鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2次級代謝產(chǎn)物UK-78623的分離鑒定及抑菌活性研究

田 鵬，邵美云，劉 鐵，李曉倩，鄧成敏，王 苗，張志敏，岳昌武*

（1.遵義市第一人民醫(yī)院 遵義市基因遺傳病精準診斷及藥物靶向治療重點實驗室，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學與生物學研究中心 貴州省普通高校微生物資源及藥物開發(fā)特色重點實驗室，貴州 遵義 563003；3.遵義醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室，貴州 遵義 563003）

放線菌（Actinobacteria）的次級代謝產(chǎn)物種類豐富，骨架結構新穎多樣，生物學活性顯著，是發(fā)現(xiàn)藥物先導化合物的重要來源[1-2]。放線菌FJS31-2是實驗室前期鑒定的一株產(chǎn)新型鹵化II型聚酮類抗生素zunyimycins A、B、C的菌株（結構見圖1）[3-4]。研究表明，zunyimycins具有較強的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和抗腫瘤生物活性[4]。通過antiSMASH軟件分析Streptomyces sp.FJS31-2的基因組信息發(fā)現(xiàn)，該菌除具有zunyimycins合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs）外，該菌染色體上還存在多個其他化合物的BGCs[5]。基于鏈霉菌（Streptomyces sp.）基因組信息進行化合物的重新挖掘，是發(fā)現(xiàn)新抗生素的重要途徑。泥質(zhì)鏈霉菌（Streptomyces argillaceus）ATCC 12956能夠產(chǎn)生一種具有抗腫瘤活性的先導化合物光神霉素（mithramycin），BECERRIL A等[6]對該菌基因組進行測序和重新挖掘發(fā)現(xiàn)兩個新的化合物抑菌霉素（antimycins）（cluster 27）和異海綿烯（isorenieratene）（cluster 26）；江冰婭等[7]對醌霉素產(chǎn)生菌Streptomyces sp.CPCC 200497產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物進行再次勘探時發(fā)現(xiàn)并鑒定了兩種吡咯里西啶類生物堿bohemamine和bohe mamine B?？何募训萚8]通過掃描鏈霉菌（Streptomyces sp.）TP-A0365的基因組序列，找到一個新的負責吡嗪酮類合成的非核糖體肽合成酶（nonribosomalpeptide synthesis，NRPS）編碼基因，通過敲除NRPS基因，對比突變菌株和原始菌株的發(fā)酵粗提液，發(fā)現(xiàn)一個新的吡嗪酮類化合物（provalin）。

圖1 zunyimycins A、B和C的化學結構Fig.1 Chemical structure of zunyimycins A,B and C

近年來世界各地出現(xiàn)多種“超級細菌”，它們對大多數(shù)抗生素都產(chǎn)生耐藥性，給臨床上病原菌感染等疾病的治療帶來巨大的挑戰(zhàn)[9]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類重要的抗感染、抗病毒、抗腫瘤、免疫刺激等活性的藥物[10-11]。但隨著臨床的濫用，導致細菌耐藥性的出現(xiàn)，開發(fā)或修飾獲得新的大環(huán)內(nèi)酯類藥物極為重要[12-13]。放線菌來源的抗生素類藥物在臨床治療耐藥病原菌感染和抗腫瘤等重大疾病方面發(fā)揮著重要作用[14]。HAXELL M A等[15]首次從吸水鏈霉菌（S.hygroscopicus）ATCC 53718中分離、鑒定得到的多環(huán)內(nèi)酯類化合物UK-78623，研究發(fā)現(xiàn)其同系物具有較好的抗秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的活性，而對其抗菌活性未見報道。因此，本研究繼續(xù)對zunyimycins產(chǎn)生菌Streptomyces sp.FJS31-2的次級代謝產(chǎn)物進行重新挖掘，在前期優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎上，對該菌的次級代謝產(chǎn)物UK-78623進行分離，采用質(zhì)譜（massspectrum，MS）法和1D和2D核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術對其結構進行了準確解析，并對其抗菌活性進行測定，為大環(huán)內(nèi)酯類藥物的開發(fā)提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

供試菌株：鏈霉菌（Streptomyces sp.）FJS31-2（菌保號：CGMCC 4.7321，Genebank號：no.PRJNA320463），分離自貴州省特殊生境梵凈山海拔800 m的土樣中；測試菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923、小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）ATCC 23715、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）ATCC 32001、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853、白色念珠菌（Candida albicans），均為本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體發(fā)酵培養(yǎng)基（改良的GYM鏈霉素培養(yǎng)基）：葡萄糖4 g，CaCO32 g，麥芽抽提物10 g，酵母抽提物4 g，微量元素預混液（ZnSO4·7H2O 2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2 g，MnCl2·4H2O 2 g，CuSO4·5H2O 2 g，Na2B4O7·10H2O 2 g，（NH4）6Mo7O24·4H2O 2 g，去離子水定容至1 L）0.5 mL，腐殖酸浸出液10 mL，玉米汁100 mL，瓊脂粉18 g，去離子水定容至1 L，115℃滅菌30 min。

GYM鏈霉素液體培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，去離子水定容至1 L，115℃滅菌30 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去離子水定容至1 L，121℃滅菌30 min。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20 g。

1.1.3 主要試劑

GF254薄層層析（thin layer chromatography，TLC）硅膠板、柱層析用硅膠：青島譜科分離材料有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20：北京滿倉科技有限公司；甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈等（均為色譜純）：北京邁瑞達公司；環(huán)丙沙星藥敏紙片（5μg）：英國OXOID公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1220 Infinity LC VL高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、1200HPLC/6520 QTOFMS液質(zhì)（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；AV III，Ascend 500 HD 500 MHz核磁共振儀：德國Bruker公司；DZ-900英培搖床：太倉市實驗設備廠；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步其公司；BSP-400培養(yǎng)箱：上海博訊設備儀器廠；E002092超級潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；Direct-Q5UV超純水機：美國密理博公司；SCIENTZ-15T超聲波提取機：寧波新芝公司；MLS-3781L-PC自動蒸汽滅菌器：日本松下公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與發(fā)酵

將斜面保藏的Streptomyces sp.FJS31-2劃線接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基平板中，28℃靜置培養(yǎng)4 d。將活化好的Streptomyces sp.FJS31-2接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為200 mL/500 mL，28℃靜置培養(yǎng)7 d后，搗碎培養(yǎng)基混勻，繼續(xù)培養(yǎng)10 d。

1.3.2 代謝產(chǎn)物分離純化

搗碎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入等體積的乙酸乙酯，置于超聲波提取機中，在攪拌轉(zhuǎn)速250 r/min、超聲功率400 W條件下，超聲破碎萃取24 h，間隙時間為1.0 s，共萃取2次，收集萃取液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，40℃減壓濃縮，回收萃取液，得到發(fā)酵粗提浸膏32 g。

用少量的丙酮及甲醇溶解發(fā)酵粗提浸膏（32 g）后，與硅膠粉（100～200目）攪拌混勻，溶劑揮發(fā)完全后進行正相硅膠柱層析（200～300目，1.3 kg），依次按氯仿-丙酮中氯仿體積分數(shù)100%、95%、90%、80%、67%、50%、33%、0進行梯度洗脫，每個梯度洗脫3 L，每瓶收集150 mL，流速為1滴/s。將洗脫液分別在40℃條件下真空濃縮，依次標上記號，濃縮后進行TLC分析，根據(jù)比移（retention factor，Rf）值合并顯色情況相似的組分，共合并得10個組分，依次標記為Fr.1～Fr.10。Fr.1～Fr.8，F(xiàn)r.10已分離出新化合物zunyimycinA、B、C等[4]，因此選擇Fr.9進一步純化。

將組分Fr.9（4.224 g）用盡量少的甲醇溶解后，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（200 g）柱層析，甲醇洗脫，流速為8滴/s，5 mL/管收集，經(jīng)TLC檢測，根據(jù)Rf值合并顯色情況相似的組分，共合并得2個組分，標記為組分Ⅰ和組分Ⅱ，經(jīng)HPLC分析顯示，組分Ⅰ和Ⅱ在保留時間分別為5.972 min和20.1 min，組分Ⅰ為已發(fā)表化合物BE-24566B[4]，選擇組分Ⅱ進行進一步純化。

組分Ⅱ（171 mg）經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（150 g）柱層析，甲醇∶氯仿=1∶1（V/V）洗脫，流速為8滴/s，5 mL/管收集，經(jīng)TLC分析，合并Rf值=0.5的化合物，最終得到化合物1（79 mg）。

1.3.3 代謝產(chǎn)物結構解析

核磁共振（NMR）分析：化合物1用丙酮溶解后，轉(zhuǎn)移至干凈的核磁管中抽干溶劑，加入0.5 mL氘代氯仿后測試1D NMR，包括13C NMR、1H NMR、無畸變極化轉(zhuǎn)移增強（distortionlessenhancementby polarization transfer，DEPT）譜。

電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）測定：樣品加熱氣化，進入離子化室，隨后電離，掃描范圍為100～1 000 m/z，得到化合物的分子離子峰及其他離子碎片。

1.3.4 抑菌活性的測定

采用濾紙片法測定化合物1的抑菌能力。

將金黃色葡萄球菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)6～8 h，白色念球菌接種于GYM液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)6～8 h。取10 mL新鮮菌液與40 mL即將凝固（約45～55℃）的LB固體培養(yǎng)基分別混勻后迅速倒板。

將濾紙片打孔（孔直徑為6 mm）于121℃條件下高壓滅菌30 min；將化合物1溶于甲醇中，使化合物1的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，將濾紙片浸泡其中，取出濾紙片，溶劑揮發(fā)干后，采用無菌鑷子將濾紙片分別貼于含有菌液的LB固體培養(yǎng)基表面，輕輕按壓，使其貼平，做好標記。平板置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，以甲醇為陰性對照，環(huán)丙沙星為陽性對照。根據(jù)抑菌圈的有無及大小，判定抗菌活性的強弱，當抑菌圈≥6 mm時，具有抑菌作用。

2 結果與分析

2.1 化合物的TLC分析

以氯仿∶丙酮=3∶1（V/V）為展開劑，經(jīng)TLC分析得到化合物1共79 mg，化合物1的薄層層析色譜圖如圖2所示。

圖2 發(fā)酵液的粗提物和化合物1的薄層層析色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of crude extract of fermentation broth andcompound 1

由圖2可知，化合物1的Rf值約為0.5，在8%硫酸乙醇溶液中顯色后呈深棕色，TLC的結果表明，化合物1為單一的化合物。

2.2 化合物1的結構解析

化合物1為白色固體粉末，易溶于氯仿、丙酮，ESI-MS得出m/z：707.3[M+Na]+和1391[2M+Na]+，相對分子質(zhì)量為684。分子式：C39H54O9，不飽和度為12。1H-NMR（500 MHz，CHCl3-d1）：根據(jù)氫質(zhì)子化學位移δ 0.70（3H，d，J=6.6 Hz，H-15a），0.89-0.97（2H，m，H-18），1.02（3H，d，J=6.7 Hz，H-12a），1.21（3H，br d，J=1.8 Hz，H-46），1.22（3H，d，J=2.0 Hz，H-47），1.55（3H，s，H-14a），1.61（3H，s，H-29），1.68（3H，d，J=6.6 Hz，H-28），可以推斷該分子具有8個甲基；根據(jù)1.82-1.85（4H，m，H-18），1.83-1.91（1H，m，H-24），1.84-1.87（1H，m，H-4a），1.93（3H，br d，J=8.9 Hz，H-20），2.24-2.29（2H，m，H-16），2.40-2.48（1H，m，H-12），2.62（1H，dt，J=14.0，6.96 Hz，H-31），可以看到該分子具有4個亞甲基，其中兩個為化學不等價；根據(jù)3.22（1H，br t，J=10.3 Hz，H-22），3.32-3.35（1H，m，H-2），3.52（3H，s，5a），3.59（1H，s，H-25），3.60-3.65（1H，m，H-17），3.94-4.00（2H，m，H-5），4.04（1H，d，J=5.6 Hz，H-6），這7組氫信號可以判斷該分子具有6個雜原子，從化學位移可以初步推斷為氧原子。根據(jù)4.62-4.73（2H，m，H-8a），4.94（1H，br d，J=10.5 Hz，H-23），4.96-5.01（1H，m，H-15），5.29-5.32（1H，m，H-19），5.32-5.36（1H，m，H-11），5.41（1H，br d，J=1.5 Hz，H-3），5.45-5.49（1H，m，H-27），5.73-5.77（1H，m，H-10），5.76-5.79（1H，m，H-9），可以初步推斷該分子不存在芳香結構，而是具有4個碳碳雙鍵。結合碳譜13C-NMR（125 MHz，CHCl3-d1）：δ 177.8（C-30），173.9（C-1），可以判斷化合物具有2個羰基。142.5（C-11），139.8（C-8），137.5（C-14），136.0（C-30），133.1 （C-6），124.8 （C-27），123.5（C-9），120.4（C-15），119.5（C-10），118.4（C-3），100.2（C-21），與氫譜一并證明確實存在4個碳碳雙鍵。80.4（C-25），80.2（C-7），76.0（C-22），5.3（C-23），68.5（C-19），68.2（d，J=12.8 Hz，C-17），57.8（C-5a），48.5（C-13），45.6（C-2），證明該分子除2個羰基氧外，還具有6個氧原子，其中一個為羥基；根據(jù)37.7（C-18），36.5-35.7 （m，C-20，12），34.6 （C-31），34.3（C-16），22.3（C-12a），19.9 （C-4a），19.2 （C-32），19.0 （C-33），15.6（C-14a），13.2（C-15a），13.0（C-28），10.7（C-29），可以判斷該化合物具有一個酯鍵。綜合氫譜、碳譜化學位移及耦合常數(shù)可以判斷該化合物是具有5元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。根據(jù)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫SciFinder檢索，化合物1結構特征與文獻報道的多環(huán)內(nèi)酯類化合物UK-78623一致[13]，推定化合物1為UK-78623，化學結構見圖3。

圖3 化合物1的化學結構Fig.3 Chemical structure of compound 1

2.2 抗菌活性分析

采用濾紙片法對化合物1的抗菌活性進行測試，結果見表1。

表1 化合物1的抑菌活性結果Table 1 Results of antibacterial activity of compound 1

由表1可知，化合物1對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌無明顯抑制作用，而對小腸結腸炎耶爾森氏菌具有抑制作用，抑菌圈直徑為25.2 mm。陽性對照環(huán)丙沙星對小腸結腸炎耶爾森氏菌的抑菌圈直徑為24.9 mm，化合物1和陽性對照環(huán)丙沙星的抑菌效果相當。

小腸結腸炎耶爾森氏菌（Y.enterocolitica）是少數(shù)幾種能在冷藏溫度下生長的的腸道致病菌之一，即“冰箱病”[16-17]。其感染后可引起胃腸道癥狀、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等疾病，甚至引起急性闌尾炎、敗血癥及死亡[18-19]，因此該菌被列為重要的食源性病原菌。近年來Y.enterocolitica在臨床各類標本中存在耐多種抗菌藥物，并且耐藥性日益嚴重，需要引起關注[20]。因此，化合物UK-78623具有創(chuàng)制為臨床抗小腸結腸炎耶爾森氏菌藥物的潛力。

3 結論

本研究從II型鹵化聚酮類抗生素zunyimycins產(chǎn)生菌鏈霉菌（Streptomyces sp.）FJS31-2的發(fā)酵物中分離純化得到1個多環(huán)內(nèi)酯類化合物UK-78623，首次報道了化合物UK-78623具有顯著的抗小腸結腸炎耶爾森氏菌的活性（25.2±0.11 mm），且與陽性藥物環(huán)丙沙星抑菌效果（24.9±0.08 mm）相當，表明該化合物具有成藥潛力，可為臨床該菌的治療提供先導化合物。