臺灣乳白蟻纖維素降解菌的分離和鑒定

陳志超，易 弋，趙東玲，黃翠姬，伍時華*（1.廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006；

2.廣西科技大學 廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；

3.廣西科技大學 廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

全球化石能源儲備的急劇消耗，以及過度使用化石能源帶來的環(huán)境污染，這使得人們對新型清潔能源的開發(fā)以及相關的研究日趨亟切。利用玉米、木薯等淀粉類糧食作物生產生物乙醇，是發(fā)展生物能源的一種途徑，但這會帶來較為嚴重的糧食壓力。木質纖維素是地球上存量巨大的生物質資源之一，理論上可將其水解成可發(fā)酵的糖，從而進一步轉化為乙醇[1]。木質纖維素在自然界中的含量極其豐富，利用木質纖維素發(fā)酵的乙醇可緩解能源危機，同時減緩糧食壓力，確保經濟的可持續(xù)發(fā)展，但由于技術瓶頸，木質纖維素也是當前利用率相對較低的生物質資源[2]。因此，提高木質纖維素的利用，是我國新資源發(fā)展戰(zhàn)略之一[3]。

物理化學的方法水解木質纖維素的工藝條件苛刻，環(huán)境污染大，不適合大批量工業(yè)生產[4]。生物法是指直接利用微生物或微生物所產的酶來水解木質纖維素。由于作用的媒介是微生物或酶，因此與物理化學法相比，生物法具有工藝條件溫和、操作簡單、耗能低、有害副產物少等優(yōu)點，但生物法轉化的技術依賴于高效纖維素酶的發(fā)掘。

纖維素酶在自然界中分布廣泛，存在于許多微生物、植物及昆蟲中。白蟻作為一種以纖維素原料為食物的昆蟲，其腸道內的微生物菌群具有發(fā)達的纖維素酶系[5-8]。有研究者已從白蟻體內分離得到大量具有纖維素酶活性的可培養(yǎng)共生菌，并成功對白蟻的內源性纖維素酶進行異源表達[9-11]。黃小暉等[12]從白蟻腸道中分離出一株鏈霉菌（Streptomyces），其纖維素酶酶活為583 U/mL；李丹紅等[13]從象白蟻（Nasutitermes sp.）腸道中分離得到菌群，其纖維素酶酶活為0.5 U/mL；POURRANMEZAN Z等[14]從鋸白蟻腸道分離出芽孢桿菌（Bacillus）B5B和不動桿菌（Acinetobacter）L9B，纖維素酶酶活分別為1.47 U/mL、1.22 U/mL。

因此，本研究從廣西柳州本地的臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）體內分離篩選一株纖維素降解菌，對其進行鑒定，并繪制該菌株的生長曲線及測定纖維素酶活力。為生物降解纖維素方面的研究提供相關的理論依據和新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）75只：廣西科技大學校園樺樹。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母膏（生化試劑）：英國Oxoid公司；瓊脂（生化試劑）：美國英杰Invitrogen公司；預混脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（0.1 U/μL）、膠回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；DL5000 DNA Marker：寶生物工程（大連）有限公司；細菌微量生理生化鑒定管：杭州濱和微生物試劑有限公司；血平板：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

初篩液體培養(yǎng)基：蛋白胨3.0 g/L，酵母提取物0.5 g/L，（NH4）2SO42.0 g/L，KH2PO44.0 g/L，CaCl20.3 g/L，MgSO40.3 g/L，纖維素鈉（c arboxy methyl cellulose-Na，CMC-Na）10.0 g/L，pH 7.0。

初篩固體培養(yǎng)基：在初篩液體培養(yǎng)基中加入瓊脂18.0g/L。

復篩液體養(yǎng)基：CMC-Na20g/L，KH2PO42.0g/L，（NH4）2SO41.4 g/L，MgSO40.3 g/L，CaCl20.3 g/L，FeSO40.005 g/L，MnSO40.016 g/L，ZnCl20.017 g/L，pH 7.0。

復篩固體培養(yǎng)基：在復篩液體培養(yǎng)基中加入瓊脂18.0g/L。

濾紙降解培養(yǎng)基：（NH4）2SO42.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，定量濾紙6 cm×1 cm。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.4。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨3.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，MgSO45.0 g/L，CMC-Na 10 g/L，KCl 5.0 g/L，NaNO33.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g/L，蛋白胨8.0 g/L，酵母提取物4.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，pH自然。

以上培養(yǎng)基均于121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Tpersonal聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；DYY-6D型電泳儀：濟南東儀實驗室設備有限公司；ZXRD-B5210鼓風干燥箱：上海雙旭電子有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；ZHJH-C1112C超凈工作臺、HWY-2112全溫度恒溫調速搖床柜：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 纖維素降解菌的篩選和分離純化

初篩：分別使用無菌水和無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（Na2HPO48 mmol/L、NaCl 136 mmol/L、KH2PO42 mmol/L、KCl 2.6 mmol/L，pH=7.4）清洗臺灣乳白蟻，再將臺灣乳白蟻置于無菌研缽中研磨至糜爛狀，然后加入0.85%生理鹽水，收集研磨液。將收集的研磨液加入初篩液體培養(yǎng)基中，于37℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)液涂布于初篩固體培養(yǎng)基，于37℃條件下倒置培養(yǎng)48 h。

復篩：將所得分離菌的單菌落接種于復篩液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后涂布于復篩固體培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)并保藏菌種，培養(yǎng)條件同上。

1.3.2 菌株鑒定

形態(tài)觀察：將分離菌株劃線于復篩固體培養(yǎng)基平板劃線，于37℃條件下倒置培養(yǎng)48 h觀察單菌落形態(tài)。將分離菌株編號，接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min條件下培養(yǎng)72 h，取樣，進行革蘭氏染色觀察。

生理生化鑒定：參考文獻[15]對分離菌株進行生理生化測試，根據細菌生化管說明書判斷實驗結果。

分子生物學鑒定：采用16S rDNA通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACTT-3′）進行菌落PCR擴增。PCR擴增體系：雙蒸水（ddH2O）22μL，2×Mix酶25μL，上、下游引物各1μL，菌液1μL。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。4 ℃條件下保存。PCR擴增產物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用凝膠回收試劑盒進行純化回收。將純化后的PCR擴增產物TA克隆后送至上海英濰捷基貿易有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST序列比對，并利用Mega 7.0軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 濾紙降解試驗

取分離菌株接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min條件下培養(yǎng)12 h，作為種子液。按1%（V/V）的接種量將種子液加入含濾紙的100 mL濾紙液體培養(yǎng)基中，37℃、100 r/min條件下培養(yǎng)6～8 d，觀察并記錄試驗現象，考察菌株是否具有降解木質纖維素的能力。

1.3.4 分離菌株生長曲線的繪制

將上述種子液按1%（V/V）的接種量接入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)60 h，于不同時期取樣測定細胞生長濃度（OD600nm值）并繪制成生長曲線。

1.3.5 纖維素酶活測定

參考文獻[16]的測定方法并加以改進：將反應時間調整為20 min，利用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定纖維素酶活力。以波長540 nm處吸光度值（y）為縱坐標，葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標繪制葡萄糖標準曲線，繪得線性方程為y=11.523x-0.030 2，R2=0.990 2。由標準曲線回歸方程計算得到葡萄糖質量濃度，再計算得到纖維素酶活力，其計算公式如下：

式中：M為還原糖質量，mg；D為粗酶液稀釋倍數；T為酶促反應時間，min；V為粗酶液體積，mL；1 000為mg轉化為μg的轉化系數。

纖維素酶活單位定義：在50℃、pH 5.0條件下，1 mL酶液在1 min內催化1%的CMC-Na生成1μg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位（1 U/mL）。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌篩選結果

通過初篩固體培養(yǎng)基平板分離篩選獲得3個單菌落，白色單菌落，黃色單菌落，直徑相對較小的白色單菌落，分別命名為菌株BW、BY和SW。將其接種于以CMC-Na為唯一碳源的復篩液體培養(yǎng)基進行復篩，之后涂布于復篩固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)獲得純化的菌落。以1%的CMC-Na為底物測得其纖維素酶活分別為93.73 U/mL、70.02 U/mL和25.93 U/mL。其中菌株BW纖維素酶酶活較高，即以菌株BW為目標菌株。

2.2 菌株BW鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株BW的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)結果見圖1。

圖1 菌株BW的菌落（a）及細胞（b）形態(tài)特征Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology characteristics of strain BW

由圖1a可以看出，菌株BW的菌落呈白色凸起，表面光滑、濕潤。由圖1b可以看出，菌株BW革蘭氏染色呈陰性、菌體呈桿狀、成對排列，通過菌體形態(tài)初步判斷菌株BW為桿菌。

2.2.2 生理生化特性鑒定

菌株BW的生理生化試驗結果見表1。

表1 菌株BW的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain BW

由表1可知，菌株BW在37℃條件下可生長，而在41℃、44℃條件下無法生長，溶血性、葡萄糖產酸、VP試驗、吲哚試驗、明膠水解、革蘭氏染色皆為陰性，可利用苯酸鹽、檸檬酸鹽、乙醇、DL-乳酸鹽，不能利用D-蘋果酸鹽、三糖鐵。該試驗結果與參考文獻[17]約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）[18]的菌種表型特性一致。經生理生化實驗結果，可初步確定菌株BW為約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）。

2.2.3 分子生物學鑒定

采用菌落PCR技術擴增菌株BW的16S rDNA序列，PCR擴增結果如圖2所示。

圖2 菌株BW的16S rDNA PCR擴增產物電游泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of 16S rDNA of strain BW

由圖2可知，擴增的目的基因片段大小約為1 500 bp，與理論一致。根據BLAST序列同源性分析比對結果，選取同源性較高的菌株，采用MEGA7.0中的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖3所示。

由圖3可知，菌株BW菌與約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）聚于一支，親緣性較近，同源性≥99%。結合形態(tài)觀察、生理生化試驗結果，鑒定菌株BW為一株約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）。

圖3 基于16S rDNA序列菌株BW的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain BW based on 16S rDNA sequences

近幾年有研究者分離出一些具有特殊降解能力的不動桿菌，如可分解馬拉硫磷（硫代磷酸酯）[19]、柴油[20]、乙酰丙酮[21-22]以及在低溫堿性條件下降解脂肪特性的菌株[23-24]。而已有的針對纖維素分解菌的報道中，有關不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）的纖維素分解菌的研究相對較少。SHILRK等[24]從負泥蟲中分離出一株醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus），并未準確測得纖維素酶酶活大小；李靜等[25]從杜鵑林的土壤中分離鑒定獲得一株纖維素酶酶活力為71.75μmol/mL的不動桿菌屬細菌，其只鑒定到屬；EKPERIGINMM[26]從非洲大蝸牛中分離出一株無硝不動桿菌（Acinetobacter anitratus），纖維素酶活最高為0.48μmol/（mL·min）。

2.3 濾紙降解結果

菌株BW接種于濾紙液體培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 d后，濾紙邊緣出現膨脹并有彎曲，溶液稍渾濁，有較多小絮狀沉淀現象。從試驗現象和結果可以判定，菌株BW可降解木質纖維素，具有一定的降解木質纖維素的潛力。

2.4 菌株BW的生長曲線及纖維素酶活測定結果

菌株BW的生長曲線及其在不同時期的纖維素酶酶活測定結果見圖4。

圖4 菌株BW的生長曲線及纖維素酶酶活Fig.4 Growth curve and cellulase activity of strain BW

由圖4可知，菌株BW在0～10 h為遲緩期、10～20 h為對數期、20～50 h為穩(wěn)定期、50～60 h為衰退期。發(fā)酵時長20 h時，纖維素酶活達最高，為（93.73±0.22）U/mL。在纖維素降解方面有較大的潛力，對其最適產酶條件以及最高酶活有待進一步探究。

3 結論

本研究從廣西柳州本地的臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）體內分離純化獲得一株具有降解纖維素能力的菌株，編號為BW，經形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學鑒定為一株約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii），37℃、150 r/min培養(yǎng)25 h后菌體生物量達到最大，而20 h左右纖維素酶酶活達到最大，為（93.73±0.22）U/mL。為不動桿菌屬細菌在生物降解纖維素的研究方面提供了新的菌種資源。