應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)解析梅干菜中細(xì)菌多樣性

尚雪嬌，王玉榮，楊 江，折米娜，趙慧君，郭 壯，2*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.恩施市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 恩施 445000）

梅干菜又稱梅菜，是以雪里蕻、芥菜或油菜為主要原料，經(jīng)挑選、去根、清洗、除水、腌制和干制等傳統(tǒng)工藝制作而成的特色發(fā)酵蔬菜[1]。采用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)梅干菜時(shí)，制作環(huán)境相對(duì)開放，使得梅干菜中的微生物豐富且多樣。然而，目前對(duì)梅干菜的研究多集中于風(fēng)味物質(zhì)和微量元素測(cè)定[2-3]、抑菌和抗氧化能力分析[4-5]以及工藝優(yōu)化[6-7]等方面，有關(guān)其中微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究鮮見報(bào)道。

由于某些微生物的特殊生長(zhǎng)需求及培養(yǎng)條件的限制，基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物學(xué)手段只能將樣品中少于1%的微生物分離出來，而非培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)于這個(gè)問題的解決提供了很好的幫助[8]。近年來，以Illumina MiSeq為代表的高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，為分析生境菌群多樣性提供了有力手段，該技術(shù)無需對(duì)樣品中微生物進(jìn)行分離純化，可直接對(duì)樣本基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進(jìn)行分析，能夠快速、直接和真實(shí)的反映菌群物種豐度及差異[9-10]。

本研究采用Illumina MiSeq技術(shù)對(duì)采自恩施地區(qū)的梅干菜樣品中細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，同時(shí)采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段對(duì)其中所含乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，以期為恩施地區(qū)梅干菜中微生物菌種資源的發(fā)掘與保護(hù)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

梅干菜MGC01、MGC02和MGC03：主要原料為雪里蕻。于2017年12月采自湖北省恩施地區(qū)土橋壩菜市場(chǎng)。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、碳酸鈣、過氧化氫、三氯甲烷、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸鈣、十二烷基硫酸鈉、酚、氯仿、異戊醇、溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）和醋酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；Axygen清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；10×PCR Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）mix、DNA聚合酶（5 U/μL）、溶菌酶（400 U/μg）、蛋白酶K（20 U/μg）、pMD18-T vector、Solution I：寶生物工程（大連）有限公司；6×Loading buffer、DL500和DL2000 DNA Marker：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×PCRmix：南京諾唯贊生物科技有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；引物均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，各引物信息如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列信息Table 1 Sequences information of primers used in the study

1.2 儀器與設(shè)備

HR40-IIB2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；VeritiTM 96孔梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain re action，PCR）擴(kuò)增儀：美國(guó)AB公司；DYY-12水平電泳儀：北京市六一儀器廠；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；DG250厭氧工作站：英國(guó)DWS公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；UV PCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)BIORAD公司。

1.3 方法

1.3.1 宏基因組DNA提取

參照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒中的方法提取梅干菜樣品宏基因組DNA，并用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度及濃度。

1.3.2 基于MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)梅干菜細(xì)菌多樣性的評(píng)價(jià)

細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增及測(cè)序：以微生物宏基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系[14]為5×FastPfu Buffer 4μL、2.5 mmol/LdNTPmix 2μL、5μmol/L的正/反引物（338F/806R）各0.8 μL、5 U/μL r Taq酶 0.4 μL、DNA模板 10 ng，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至20μL。PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共循環(huán)30次；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

質(zhì)量控制：對(duì)測(cè)回的序列進(jìn)行拼接，拼接時(shí)去除重疊區(qū)域堿基數(shù)＞10 bp、最大錯(cuò)配率＞0.2和樣品特異性條形碼（barcode）或引物堿基錯(cuò)配的序列，拼接后依據(jù)barcode信息將序列劃分至各樣品中以備后續(xù)分析[15]。

數(shù)據(jù)分析：使用QIIME數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，參照CAPORASO J G等[16]的方法對(duì)質(zhì)控后的序列進(jìn)行分析。首先以97%相似度劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[17]，然后利用Greengenes[18]和RDP[19]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，統(tǒng)計(jì)各分類水平上細(xì)菌多樣性。

1.3.3 梅干菜中乳酸菌菌株的分離鑒定

乳酸菌分離純化：采用稀釋涂布平板法將樣品稀釋液涂布于含1.0%～1.2%碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后挑選周圍有透明圈的單菌落進(jìn)行純化，將革蘭氏染色陽(yáng)性和過氧化氫酶陰性的純種菌株用30%的甘油進(jìn)行菌種保藏。

乳酸菌DNA提取與鑒定：采用CTAB法[20]提取純化菌株的DNA，然后以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除PCR擴(kuò)增所需引物為27F和1495R外，PCR擴(kuò)增體系和條件均與1.3.2相同。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、清潔后與PMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli）Top10，挑取陽(yáng)性克隆子送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序公司返回的序列進(jìn)行拼接并去除正反引物后置于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性較高的菌株，使用Mega 7.0中的鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用折線圖評(píng)判本研究測(cè)序深度是否合適，使用維恩（Venn）圖顯示不同樣品中共有或特有的OTU及序列數(shù)，使用柱狀圖展示不同樣品中各門和屬水平細(xì)菌種類和含量，使用系統(tǒng)發(fā)育樹展現(xiàn)不同菌株間進(jìn)化關(guān)系。折線圖和柱狀圖使用Origin2017軟件繪制。Venn圖由Venny2.1.0在線繪制，系統(tǒng)發(fā)育樹由Mega 7.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)梅干菜細(xì)菌多樣性的評(píng)價(jià)

高通量測(cè)序技術(shù)具有通量高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，可更加準(zhǔn)確、真實(shí)的反映樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成。因此，首先使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)干梅菜樣品中細(xì)菌在門、綱、目、科和屬各水平上的分類數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后利用超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)對(duì)其物種豐度和多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。

表2 梅干菜樣品測(cè)序結(jié)果及各分類地位數(shù)量Table 2 Sequencing results and numbers at different taxonomical levels of preserved vegetable samples

由表2可知，梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03經(jīng)質(zhì)控合格后的序列分別為25 534條、27 773條和36 858條，在97%的相似度下劃分的OTU數(shù)分別為3 545個(gè)、2 528個(gè)和4 689個(gè)。當(dāng)測(cè)序量為23 610條時(shí)，梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03的超1指數(shù)分別為1 860、1 613和2 362，香農(nóng)指數(shù)分別為7.02、5.79和7.73，其中梅干菜樣品MGC03的超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)值均最大，因而梅干菜樣品MGC03中細(xì)菌豐度和多樣性均高于梅干菜樣品MGC01和MGC02。進(jìn)一步對(duì)測(cè)序深度是否能捕獲細(xì)菌多樣性信息進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)序列數(shù)達(dá)到30 000條時(shí)，稀疏曲線隨序列數(shù)的增加而增加，而香農(nóng)指數(shù)曲線在序列數(shù)＞10 000條時(shí)就已經(jīng)進(jìn)入平臺(tái)期，說明隨著測(cè)序深度的增加可能還會(huì)有新的物種被發(fā)現(xiàn)但樣品中微生物多樣性不會(huì)再增加。由此可見，本研究的測(cè)序深度足以滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析要求。本研究進(jìn)一步對(duì)各梅干菜樣品特有及樣品間共有的OTU數(shù)及序列數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03中特有的OTU分別為2 442個(gè)、1 464個(gè)和3 565個(gè)，所包含序列數(shù)分別為3 982條、2 305條和9 698條。梅干菜樣品MGC01和MGC02共有OTU數(shù)為294個(gè)，梅干菜樣品MGC02和MGC03共有OTU數(shù)為315個(gè)，梅干菜樣品MGC01和MGC03共有OTU數(shù)為354個(gè)；3個(gè)梅干菜樣品共有OTU數(shù)為455個(gè)，其所包含的序列為61 568條，占總序列數(shù)的68.28%。由此可見，恩施地區(qū)梅干菜樣品中含有豐富的細(xì)菌物種且各樣品間存在大量共有細(xì)菌菌群。

圖1 稀疏曲線（A）和香農(nóng)指數(shù)曲線（B）Fig.1 Rarefaction curves(A)and Shannon index curves(B)

圖2 梅干菜樣品OTU數(shù)及序列數(shù)的維恩圖Fig.2 Venn diagram of the OTU and sequence number in preserved vegetable samples

梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03中所含細(xì)菌門的數(shù)量分別為13個(gè)、9個(gè)和10個(gè)，包含細(xì)菌屬的數(shù)量分別為186個(gè)、149個(gè)和148個(gè)，本研究將相對(duì)豐度＞1.0%的細(xì)菌門和屬定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門和屬，并對(duì)其平均相對(duì)含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 梅干菜樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門（A）和屬（B）的相對(duì)含量分析Fig.3 Relative content analysis of dominant bacterial phyla(A)and genus(B)in preserved vegetable samples

由圖3可知，恩施地區(qū)梅干菜樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其平均相對(duì)含量分別為60.70%、23.28%、11.16%、2.76%；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium），其平均相對(duì)含量分別為60.50%、8.69%、2.86%、1.73%、1.28%、1.07%、1.03%和1.00%。值得一提的是，仍有7.40%的序列不能鑒定到屬水平，這進(jìn)一步說明恩施地區(qū)梅干菜樣品中細(xì)菌多樣性較高。

2.2 梅干菜中乳酸菌菌株的分離鑒定

在使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)解析發(fā)現(xiàn)梅干菜中的細(xì)菌主要以乳酸菌為主的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段從3個(gè)梅干菜樣品中分離得到12株疑似乳酸菌，編號(hào)分別為MGC01-1、MGC01-2、MGC01-3、MGC01-4、MGC02-1、MGC02-2、MGC02-3、MGC02-4、MGC03-1、MGC03-2、MGC03-3和MGC03-4，疑似乳酸菌與其近源種模式株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。

由圖4可知，菌株MGC03-3、MGC01-3、MGC01-4、MGC02-1、MGC02-2、MGC02-3和MGC02-4與Lactobacillus plantarum NBRC 15891在同一個(gè)進(jìn)化分枝上，親緣關(guān)系較近，故將其判定為植物乳桿菌（L.plantarum），同理，將菌株MGC03-1鑒定為副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei），菌株MGC01-1鑒定為融合魏斯氏菌（Weissella confusa），菌株MGC03-2鑒定為食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius），菌株MGC01-2和MGC03-4鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

圖4 梅干菜中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria in preserved vegetable samples

3 結(jié)論

本研究通過Illumina MiSeq高通量測(cè)序和傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)恩施地區(qū)梅干菜中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，Illumina MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果表明，恩施地區(qū)梅干菜樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）。經(jīng)稀釋涂布平板法從梅干菜樣品中共分離到12株乳酸菌，包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）7株、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）2株、副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa）和食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）各1株。