膜腔穿刺指征的明確非常重要[5]。染色體微陣列分析（CMA）也被稱為染色體分子核型分析或基因芯片技術(shù)，包括有單核苷酸多態(tài)微陣列（SNP array）和比較基因組雜交微陣列（array CGH）[6]，可對全基因組進行精確、高分辨率的染色體微缺失與微重復的檢測，與羊水細胞染色體核型分析相比，其優(yōu)勢在于高分辨率、高通量、高自動化檢測，并且能夠?qū)υS多和先天性疾病與出生缺陷相關的基因組異常進行一次同步檢測[7]。

本研究以126例孕婦為研究對象，探討羊水細胞染色體核型分析結(jié)合CMA用于產(chǎn)前診斷的價值。結(jié)果顯示：（1）CMA技術(shù)用于產(chǎn)前診斷的有效性和準確性更高，對于染色體核型正常的CMA檢測可發(fā)現(xiàn)有基因拷貝數(shù)變異。經(jīng)羊水細胞染色體核型分析共檢測出胎兒染色體非整倍體異常12例，CMA檢測結(jié)果與之相同盡管CMA檢測無法發(fā)現(xiàn)胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常，但21三體綜合征的檢測是準確有效的，對于核型分析無法確定來源與性質(zhì)的異常片段，CMA能夠進行DNA水平的精細分析而獲得更為準確的結(jié)果，如22號染色體為額外idic（22）（q11.2）標記染色體攜帶者，涉及貓眼綜合征關鍵區(qū)域[8]，結(jié)果提示，CMA技術(shù)對于染色體核型分析可檢測到的變異，可精確地鑒定核型中未知額外的染色體內(nèi)容和來源，對于遺傳咨詢臨床解決決定具有指導意義[9-10]。（2）CMA檢出染色體不平衡變異與染色體核型分析結(jié)果相同，CMA技術(shù)可以更加準確地反映變異區(qū)帶、變異類型、基因數(shù)目，顯示亞顯微水平的微缺失和微重復，信息更加全面[11]。（3）經(jīng)染色體核型分析共檢測出胎兒染色體嵌合體異常2例，1例由于低水平嵌合，CMA檢測無法完全檢出，但對于高比例的嵌合體，CMA檢測顯示出更為精確的異常位點，Xp22.33q11.1區(qū)段61.7Mb片段缺失。結(jié)果提示，CMA對未培養(yǎng)的細胞檢測具有優(yōu)勢，培養(yǎng)后的嵌合情況由于正常細胞生長比異常細胞更具有優(yōu)勢而降低，因此不容易檢出[12]，在嵌合體檢出核型分析中還需要結(jié)合基因芯片。（4）羊水細胞染色體核型分析正常但CMA異常：由于CMA技術(shù)一次可同時對幾十萬甚至上百萬的DNA片段進行檢測，無論這些片段有無臨床意義，與個體變異有無關系均可檢測[13]，結(jié)合數(shù)據(jù)庫的應用明確基因拷貝數(shù)內(nèi)包含疾病的相關突變，以及基因致病突變的性質(zhì)[14]。本次結(jié)果中經(jīng)羊水細胞染色體核型分析顯示有3例正常胎兒經(jīng)CMA檢測為異常，檢出拷貝數(shù)變異片段大小為496.8kb、827.2kb、16.7Mb，通過基因型-表型分析，判斷為致病拷貝數(shù)，1例全前腦。唇腭裂臨床表型包括眼部異常、小腦發(fā)育不良；1例15號染色體增多臨床表型為智力障礙、腦發(fā)育異常；1例NT增厚缺失片段與智力障礙與身材矮小有關[15]。

綜上所述，CMA技術(shù)在孕婦產(chǎn)前診斷中的有效性和準確性更高，臨床上可以結(jié)合兩種檢測方式提高胎兒出生缺陷的檢出率。