尿外泌體microRNA 與腎臟疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展

晏玥 王乙安 陳芳 譚千林 者星煒

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科（昆明650500）

腎臟是非再生器官，腎臟疾病的確診目前仍高度依賴腎穿刺活檢。腎穿刺活檢所引起的出血風(fēng)險，其嚴(yán)重程度各不相同，從短暫性血尿或淋巴結(jié)血腫到危及生命的出血?；谝陨显?，大多數(shù)情況下并未采取這一檢查手段。尿液白蛋白、血尿素氮、血清肌酐水平等都是臨床應(yīng)用廣泛的診斷指標(biāo)，但仍需要更深入的檢測結(jié)果才能掌握腎病的類型。鑒定腎臟病理類型的體液生物標(biāo)志物對于非侵入性診斷方法的開發(fā)是必不可少的，也是未來疾病檢測的發(fā)展方向。成熟的微小RNA（microRNA，miRNA）通過結(jié)合mRNA 作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，主要功能是降解靶mRNA，參與增殖、死亡、代謝和分化等生理和病理過程［1］。文獻(xiàn)報道發(fā)現(xiàn)，miR-192、miR-194、miR-204、miR-215和miR-216 在人腎臟中大量表達(dá)［2］。在隨后的研究中，TIAN 等［3］研究發(fā)現(xiàn)miR-192 和miR-194 的表達(dá)水平在大鼠腎臟皮質(zhì)中高于髓質(zhì)，而miR-27b 在髓質(zhì)中高表達(dá)。在人類和實(shí)驗(yàn)性嚙齒動物模型中，使用微陣列和miRNA 測序的高通量篩選技術(shù)，可以觀察到，在急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）和慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）的進(jìn)展期間腎臟中miRNA 的表達(dá)發(fā)生改變［4］。miRNA 作為一類調(diào)節(jié)因子在AKI 發(fā)病機(jī)制中的重要性首先在具有產(chǎn)生miRNA 所需的酶（Dicer）的腎近端小管特異性基因組缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中得到證實(shí)［5］。因此，對于腎臟疾病的早期診斷和觀察而言，評估m(xù)iRNA 作為“疾病特異性核酸生物標(biāo)志物”是至關(guān)重要的。

1 MicroRNA 的概述

1993年，AMBROS 等［6］在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了第一個microRNA 命名為lin-4 的基因。它是一種不編碼蛋白的小RNA。SHI 等［7］發(fā)現(xiàn)，lin-4 基因可以抑制核蛋白lin-14 基因的表達(dá)進(jìn)而來調(diào)節(jié)線蟲的發(fā)育。隨著人們對miRNA 的深入研究，在不同物種中有越來越多的miRNA 的發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)現(xiàn)不僅豐富了miRNA，也為miRNA 在各個領(lǐng)域的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）從基因組的非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄，被認(rèn)為是“基因沙漠”，它們可以調(diào)節(jié)編碼區(qū)上基因的表達(dá)。miRNA 是一種ncRNA，其成熟形式是18～25 個堿基長度的單鏈RNA 分子。miRNA 分子被RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的初級miRNA（primary mircoRNA，pri-miRNA），pri-miRNA 被Drosha 酶切割成70～100 個堿基的前體miRNA（miRNA precursor，pre-miRNA）。premiRNA 通過核輸出蛋白5 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，被另一種RNase III 酶——Dicer 酶切割成雙鏈miRNA。再將雙鏈miRNA 摻入到含有Argonaute 蛋白的RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中，其中雙鏈的一條鏈被降解。而另一條鏈則可自由結(jié)合靶mRNA 的3′非翻譯區(qū)。最終，miRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)其靶mRNA 的表達(dá)［8］。miRNA 調(diào)控著大量的基因，并在細(xì)胞增殖、凋亡和分化等幾個關(guān)鍵的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［9］。

2 尿miRNA 與腎臟疾病

大多數(shù)miRNA 在細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，以非常穩(wěn)定的形式存在于血漿和血清中［10］。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA 也存在于其他體液中。WEBER 等［11］從健康人腦脊液、淚液、胸膜液、氣管沖洗液、乳汁、初乳、腹水、尿液、精液、羊水和血漿中提取到了miRNA，并發(fā)現(xiàn)唾液中miRNA 的種類數(shù)量最多，有458 種miRNA；尿液中數(shù)量最低，有204 種miRNA。以上研究還鑒定了體液中特異性出現(xiàn)的miRNA，如淚液中的miR-637和腦脊液中的miR-577。但該項(xiàng)研究并未鑒定出尿液特異性存在的miRNA。這種特異性的miRNA是否存在且與腎臟疾病是否相關(guān)需要進(jìn)一步深入研究。

外泌體（exosome）是大小約40～100 nm 的膜囊泡，屬于細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），作為膜和細(xì)胞溶質(zhì)蛋白、脂質(zhì)和RNA 細(xì)胞之間傳遞的載體，廣泛存在于尿液和血漿在內(nèi)的多種體液中，介導(dǎo)體內(nèi)不同細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間通訊，從而影響細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)［12］。除了具有細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵作用之外，外泌體越來越多地被認(rèn)為是疾病的生物標(biāo)志物和預(yù)后因子。尿液是腎臟疾病生物標(biāo)志物的理想來源。尿液中含有多種細(xì)胞外囊泡，其中外泌體起著重要作用。尿外泌體（urinary exosome）是由泌尿系統(tǒng)中各種細(xì)胞分泌并釋放到尿液中的細(xì)胞外囊泡，其攜帶與細(xì)胞來源相關(guān)的蛋白質(zhì)、脂類、DNA、mRNA 和miRNA 等，參與細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過程［13］。由于外泌體可以反映原始細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)，且磷脂雙分子層使細(xì)胞組分更穩(wěn)定，因此尿miRNA 被認(rèn)為是穩(wěn)定存在的［14］。近年來，分析各種腎臟疾病尿液中miRNA 的研究越來越多。目前對于miRNA 是否能成為腎臟疾病的良好生物標(biāo)志物的研究尚不確切，但迄今為止在這項(xiàng)研究中獲得的結(jié)果是有意義的。

3 尿miRNA 與急性腎損傷

急性腎損傷（AKI）是由缺血性和毒性損傷等致病性疾病引起的常見臨床狀態(tài)。AKI 以血清肌酐水平作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，但血清肌酐水平是非特異性的，對AKI 的早期識別不敏感。因此，尋找新的早期、敏感且可靠的生物標(biāo)志物是未來探索的方向。

RAMACHANDRAN 等［15］對6 例非藥物誘導(dǎo)的AKI 患者尿miRNA 的分析中發(fā)現(xiàn)，AKI 患者的尿miR-21、miR-200c、miR-423 的水平均顯著高于對照組，而miR-4640 水平顯著低于對照組。該研究首次報道了AKI 患者尿miR-4640 水平降低；另一項(xiàng)研究［16］也得出類似的結(jié)果，經(jīng)藥物誘導(dǎo)的AKI 患者尿miR-21、miR-200c 和miR-423 水平出現(xiàn)明顯升高趨勢。上述miRNA 被認(rèn)為是腎損傷的敏感指標(biāo)，可以作為腎損傷診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)。

miR-21 作為研究最多的miRNA，血清和尿液中的miR-21 水平被認(rèn)為是可以預(yù)測接受心臟手術(shù)患者發(fā)生嚴(yán)重AKI 進(jìn)展程度的指標(biāo)［17］。在對早期心臟手術(shù)后心臟外科相關(guān)腎損傷（cardiac surgery associated acute kidney injury，CSA-AKI）與miR-21 相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，AKI 組心臟手術(shù)后6 小時血清和尿miR-21 表達(dá)水平顯著低于非AKI 組；雖然術(shù)后血清和尿miR-21 水平均可預(yù)測AKI 發(fā)展，但與血清miR-21 相比，尿miR-21 能更好的預(yù)測AKI 的發(fā)展［18］。

在對缺血再灌注誘導(dǎo)的嚙齒動物模型和人AKI 術(shù)后72 h 內(nèi)尿miRNA 的動態(tài)分析中發(fā)現(xiàn)，大鼠模型術(shù)后尿液中miR-30c-5p、miR-192-5p 和miR-378a-3p 的表達(dá)顯著升高，與微陣列分析和早期腎損傷分子-1（kidney injury molecule 1，KIM-1）結(jié)果一致；在AKI 患者中，術(shù)后2 h 也檢測到miR-30c-5p和miR-192-5p水平升高，與基于蛋白質(zhì)的生物標(biāo)志物相比，miR-30c-5p顯示出更好的診斷價值［19］。LIN等［20］發(fā)現(xiàn)在小鼠和AKI患者尿液中miR-494水平升高，還發(fā)現(xiàn)在正常人尿液中尚未發(fā)現(xiàn)的miR-16-5p，并認(rèn)為miR-16-5p是AKI的一種特異性無創(chuàng)生物標(biāo)志物。除此之外，在慶大霉素誘導(dǎo)的AKI 的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射慶大霉素第4天開始尿液樣本中有4 種miRNA（mmu-miR-138-5p，mmu-miR-1971，mmu-miR-218-1-3p和rno-miR-489）水平不斷升高，而慶大霉素、血清肌酐和尿素氮等標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物均未有變化［21］，這4 種miRNA 可能作為AKI 早期診斷的生物標(biāo)志物。上述結(jié)果表明部分miRNA具有診斷和預(yù)測AKI進(jìn)展的潛力。

4 尿miRNA 與慢性腎臟病

慢性腎臟?。–KD）是一種非常普遍的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年增加。全世界大約有5 億人患有CKD，其主要特征是帶來包括心血管疾病、腎功能衰竭和過早死亡的不良后果；其主要組織學(xué)改變?yōu)槟I小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化；其嚴(yán)重程度通過腎小球?yàn)V過率和白蛋白尿來評估和診斷［22］。

4.1 腎間質(zhì)纖維化與尿miRNA miRNA 可以在體內(nèi)和體外高血糖條件下誘導(dǎo)腎細(xì)胞發(fā)生纖維化，促進(jìn)腎小球功能障礙相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累［23］。

LV 等［24］對35 例腎纖維化患者尿外泌體miRNAs 的分析顯示，尿miR-29c 水平隨著纖維化程度的進(jìn)展而降低。CHUN 等［25］觀察到尿miR-29c 水平降低與腎纖維化有關(guān)外，還觀察到miR-21 和波形蛋白mRNA 的含量也與腎纖維化的程度有關(guān)。不僅如此，miR-29c 的表達(dá)降低與肝、肺和心臟纖維化的發(fā)生也相關(guān)［26-28］，miR-29c 被認(rèn)為是纖維化疾病的重要治療靶點(diǎn)。YU 等［29］發(fā)現(xiàn)白血病抑制因子通過酪氨酸位點(diǎn)激活STAT3 磷酸化，上調(diào)miR-29c 而發(fā)揮抗腎纖維化的作用。此外，在狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）患者中也觀察到尿miR-29c 水平下調(diào)［30］。HSU［31］和YU［32］兩個研究小組通過分析不同程度腎纖維化的CKD 患者尿外泌體miRNAs 發(fā)現(xiàn)，miR-200 家族中的miR-200b 和miR-200c 在腎纖維化過程中水平均顯著降低，其中miR-200b降低更明顯。MURALIDHARAN 等［33］以28 例CKD 患者為研究對象，對腎小球?yàn)V過率降低的患者循環(huán)和尿液中的miRNA 進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)估計腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）＜30 mL∕（min·1.73 m2）時患者尿中l(wèi)et-7a 明顯下調(diào)，miR-130a 顯著上調(diào)；eGFR 降低者尿和血漿中miR-1825 和miR-1281 顯著上調(diào)，血漿miR-423 明顯下調(diào)。結(jié)合既往研究結(jié)果，可以明確miRNA 與腎纖維化有關(guān)，特異性的尿液和血漿miRNA 譜可能在CKD 中具有診斷和判斷預(yù)后的價值。

4.2 糖尿病腎病與尿miRNA 糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）繼發(fā)于糖尿病，是導(dǎo)致腎功能衰竭最常見的疾病。DN 是由葡萄糖穩(wěn)態(tài)受抑制引起的腎小球毛細(xì)血管和管狀結(jié)構(gòu)和功能改變引起的進(jìn)行性腎?。?4］。但最近的研究表明，糖尿病患者可能在非白蛋白尿狀態(tài)下或在微量白蛋白尿開始前已有發(fā)展為DN 的趨勢［35］。

通過采用實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析糖尿病大鼠尿外泌體miRNA 的檢測中觀察到miRNA-451-5p 和miR-16表達(dá)增加，在3～6 周即可觀察到miR-451-5p 顯著增加［36］。PRABU 等［37］首次在對452 位亞洲印度人群Ⅱ型糖尿病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，尿let-7i-3p，miR-24-3p 和miR-27b-3p 水平增加，miR-15b-5p 水平降低；且尿miRNA 與尿微量白蛋白尿的程度相關(guān)。最近的一項(xiàng)研究顯示，與Ⅱ型糖尿病非白蛋白尿患者相比，亞洲Ⅱ型糖尿病微量白蛋白尿患者的尿外泌體miR-192，miR-194 和miR-215 的水平增加，并且這種增加與血液轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）水平相關(guān)［38］，以上miRNAs 不僅對DN 早期診斷有意義，也可能參與纖維化的進(jìn)展。一項(xiàng)針對Ⅰ型糖尿病的研究中報道指出，Ⅰ型糖尿病患者中微量白蛋白尿組miR-377 表達(dá)水平升高，miR-216a 表達(dá)降低，尿miR-377 和糖化血紅蛋白、尿白蛋白肌酐、頸動脈內(nèi)膜厚度之間呈正相關(guān)，而尿miR-216a 與這些變量呈負(fù)相關(guān)［39］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)尿外泌體let-7c-5p 與腎小球?yàn)V過率、DN 進(jìn)展有關(guān)，其可能是DN 潛在的生物標(biāo)志物［35］。KHURANA 等［40］在CKD 患者和健康對照組之間篩選出30種在尿外泌體中差異表達(dá)的miRNA，認(rèn)為let-7c-5p 可能是預(yù)測CKD 進(jìn)展的生物標(biāo)志物。

4.3 狼瘡性腎炎與尿miRNA 狼瘡性腎炎（LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）的主要并發(fā)癥和致死因素之一，腎穿刺活檢是LN 的主要診斷手段［41］。目前亟待尋找一種新的無創(chuàng)、簡便的診斷方法。TANGTANATAKUL等［42］研究發(fā)現(xiàn)，活動性LN患者尿let-7a和miR-21 明顯低于非活動期患者，在隨訪過程中還發(fā)現(xiàn)二者在疾病發(fā)作期均下調(diào)，并在整個療程后表達(dá)升高。因此，認(rèn)為let-7a和miR-21可以指導(dǎo)狼瘡性腎炎的臨床分期。

4.4 其他腎臟疾病與尿miRNA IgA 腎病是最常見導(dǎo)致終末期腎病的原發(fā)性腎小球腎炎［43］。一項(xiàng)臨床隊(duì)列研究分析了IgA 腎病患者尿外泌體miRNA 的差異，結(jié)果顯示IgA 腎病患者的miR-25 較對照組顯著增加［44］。另一項(xiàng)研究顯示，IgA 腎病患者尿miR-215-5p 和miR-378i 顯著上調(diào)，而miR-29c 和miR-205-5p 顯著下調(diào)；此外，miR-215-5p、miR-378i、miR-365b-3p 和miR-135b-5p 的表達(dá)情況與高通量測序分析結(jié)果相一致［45］。DUAN 等［46］通過miRNA 芯片技術(shù)對9 例IgA 腎病患者的214 種miRNAs 表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)尿沉渣中miR-144-3p 和miR-486-5p 呈高表達(dá)。ZHANG 等［47］報道，在對局灶節(jié)段性腎病的研究中發(fā)現(xiàn)，與腎臟疾病完全緩解組和正常對照組相比，活動性局灶節(jié)段性腎小球硬化組中尿miR-196a 顯著升高，而三組血漿miR-196a 無差異，說明尿miR-196a 可能對局灶節(jié)段性腎小球硬化活動情況有判斷意義。

5 小結(jié)與展望

自miRNA 被發(fā)現(xiàn)以來，人們對miRNA 的功能及其潛在價值的認(rèn)識呈倍數(shù)增長，與此同時隨著體液中miRNA的發(fā)現(xiàn)，尿外泌體miRNA 也成為包括急性腎損傷、糖尿病腎病在內(nèi)的腎臟疾病早期診斷的研究熱點(diǎn)。經(jīng)過不斷的努力，雖然目前國內(nèi)外對尿外泌體miRNA 作為診斷腎臟疾病新的生物標(biāo)志物進(jìn)行了有益的探索，但仍處于初級階段，仍有許多問題需要解決：（1）尿miRNA 與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究尚淺，未系統(tǒng)闡述。（2）研究缺乏疾病早期診斷和指導(dǎo)治療的生物標(biāo)志物，部分疾病無準(zhǔn)確的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)。（3）腎臟疾病存在病因多樣、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)，涉及到的尿外泌體miRNA 也依據(jù)病因或致病機(jī)制不同而有差異，無法用一種miRNA 來診斷或判斷疾病的嚴(yán)重程度，缺乏疾病診斷的特異性。（4）盡管已發(fā)現(xiàn)部分尿miRNA 可作為疾病早期診斷的潛在標(biāo)志物，但大多處于基礎(chǔ)研究階段，缺乏大樣本和多中心的驗(yàn)證。（5）現(xiàn)今分離和富集尿外泌體的技術(shù)和方法較多，但存在程序復(fù)雜、設(shè)備昂貴等問題，難以在臨床推廣應(yīng)用，使得尿miRNA 的應(yīng)用也受到限制。為此，需要進(jìn)一步系統(tǒng)研究尿外泌體miRNA與腎臟疾病的病理生理機(jī)制。